СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОМЕТАСТАТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2008 года по МПК A61K35/48 A61P35/04 A61P37/02 

Изобретение относится к области лекарственных средств, медицины, в частности к онкологии. Эмбриональный противоопухолевый модулятор, а также способ его получения могут быть использованы в медицинской промышленности для получения высокоэффективного противометастатического средства.

Уровень техники

По сравнению с патогенными стимуляторами антимикробного, вирусного и паразитарного происхождения иммуногенность опухолеассоциированных антигенов довольно слаба. Это основное препятствие для формирования онкотоксических Т-клеток, для чего необходима связь опухолевых антигенов с главным комплексом гистосовместимости I-II класса. С целью решения этого вопроса для лечения отдельных видов злокачественных новообразований и профилактики рецидивов получен ряд вакцин.

В работе Tsang K.Y. (et. al., 1995) раскрывается способ, в котором описана иммуногенность опухолевого эмбрионального антигена (ОЭА) для людей. Он содержит ОЭА-ген рекомбинантного вируса и вызывает у людей особую Т-клеточную реакцию. Эта вакцина может использоваться только при лечении таких опухолей человека, которые вызывает этот антиген.

Известно средство, обладающее антиметастатическим действием, в виде производных пептидов (RU 97111091, 20.05.1999), однако оно достаточно сложно в изготовлении.

Временная фармакопейная статья (ВФС 013-52-98), утвержденная Агентством по лекарствам и медицинским технологиям Минздрава Республики Армения 29.05.1998 г., раскрывает эмбриональный противоопухолевый модулятор (ЭПОМ), имеющий целый ряд преимуществ.

Предлагаемое изобретение представляет собой результат продолжительных и строго контролируемых исследований, приведших к неожиданному открытию источника антиметастатических, иммуномодулирующих свойств, антивирусных и других активностей.

Сущность изобретения

Таким образом, задачей настоящего изобретения является получение средства антиметастатического действия.

Гиперфибриногенемия считается фактором риска в связи с тем, что, как было установлено исследованиями автора данной заявки, при ее наличии раковые клетки покрываются "фибриновым щитом", имитируют банальный общепатологический процесс и тем самым ускользают из-под иммунного надзора.

Достичь решения поставленной задачи позволяет использование в предлагаемом способе нового эмбрионального противоопухолевого модулятора, который содержит широкий пул нормальных фетальных протеогликанов (см. далее в разделе "Качественный и количественный состав целевого продукта (ЭПОМ)").

Предлагаемый в данном изобретении новый эмбриональный противоопухолевый модулятор Мкртчяна обладает антиметастатическим действием, интерфероногенным и иммуномодулирующим действием, а также антивирусной активностью.

Не претендуя на исчерпывающее и окончательное научное обоснование положительного влияния на организм предлагаемого модулятора, считается (на основании существующего знания в данной области), что в механизме реализации антиметастатического действия ЭПОМа ключевую роль играет специфическая сенсибилизация эффекторных клеток иммунитета по отношению к онкофетальным антигенам, в силу чего усиливается киллинг малигнизированных клеток.

Основанием для такого вывода являются полученные автором данные реакции подавления прилипания лейкоцитов (РППЛ), реакции пассивной гемаглютинации (РПГА), реакции связывания комплемента (РСК) и реакции гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ). Направленная стимуляция противоопухолевой защиты сопровождается повышением выработки γ-интерферона, IL-6 (в селезенке семикратно по отношению к контролю) и пролактина - уровень последнего в центральном органе иммуногенеза - тимусе, в 6 раз превышал исходный фон.

Подробное раскрытие изобретения

Способ получения ЭПОМа

Эмбриональные субстанции тщательно промываются в течение 4-5 часов в проточной воде и помещаются на 1,5 часа в 70° спирт (конечная концентрация). Затем ткань разрезается на кусочки, замораживается с помощью жидкого азота и гомогенизируется в специально приготовленном гомогенизаторе с большой ударной силой до порошкообразного состояния. Гомогенат разбавляется дистиллированной водой в соотношении 1:4, взбалтывается, и суспензия на 20 минут помещается в шаровую мельницу, чаши и шары которой приготовлены из метаболитически инертных материалов. Предварительно последние охлаждаются до температуры 0°С. Число оборотов доводится до 400 в минуту. Контролем качества дезинтеграции эмбриональной ткани служит цитологическое исследование по выявлению рексированных клеточных ядер (более 80%), мельчайших цитоплазматических обрывов и фрагментов волокнистых структур. В плоской стеклянной посуде гомогенат подвергается ультрафиолетовому облучению в течение 25 минут, после чего центрифугируется в рефрижераторной центрифуге РС-6 в течение 15 минут при 6000 об/мин.

В прозрачный супернатант добавляется 96° винный спирт в количестве, достаточном для доведения концентрации спирта в растворе до 84°, что обеспечивает выпадение в осадок гликопротеидов. Последние отделяются центрифугированием при 16-20 тыс. об/мин (g - 58400) в течение 20 минут в зональной роторной ультрацентрифуге типа UP-65. Осадок растворяется из объемного соотношения 1:2 в дистиллированной воде, обрабатывается в шаровой мельнице в течение 10 минут и вновь центрифугируется при 20 тыс. об/мин (ускорение - 58400) в течение 15 минут в центрифуге UP-65. В надосадочной жидкости определяется белок (42-57%), устанавливается вязкость (в разных сериях 13-18) и после проведения через стерилизирующие мембранные фильтры (миллипоры - 0,8) супернатант подвергается лиофилизации.

Пристеночная заморозка производится в специальной стерильной вращающейся камере при температуре 25-30°С. Закалка проводится в течение 24 часов в низкотемпературном шкафу. Постепенное поднятие температуры в течение 28-30 часов с -40 до +37°С осуществляет полную сублимацию.

Качественный и количественный состав целевого продукта (ЭПОМ)

Препарат содержит пул белков - гликопротеидов, извлеченных методом спиртового осаждения. Согласно результатам аналитического электрофореза в 10% полиакриламидном геле по Девису препарат содержит 5 фракций белка. В лиофилизированных сериях препарата концентрация общего белка (при определении по Лоури с последующим спектрофотометрическим анализом) колеблется в разных сериях приблизительно от 42 до 57 мас.%. Помимо белков в состав ЭПОМ входят около 1,5% свободных и около 8-10% связанных углеводов. Из ферментов присутствует аланинаминотрансфераза (АЛТ) - приблизительно 1,4 ед/л, аспартатаминотрансфераза (ACT) - приблизительно 71,9 ммоль/л, лактатдегидрогеназа (ЛДГ) - приблизительно 3,0 ед/л, щелочная фосфатаза (ЩФ) - приблизительно 24,7 ед/л, содержатся также микроэлементы: Mg - приблизительно 1,7 ммоль/л, K - приблизительно 0,96 ммоль/л, Са - приблизительно 0,65 ммоль/л, Р - приблизительно 0,52 ммоль/л (по данным биохимического анализатора Хитачи - 911, Япония).

Иммуноферментный анализ на основе моноклональных антител выявил следующие раковые эмбриональные антигены (5 мг лиофилизированного ЭПОМ растворяли в 2 мл дистиллированной воды):

РЭА - около 1,4-1,7 нг/мл

АФП - около 95,0-99,0 нг/мл

ХГ - около 2,2-5,5 мМЕ/мл

ТВГ - около 45,0-50,0 нг/мл

Са-125 - около 13,5-14,3 Е/мл

Са-19,9 - около 79,8-102,2 Е/мл

Сокращения:

ХГ - хорионический гонадотропин

РЭА - раково-эмбриональный антиген

АФП - альфа-фетопротеин

ТВГ - трофобластический β₁-гликопротеин

Са-125 - карбогидратный антиген

Са-19,9 - карбогидратный антиген

Эмбриональные антигены (ЭАГ) в составе препарата родственны многочисленным опухолевым антигенам и дают с ними перекрестные иммунные реакции. Помимо ЭАГ, наличие которых обуславливает подлинность ЭПОМ, в каждой серии препарата имеются и другие белки, с которыми связаны ее интерфероногенные, антивирусные и антимутагенные свойства. Для выявления этих белков были применены следующие биохимические методы: гельфильтрационная компьютерная хроматография, электрофорез в полиакриламидном геле, высокочувствительная жидкостная хроматография под давлением.

Гельфильтрационная компьютерная хроматография проводилась на аппарате фирмы "Фармация" (Франция) на колонках 5000 Р 7,5 мм × 30 см РВ, 005,5%. Получены три пика: наиболее значительный третий пик с мол. массой 150 кД и второй - с мол. массой 40 кД.

Электрофорез в полиакриламидном геле - обнаружено наличие в сериях препаратов 5 фракций белков с мол. массой 72, 67, 58, 50 и 40 кД. Фракция белков с мол. массой 72 кД имела электрофоретическую активность, характерную для альбумина и АФП, которые сходны по молекулярным массам и биологическим свойствам (АФП - эмбриональный альбумин).

Жидкостная хроматография под давлением. Структурный анализ пептидов, содержащихся в препарате, проведен на хроматографе Р-8000 фирмы Спектро-Физико (США). Длина волны 214 нм. Наиболее значительный и четкий пик 3-й с временем задержки 2679 м. Остальные пики менее четкие.

Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР). Учитывая важную биологическую роль свободных радикалов, образцы различных серий препарата были подвергнуты исследованию методом ЭПР на аппарате фирмы "Вариан" с чувствительностью 10¹¹-10¹² спин. Записи спектра эталона (марганцевый эталон) и 7 изучаемых образцов препарата показали, что концентрация парамагнитных частиц во всех образцах ниже чувствительности прибора, что свидетельствует об отсутствии в ЭПОМе свободных радикалов.

Наличие РЭА выявляли с помощью иммуноферментного и радиоиммунного методов. ИФА проводили с помощью имеющихся тест-наборов фирмы Роше.

Содержание трофобластического β₁-гликопротеина (ТБГ) определялось радиоиммунным методом отечественным набором.

Биологическая активность. Выявлена выраженная противоопухолевая активность препарата в эксперименте на перевиваемых опухолях (асцитная опухоль Эрлиха мышей, саркома 37 мышей, асцитная гепатома Зайделя, лимфосаркома Плисса и карциносаркома Уокера крыс).

Дополнительная характеристика целевого продукта

ЭПОМ представляет собой пористую, мягкую массу желтовато-белого цвета без запаха и вкуса.

При введении во флакон 2 мл изотонического 0,9% раствора NaCl ресуспензируется в течение около 15 минут без образования неразбивающихся хлопьев и комочков.

Инъекционный раствор представляет собой, предпочтительно, 0,02% непрозрачную гомогенную жидкость с желтоватым оттенком. Время полной деформации - около 15 минут.

Цветность раствора не превышает эталон цветности N 50 (ГФ XI, вып.1, стр.194). рН раствора: 6,5-8,5 (определен потенциометрически ГФ XI, 1, стр.113).

Остаточная влага. Определение проводили из 0,1 грамма препарата при 100°С в течение 1 часа (ГФ XI, 1). Содержание влаги не более 9%.

Растворимость. Препарат трудно растворим в воде и 0,9% изотоническом растворе NaCl; практически не растворяется в 95% спирте и эфире (ГФ XI, 1).

Подлинность. 0,003 г сухого порошка растворяют в 10 мл воды (раствор А).

К 5 мл раствора А прибавляют 3-4 капли концентрированной азотной кислоты: сразу выпадает хлопьевидный осадок (белок).

К 5 мл раствора А прибавляют 0,1 мл 0,1% раствора нингидрина и нагревают до кипения. Появляется сине-фиолетовое окрашивание (аминокислотная часть).

Испытания на токсичность. Препарат вводили животным в двух дозах, превышающих терапевтическую для человека в 200 раз (15 мг/кг) и 10 раз (0,7 мг/кг).

Согласно требованиям, предъявляемым к новым лекарственным средствам, были изучены возможная острая и хроническая токсичность ЭПОМ на различных видах экспериментальных животных: мышах, крысах, кроликах, морских свинках и собаках.

Исследование на возможную острую токсичность ЭПОМ

Исследования проведены на 38 белых беспородных мышах, 35 сингенных мышах линии СВА, а также 38 белых беспородных и 35 крысах линии Вистар. Использованы гематологические и биохимические методы, проведены морфологические исследования внутренних органов, изучено состояние сердечно-сосудистой, нервной, выделительной систем, деятельности желудочно-кишечного тракта.

Животные были распределены по 5-7 в каждой группе. ЭПОМ вводился п/к и внутрибрюшинно. Исходная масса тела у белых мышей колебалась в пределах 19,0-24,4 г, крыс линии Вистар в среднем - 140 г.

Для определения ЛД₅₀ мышам были введены максимально возможные дозы: для п/к введения - 2,5 мг белка в 0,5 мл раствора и для в/б введения - 2,5 мг белка в 0,5 мл раствора. Введение указанных максимальных доз не вызывало гибели животных в течение 2-недельного срока наблюдения.

Для выявления ЛД₅₀ ЭПОМ у крыс также были использованы максимально возможные дозы: п/к - 5,0 мг ЭПОМ в 1,0 мл раствора и в/б - 5,0 мг ЭПОМ в 1,0 мл раствора. В течение всего срока наблюдения ни разу не отмечалась гибель крыс ни в опытной, ни в контрольной группах. Ежедневное наблюдение не выявило изменений в поведении животных по сравнению с контролем. Судорог и нарушений координации движений не наблюдалось, тонус скелетных мышц был в норме. Реакции на болевые, звуковые, тактильные и световые раздражители не отличались от таковых у контрольных животных. Волосяной покров тела оставался без изменений, диспептические явления отсутствовали, потребление корма и воды было нормальным. Масса тела подопытных животных определялась 2 раза в течение срока наблюдения. В конце опыта установлено увеличение массы тела как опытных, так и контрольных мышей в пределах от 2 до 5 г и у крыс - от 20 до 23 г. Общий и биохимический анализ крови в опытной и контрольной группах не выявил отклонений.

Проведено тщательное изучение возможной хронической токсичности эмбрионального противоопухолевого модулятора на собаках.

Эксперименты были проведены на 24 беспородных половозрелых собаках (12 самцов и 12 самок) с начальной массой тела 15,2-18,1 кг согласно "Правилам доклинической оценки безвредности фармакологических средств", Москва, 1998.

После трехнедельного карантина и акклиматизации собаки получили ЭПОМ в 1 терапевтической для человека дозе (0,03 мг/кг), 10-кратной терапевтической дозе и 25-кратной дозе (0,75 мг/кг).

Изучены следующие параметры: динамика массы тела, число сердечных сокращений в минуту, частота дыхания, ЭКГ, ректальная температура, картина периферической крови, биохимические показатели сыворотки крови (глюкоза, общий белок, креатин, мочевина, холестерин, активность ЩФ, ЛДГ, АЛТ, ACT), биохимические показатели мочи (белок, глюкоза, биллирубин, мочевина, электролиты). Исследования проводились 2 раза до начала введения ЭПОМ (на 8-е и 15-е сутки после помещения собак в виварий), 3 раза в течение эксперимента (на 7-е, 15-е и 29-е сутки).

Испытания на аллергические свойства и пирогенность

Возможная аллергенность ЭПОМ изучалась на морских свинках весом 250-330 г. Их иммунизировали в/б 2,5 мг ЭПОМ в объеме 1 мл физраствора. В качестве контроля вводилась сыворотка крупного рогатого скота. Спустя 21 день животным вводили также в/б разрешающую дозу ЭПОМ, равную сенсибилизирующей (5,0 мг). Сыворотка крупного рогатого скота - 5,4 мг. Самцов было 10, самок - 8.

Введение разрешающей дозы ЭПОМ не вызвало гибели животных и симптомов анафилактического шока. Признаки слабой аллергизации выявлены лишь у 20% морских свинок. Они выражались в кратковременном почесывании мордочки, взъерошенности шерсти и единичных чиханиях.

Полученные данные позволяют оценить аллергизирующую реакцию на введение ЭПОМ как слабоположительную ("+"). В контрольной группе, получавшей сыворотку крупного рогатого скота, все животные погибли от анафилактического шока.

Для определения пирогенной реакции ЭПОМ были использованы кролики весом 1,5-2,0 кг. В течение 3-х суток до опыта проводились измерения температуры с помощью медицинского термометра.

Накануне опыта вечером у животных отобрали остатки корма и воды. Использованные шприцы и иглы, а также лекарственное вещество и растворитель (физраствор) были стерильны. ЭПОМ в количестве 5 мг растворяли в 2 мл стерильного непирогенного физраствора. За 30 минут до введения раствора измеряли температуру тела животных. Раствор подогревали до 37°С и вводили в ушную вену кроликам в течение 2 минут. После введения раствора ЭПОМ, трижды с промежутками в 1 час, измеряли температуру тела животных.

Клинические наблюдения

При традиционной форме фетальной (клеточной) терапии больным вводят взятые из эмбриональных тканей животных или человека специально обработанные живые клетки. На определенной стадии эмбриогенеза эти клетки не иммуногенны, поскольку еще не "перешли" барьер видовой специфичности. Но несмотря на это клеточная эмбриональная терапия не может считаться абсолютно безвредной формой лечения различных заболеваний. В этом отношении заслуживают внимания изолированные гуморальные компоненты клеточной терапии и, прежде всего, протеогликаны как носители эмбриональных свойств. При такой постановке вопроса особую актуальность приобретает получение белкового экстракта в состоянии, максимально близком к нативному, и, естественно, использование таких приемов, которые полностью исключают контаминирование вирусных и иных патогенных агентов.

Более 5 лет наблюдаются пациенты из групп высокого онкологического риска, получавших эмбриональный противоопухолевый модулятор с целью предотвращения возможной неопластической патологии.

На месте подкожной инъекции (внутренняя поверхность предплечья вдали от контуров сосудов) в течение первых 2-х суток возникают гиперемия и инфильтрация, которые через 48 часов бесследно проходят. Размеры указанной местной реакции - в среднем 4,5×6 см. Лишь в единичных случаях имело место повышение температуры тела в пределах субфебрильной (у 2 из 100 пациентов). Отсутствие местной реакции настораживает в плане предрасположенности к онкопатологии, а именно толерантности иммунной системы данного индивидуума к онкофетальным антигенам - онкомаркерам.

ЭПОМ зарекомендовал себя и как средство противометастатической иммунотерапии, особенно в тех случаях, когда онкобольные после радикальной операции по тем или иным причинам отказываются от дальнейшего химиолучевого лечения. Это обстоятельство имеет чрезвычайно важное значение, поскольку в отличие от химиопрепаратов, ЭПОМ не вызывает иммуносупрессии, а наоборот, повышает как специфическую, так и неспецифическую противоопухолевую защиту.

В разных сериях индуцированного (7,12 - ДМБА и бенз(а)пирена) канцерогенеза и в опытах на моделях перевиваемых опухолей различного гистогенеза ЭПОМ полностью предотвращал возникновение метастазов в 40-70%.

Отмечены достоверное повышение после введения ЭПОМ количества Т-клеток и тенденция к увеличению ЕКК, при этом существенно не влияло на относительный и абсолютный показатели В-клеток. Онкофетальные антигены обладают иммуносупрессивным воздействием. Данные свидетельствуют о том, что полученный нами пул эмбриональных протеогликанов не оказал супрессивного воздействия на субпопуляции лимфоцитов.

Данные применения ЭПОМ и способа профилактики в условиях клиники

Способ осуществляется следующим образом. Формируют группу, при этом учитывают возраст индивидуума, профессию, предопухолевое заболевание, курение, семейную предрасположенность, гиперфибриногенемию, количество онкомаркеров в периферической крови.

С учетом названных показателей проводят введение индивидууму ЭПОМ из расчета от 0,02 до 0,04 мг/кг веса, наиболее предпочтительно 0,03 мг/кг веса.

В процессе 17-летнего экспериментального изучения противоопухолевой активности и безвредности ЭПОМа на моделях индуцированного 7,12 - ДМБА и бенз(а)пиреном канцерогенеза, а также на гистогенетически различных перевиваемых опухолях (асцитная опухоль Эрлиха, саркома - 37, саркома -180, асцитная гепатома Зайделя, карциносаркома Уокера, лимфосаркома Плисса) было продемонстрировано, что ЭПОМ в 40-70% случаев полностью предотвращает возникновение злокачественных новообразований.

ЭПОМ показан для противометастатической иммунотерапии. У наблюдаемых больных биологически активная доза не влияла на популяции Т-хелперов и Т-супрессоров. Даже в случае десятикратного превышения дозы наблюдался рост количества Т-супрессоров на фоне неизмененного количества Т-хелперов.

Пример 1

Мальчик 9 лет со злокачественной лимфомой, получивший до вакцинации 5 курсов химиотерапии. К моменту первой инъекции ЭПОМ изменения лимфатических узлов шеи и подмышечной области прогрессировали, имелась аллопеция, интоксикация, резкое похудание. В течение 6 лет трижды проведена ревакцинация. Через 8 лет мальчик без признаков болезни, учится в школе. Аналогичных наблюдений - 3. Изложенное дает основание считать, что вакцинотерапия ЭПОМ дополняет химиотерапию больных со злокачественными опухолями лимфатической системы. Противорецидивный и противометастатический эффект после хирургического или химиолучевого лечения установлен и при других нозологических формах злокачественных опухолей.

Изобретение относится к области лекарственных средств, медицины, в частности к онкологии. Заявлено применение эмбрионального противоопухолевого модулятора (ЭПОМ) в качестве средства, обладающего противометастатическим действием. ЭПОМ получают из эмбриональных субстанций путем криодеструкции, экстракции и осаждения в спиртах возрастающей концентрации и содержит протеогликановый комплекс гиалуроновой кислоты, опухолевоассоциированные антигены нормального эмбриогенеза. Заявленное изобретение обеспечивает противометастатическое действие.

Применение эмбрионального противоопухолевого модулятора (ЭПОМ) в качестве средства, обладающего противометастатическим действием.