АНТИМЕТАСТАТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2018 года по МПК A61K36/73 A61K127/00 B01D11/02 A61P35/00 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и может быть использовано для подавления процесса метастазирования и повышения антиметастатической активности цитостатических препаратов при лечении онкологических пациентов.

Метастазирование является основной причиной смерти онкологических больных. Эффективно действующие на метастатические клетки опухоли лекарственные средства отсутствуют. В основном при генерализованном опухолевом процессе применяется химиотерапия, возможности которой ограничены наличием у цитостатических средств большого количества побочных эффектов. Актуальным является поиск препаратов, ингибирующих процесс диссеминации и повышающих антиметастатическое действие цитостатиков.

Известно противометастатическое средство, содержащее вытяжку из надземной части (травы) аконита байкальского (Aconitum baikalense Steinb.), содержит алкалоиды, в связи с чем его применение может сопровождаться токсическими эффектами [3].

Известно средство из плодов Sorbus aucuparia L., обладающее противоопухолевой активностью и повышающее антиметастатическое действие циклофосфана [4].

Наиболее близким по фармакологическим эффектам к заявляемому средству является экстракт родиолы розовой жидкий [1]. Однако экстракт родиолы противопоказан больным с таким сопутствующим заболеванием, как гипертоническая болезнь [2].

Новый технический результат - расширение арсенала средств растительного происхождения, обладающих более выраженным ингибирующим действием на развитие метастазов и повышающих антиметастатическое действие цитостатиков.

Для достижения нового технического результата применяют жидкий экстракт листьев рябины обыкновенной (Sorbus aucuparia L.), полученный экстрагированием листьев рябины, измельченных до размера частиц диаметром 0,3-0,5 см, 40% этиловым спиртом при температуре 75°С в течение 60 минут, в качестве антиметастатического и повышающего противометастатическое действие циклофосфана средства.

Жидкий экстракт листьев рябины обыкновенной (Sorbus aucuparia L.) получают методом динамической дробной мацерации.

Для получения экстракта используют лабораторный реактор с паровой рубашкой («Radleys», Германия), подключенный к погруженному циркуляционному блоку регулирования температуры «MO1» («Термэкс», Россия), верхнеприводной мешалке RZR 2020 («Heidolph», Германия) и шариковому холодильнику. Листья рябины измельчают до размера частиц диаметром 0,3-0,5 см. Навеску листьев помещают в реактор, добавляют 40%-ный спирт этиловый. Экстрагируют при температуре 75°С в течение 60 минут. Полученным извлечением экстрагируют и новую порцию сырья.

Готовый экстракт отстаивают при температуре не выше +10°С не менее 2 суток до получения прозрачной жидкости, затем фильтруют и хранят при температуре не выше +5°С, в защищенном от света месте.

Стандартизацию готового экстракта проводят по органолептическим показателям (цвет, запах, вкус), сухому остатку и содержанию действующих веществ [5]. Экстракт на 40%-ном спирте этиловом представляет собой буро-зеленую жидкость, со специфическим запахом кисловато-горького вкуса.

Сухой остаток жидкого экстракта листьев рябины обыкновенной определяли с помощью весового влагомера MS-70 («AND», Япония). Сухой остаток исследуемого экстракта составляет 0,04418±0,0015 г/мл.

Для стандартизации жидкого экстракта по содержанию действующих веществ использовали принцип сквозной стандартизации: лекарственное растительное сырье - субстанция - лекарственная форма. Результаты собственного химического анализа листьев рябины обыкновенной показали, что основным действующим веществом сырья является сумма фенолокислот, флавоноидов, в том числе антоцианов. Поэтому, учитывая результаты химического анализа, экстракт стандартизовали по содержанию данных групп веществ.

Для определения суммы фенолокислот и антоцианов в экстракте использовали разработанные нами методы прямой спектрофотометрии [6, 7, 8]. Для определения суммы флавоноидов использовали метод дифференциальной спектрофотометрии [5]. Установлено: содержание суммы фенолокислот в 40%-ном экстракте листьев рябины обыкновенной, в пересчете на хлорогеновую кислоту, составляет 17,86±0,12%; суммы флавоноидов в пересчете на рутин -3,70±0,11%, суммы антоцианов, в пересчете на цианид-3-о-глюкозид - 5,94±0,04%.

Новым в предлагаемом изобретении является свойство жидкого спиртового экстракта листьев рябины обыкновенной (Sorbus aucuparia L.) проявлять антиметастатическую активность и повышать противометастатическое действие циклофосфана.

Новое свойство явным образом не вытекает из уровня техники в данной области, не очевидно для специалиста и не обнаружено в патентной и научно-медицинской литературе. Предлагаемое в качестве изобретения средство может быть использовано в клинической онкологии.

Предлагаемое изобретение соответствует условиям патентоспособности «Новизна», «Изобретательский уровень» и «Промышленная применимость».

Данное средство прошло экспериментальное исследование на кафедре фармакогнозии с курсами ботаника и экологии ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России и в лаборатории онкофармакологии НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ.

Для выявления фармакологического действия жидкого спиртового экстракта листьев рябины обыкновенной были проведены эксперименты на мышах-самках линии C57BL/6 с карциномой легких Льюис и раком легкого-67.

При проведении экспериментов животные были распределены на группы:

1. Контроль - животные с опухолью, которым зондом в желудок вводили по 0,2 мл дистиллированной воды в течение 10-11 сут, начиная с 7 сут после перевивки. На 11-12 сут после перевивки опухоли животным однократно внутрибрюшинно вводили по 0,1 мл физиологического раствора.

2. Циклофосфан - животные с опухолью, которым зондом в желудок вводили по 0,2 мл дистиллированной воды в течение 10-11 сут, начиная с 7 сут после перевивки. На 11-12 сут после перевивки опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно ЦФ в дозе 125 мг/кг в 0,1 мл воды для инъекций.

3. Экстракт листьев рябины обыкновенной (1 мл/кг) - животные с опухолью, которым вводили зондом в желудок экстракт листьев рябины обыкновенной в дозе 1 мл/кг в течение 10-11 сут, начиная с 7 сут после перевивки опухоли. На 11-12 сут после перевивки опухоли животным однократно внутрибрюшинно вводили по 0,1 мл физиологического раствора.

4. ЦФ + экстракт листьев рябины обыкновенной (1 мл/кг) - животные с опухолью, которым вводили зондом в желудок экстракт листьев рябины обыкновенной в дозе 1 мл/кг в течение 10-11 сут, начиная с 7 сут после перевивки. На 11-12 сут после перевивки опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно ЦФ в дозе 125 мг/кг в 0,1 мл воды для инъекций.

5. Экстракт листьев рябины обыкновенной (5 мл/кг) - животные с опухолью, которым вводили зондом в желудок экстракт листьев рябины обыкновенной в дозе 5 мл/кг в течение 10-11 сут, начиная с 7 сут после перевивки опухоли.

На 11-12 сут после перевивки опухоли животным однократно внутрибрюшинно вводили по 0,1 мл физиологического раствора.

6. ЦФ + экстракт листьев рябины обыкновенной (5 мл/кг) - животные с опухолью, которым вводили зондом в желудок экстракт листьев рябины обыкновенной в дозе 5 мл/кг в течение 10-11 сут, начиная с 7 сут после перевивки. На 11-12 сут после перевивки опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно ЦФ в дозе 125 мг/кг в 0,1 мл воды для инъекций.

По окончании экспериментов (на 21 сут) животных умерщвляли, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденные Министерством здравоохранения РФ. Проводили вскрытие животных, ревизию внутренних органов, выделение опухоли, подсчет метастазов. Эффективность проведенных курсов лечения оценивали по противоопухолевому и противометастатическому действию препаратов, определяя массу опухоли, процент торможения ее роста, частоту метастазирования, количество и площадь метастазов в легких, индекс ингибирования метастазирования (%) [9, 10].

Обработку полученных результатов проводили с использованием непараметрических критериев Вилкоксона-Манна-Уитни (u) и углового преобразования Фишера (ϕ). Различия считали достоверными при Р<0,05 [11].

Пример 1.

В эксперименте на мышах-самках линии C57BL/6 с карциномой легких Льюис обнаружено, что у мышей, получавших экстракт листьев рябины обыкновенной в дозе 1 мл/кг, уменьшение количества метастазов (в 1,3 раза) и их площади (в 3,0 раза) носило характер тенденции, тогда как у животных, которым вводили экстракт листьев рябины обыкновенной в дозе 5 мл/кг, количество метастазов в легких оказалось достоверно меньше (в 2,3 раза, Р<0,01), площадь метастазов снизилась в 6,8 раза (Р<0,01), частота метастазирования составила 75% против 100% в контроле, высоким оказался и индекс ингибирования метастазирования (68%) (таблица).

При комбинированном использовании циклофосфана и экстракта листьев рябины в дозе 5 мл/кг достоверно меньше оказались все показатели процесса диссеминации: частота метастазирования составила 63% против 100%, количество метастазов снизилось в 7,4 раза, их площадь оказалась в 12,7 раза меньше этих показателей у получавших только цитостатик животных, индекс ингибирования метастазирования составил 95%. Если же совместно с циклофосфаном вводили экстракт листьев рябины в дозе 1 мл/кг, метастазы в легких мышей полностью отсутствовали (таблица).

Пример 2.

В эксперименте на мышах-самках линии C57BL/6 с раком легкого-67 выявлено ингибирующее влияние экстракта листьев рябины, вводимого в дозах 1 и 5 мл/кг, на процесс диссеминации: количество метастазов в легких уменьшилось в 1,4 и 1,9 раза (Р<0,05), а их площадь - в 2,7 и 4,4 раза (Р<0,05) относительно этих данных у контрольных мышей, ИИМ составил 31% и 53% (таблица).

При добавлении в схему химиотерапии экстракта листьев рябины обыкновенной в обеих изучаемых дозах достоверно меньше оказались все показатели процесса метастазирования. Так, единичные метастазы в легких отмечены у 20% и 10% мышей, получавших циклофосфан совместно с экстрактом в дозах 1 и 5 мл/кг, ИИМ составил 99% (таблица).

Таким образом, в экспериментах на мышах с карциномой легких Льюис и раком легкого-67 выявлено антиметастатическое действие экстракта листьев рябины обыкновенной, а также его способность проявлять антиметастатическую активность и повышать противометастатическую активность циклофосфана.

Список источников информации, принятых во внимание при составлении описания:

1. Пат. 2023446 Российская Федерация, МПК А61К 35/78. Антиметастатическое средство/ Ярёменко К.В., Дементьева Л.А., Саратиков А.С.: заявитель и патентообладатель: Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра РАМН (RU). - №4082815/14; заявл. 13.05.1993; опубл. 30.11.1994.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М., 2014. - С. 130.

3. Пат. 2189832 Российская Федерация, МПК А61К 35/78. Средство, обладающее противометастатической активностью/ Пашинский В.Г., Семенов В.Г., Семенов А.А., Поветьева Т.Н., Погодаева Н.Н., Жапова Цымжит: заявитель и патентообладатель: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра СО РАМН (RU), №2001121507/14; заявл. 31.07.2001; опубл. 27.09.2002.

4. Пат. 2578457 Российская Федерация, МПК A61K 36/73, А61Р 35/00. Средство, обладающее противоопухолевой и антиметастатической активностью, повышающее противометастатическое действие циклофосфана / Разина Т.Г., Зуева Е.П., Калинкина Г.И., Исайкина Н.В., Андреева В.Ю., Рыбалкина О.Ю., Крылова С.Г., Амосова Е.Н., Лопатина К.А., Сафонова Е.А., Галиулина А.В.: заявитель и патентообладатель: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга" (RU). - №2015103700/15, заявл. 04.02.2015; опубл. 27.03.2016.

5. Государственная фармакопея СССР. Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. - 11-е изд., доп. М., 1989. - С. 160-161.

Примечание: в таблице перед уровнем значимости Р указаны номера сравниваемых групп

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к антиметастатическому средству. Применение жидкого экстракта рябины обыкновенной (Sorbus aucuparia L.), полученного экстрагированием листьев рябины, измельченных до размера частиц диаметром 0,3-0,5 см, 40% этиловым спиртом при температуре 75°С в течение 60 минут, в качестве антиметастатического и повышающего противометастатическое действие циклофосфана средства. Вышеописанное средство расширяет арсенал средств растительного происхождения, обладающих более выраженным ингибирующим действием на развитие метастазов и повышающих антиметастатическое действие цитостатиков. 1 табл., 2 пр.

Применение жидкого экстракта рябины обыкновенной (Sorbus aucuparia L.), полученного экстрагированием листьев рябины, измельченных до размера частиц диаметром 0,3-0,5 см, 40%-ным этиловым спиртом при температуре 75°C в течение 60 минут, в качестве антиметастатического и повышающего противометастатическое действие циклофосфана средства.