Способ определения содержания креатинфосфата и креатина в биологической ткани Советский патент 1989 года по МПК G01N33/70 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам определения концентрации креатинфосфата и креатина в тканях органов человека и животных

Цель изобретения - увеличение чувствительности и ускорение способа путем осуществления экстракции и гидролиза креатинфосфата водным раствором нею 4 с посг1едующей регистрацией креатина на флюориметре

Общее время анализа предлагаемым способом занимает около 20 мин (по прототипу 2 ч).

Способ осуществляется следующим

образомо

Замороженную ткань растирают в фарфоровой ступке с жидким азотом, навеску растертой ткани заливают

холодной () 0,5 М НСЮ (1 мл на 40 мг ткани) и гомогенизируют в течение одной MHHyfM в стеклянном гомогенизаторе Поттера Центрифугируют 10 мин при 3000 об/мино По 0,2 мл супернатанта отбирают в две пробирки. К содержимому первой пробирки добавляют 0,1 мл 2 М КОН. Вторую пробирку помещают на 2 мин в кипящую водяную баню для гидролиза креатинфосфата, после чего ее помещают на лед и к содержимому добавляют 0,1 мл 2 М КОН. На дно пробирки выпадает осадок перхлората калияс По 0,1 мл надосадка из каждой пробирки пе эеносят в про- бирку для определения концентрации креатина В пробирку с образцом добавляют 1 мл 1%-ного спиртового раствора нингидрина, тщательно переме4

QS

S;J

41

3149

шЦвают, через 1 мин добавляют 2 мл 1р%-ного КОН, через А мин после до- бавления 10%-ного КОН измеряют интенсивность флюоресценции при А„сп 495 нм при длине волны возбуждаю- miero света ез 90 нм„ Одновременно контрольный и с гандартный об- рЭзцы обрабатьшают аналогичным обра- 3JDM нингидриновым реактивом и ще- лэчьЮо Контроль 0,5 мл воды, стандарт 0,45 мл воды и 0,05 мл раствора креатина 2,5 мМолЬо Расчет содержания в ткани метоболитов осуществля е|гся по формулам:

А - к

ст - к

ст - к

X Р X С;

cS - К се

X Р X С;

ст-к

хРхС,

I « 5

0

2 М КОН Из пробирок А и Б перенесли по 0,1 мл жидкости в пробирки А и Б и добавили по 0,4 мл воды. В пробирку К (контроль.) поместили 0,5 мл воды, а в пробирку ст (стандарт) - О, 45 мл воды 0,05 мл стандартного раствора креатина, содержащего 2,5 мМоль/Ло В пробирки А и Б , ст, к добавили по 1 мл спиртового раствора нингидрина, через 1 мин туда же добавили по 2 мл 10%-ного КОН и ровно через 4 мин после добавления 10%-ного КОН измерили интенсивность флюоресценции проб на флюо- риметре БИАН-130 при 365 нм,/,д 510 нм„ Получили следующие значения интенсивности флюоресценции в относительных единицах: 1 29; I 52; I 2; 1от 5U

Содержание свободного креатина в ткани рассчитьгеали по формуле:

Изобретение относится к медицине, а именно к методам определения в биологических объектах креатина и креатинфосфата. Целью способа является сокращение время анализа и повышение чувствительности. Время анализа сокращается в 10 раз чувствительность способа 0,0014 мкМ по сравнению с 0,46 мкМ в прототипе. Способ осуществляется путем регистрации креатина до и после гидролиза креатинфосфата, причем гидролиз креатинфосфата осуществляют водным раствором HCLO₄ в течении 2 мин при 100°С, а определение креатина проводят на флуориметре при длине волны возбуждения 360-420 нм и флуоресценции 480-510 нм.

гДе К - содержание общего креати-

на в ткани, мкмоль/г; К c.g - содержание свободного креатина в ткани, мкмоль/г; КФ - содержание креатинфосфата

в ткани, в мкмоль/г; А - интенсивность флюорес-

ценции образца после гид- ; ролиза;

В - интенсивность флюоресценции образца без гидролиза; к - интенсивность флюоресценции контрольрого образца; ст - интенсивность флюоресценции стандартного образца; Р - коэффициент разведения,

равный 18,75;

С - концентрация стандарта креатина, равная 2,5 ммоль/л.

П Р им е Р 1. Навеску 100 мг икроножной мьппцы задней конеч- яости крысы поместили в жидкий азот, )|)астерли в фарфоровой ступке и зали- jiiH 2,5 мл 0,5 М Гомогенизиро- Эали в стеклянном гомогенизаторе Пот tepa 1 мин и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин при 4°С $ две пробирки (А и Б) отобрали по д,2 мл надосадочной жидкости В про- бирку А сразу добавили О,1 мл 2 М Кон. Пробирку Б поместили на 2 мин В кипящую водяную баню при 100°С,затем в воду со льдом и добавили 0,1 мл

I А - IK

18,75 X 2,5.

Получили значение 25,81 мкМ/Го Содержание креатинфосфата рассчитывали по формуле:

9

Т

ICT

. X 18,75 X 2,5. - -1- к.

-

j

5

Получили значение 22,0 мкМ/г.

Пример 2 Способ использовали дпя определения содержания креатинфосфата и креатина в икроножной мышце крыс в норме и при 30-минутной ишемии задних конечностейоИшемию вызывали наложением резинового -жгута на верхнюю треть бедра. Определение содержания креатинфосфата и креатина осуществляли аналогично примеру 1 о Результаты представлены в таблице

Характеристика способа

Способ позволяет определять содержание креатинфосфата в тканях до 0,5 мкМ/г, креатина до 0,2 мкМ/г.

Определяли содержание креатинфосфата и креатина в 10 параллельных образцах. Дпя креатинфосфата М 8,9; С 10,1; 6 0,9; для креатина ,1; ,,1.

Формула изобретения

Способ определения содержания креатинфосфата и креатина в биологической ткани, включающий экстракцию

кислотой, гидролиз креатинфосфата до креатина и регистрацию содержания креатина до и после гидролиза,- о т- личающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и ускорения способа, гидролиз креатинОпределение содержания креатинфосфата и креатина предложенным способом в нормальной и ишемизированной икроножной мышце крысы

Примечание Контроль 1; стандарт 43,

фосфата осуществляют водным раствором НС104 в течение двух минут при , а определение креатина ггрово- дят на флюориметре при длине волны возбуждения 360-420 нм и флюоресцен дни 480-510 нм.