СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ НЕВЫНАШИВАНИЯ В ПЕРВОМ ТРИМЕСТРЕ БЕРЕМЕННОСТИ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и может быть использовано для прогнозирования невынашивания беременности в первом триместре беременности.

Невынашивание беременности (НБ) до настоящего времени остается одной из наиболее сложных и социально значимых проблем в современном акушерстве. Удельный вес этой патологии стабильно высокий и составляет, по данным ВОЗ, 15-20% от исходов всех беременностей, причем в большинстве случаев в раннем эмбриональном периоде. Если принять общее число пренатальных потерь за 100%, то в первые 8-12 нед. внутриутробного развития погибают от 45 до 85% зародышей, гибель бластоцист до имплантации или вскоре после нее составляет 30-40%. Несмотря на многочисленные исследования в этой области в 25-57% случаев генез невынашивания остается невыясненным (Краснопольский В.И., и др. 2006).

Невынашивание является полиэтиологичным осложнением беременности. Многочисленные исследования в этой области демонстрируют эволюционную смену доминирующих факторов в генезе НБ. Установленная роль факторов роста в процессах репродукции позволяет представить развитие системы плацента-плод как серию скоординированных реакций клеток различных типов, регулируемых локальными медиаторами - цитокинами (Орлов А.В., Круриер И.И, Друккер НА., Каушанская Л.Н., 2005).

Поэтому исследования в этой области представляют, прежде всего, практический интерес с целью ранней доклинической диагностики и профилактики осложнений в первом триместре беременности.

На сегодняшний день ранней диагностике и прогнозированию невынашивания беременности посвящено значительное количество работ. При этом просматриваются два основных направления разрабатываемых методик: биохимические и иммунологические, с одной стороны, и инструментальные - с другой. К инструментальным в основном относятся методы УЗИ.

Из первой группы методов известен способ прогнозирования угрозы прерывания беременности в ранние сроки путем определения в периферической крови концентрации фактора, угнетающего миграцию лейкоцитов до и после однократной иммунизации донорскими лейкоцитами (патент РФ №2014598, 1994).

Недостатками способа являются техническая сложность выполнения, а также невозможность динамического наблюдения за состоянием беременности с помощью этого метода.

Известен способ ранней диагностики невынашивания беременности путем определения в периферической крови относительного содержания нейтрофилов, имеющих на своей поверхности структуры, реагирующие с трофобластическим Х-гликопротеидом (патент РФ №2077729, 1997). К недостаткам метода относятся его трудоемкость и неспецифичность.

Известен способ прогнозирования угрозы невынашивания беременности путем определения содержания периферических Т-лимфоцитов до и после инкубации с АМГФ (патент №2077727, 1997).

Известен способ доклинического прогнозирования невынашивания беременности путем определения в плазме крови содержания фибринмономерных комплексов. По их величине прогнозируют прерывание беременности в I, II или III триместрах (патент РФ №2123698, 1998). К недостаткам метода относится его неспецифичность.

Известен способ прогнозирования угрозы прерывания беременности по определению концентрации эстриола, плацентарного лактогена и интерлейкина (ИЛ)-6 в сыворотке крови (патент РФ №2285926, 2006). Данный способ принят нами за прототип.

Недостатком данных способов является их трудоемкость.

Известен способ прогнозирования невынашивания беременности путем ультразвукового исследования органов малого таза и определения в сыворотке крови прогестерона, хорионического гонадотропина и уровня альфа-2-микроглобулина в сыворотке крови (заявка РФ №2004135161, 2006). Недостатком данного способа является его трудоемкость и неспецифичность.

Известен способ прогноза невынашивания беременности путем определения содержания цитокинов в периферической крови и слизи цервикального канала у женщин с невынашиванием беременности инфекционного генеза по уровню ИФН-γ и ИЛ-8 в периферической крови и слизи цервикального канала, повышение которых служит маркерами неблагополучия на ранних этапах беременности (Т.Н.Сумеди, Л.В.Ганковская, Е.Н.Долгина и др. Содержание цитокинов в периферической крови и слизи цервикального канала у женщин с невынашиванием беременности инфекционного генеза // Российский журнал иммунологии, 2005 г. - т.9. - N2. - стр.93-102). Недостатком данного способа является то, что он не позволяет провести диагностику угрозы прерывания беременности во 2 триместре.

Из вышеизложенного очевидно, что на сегодняшний день основными недостатками способов прогнозирования невынашивания беременности являются неспецифичность и трудоемкость.

Задача заявляемого изобретения: разработка специфичного способа прогнозирования невынашивания в первом триместре беременности с целью назначения своевременных и адекватных лечебных мероприятий.

Для решения поставленной задачи в сыворотке крови определяют методом ИФА уровни субстанции P(SP) и фактора некроза опухоли-α (FNO), значения которых подставляют в формулу и рассчитывают прогностический коэффициент К:

K=(0,006*FNO*SP-0,065*FNO*SP²-0,00004*FNO)/(0,005-0,031*FNO),

где SP - уровень субстанции Р в абсолютных величинах,

FNO - уровень фактора некроза опухоли-α в в абсолютных величинах,

если значение прогностического коэффициента К больше, чем 0,48, то у данной беременной прогнозируют угрозу прерывания беременности.

Если значение прогностического коэффициента К меньше, чем 0,48, то данную пациентку можно отнести в группу с физиологическим течением беременности.

Чувствительность метода равна 100%

Специфичность метода составляет 94,2%.

Точность равна 97,1%.

Достоверность - (р<0,001).

Новый технический результат состоит в том, что данный способ обладает высокой точностью, чувствительностью и специфичностью. Предложенный метод исследования позволяет с высокой точностью (97,1%) прогнозировать течение первого триместра беременности, т.е. с первых недель и до 12 нед. гестации.

Таким образом, патогенетически обоснованный прогноз невынашивания беременности еще на доклинической стадии позволит:

- своевременно выявить группу беременных, угрожающих по развитию данной патологии;

- провести раннее профилактическое лечение, которое существенно снизит частоту невынашивания беременности;

- благоприятно отразиться на течении беременности за счет снижения возможности формирования первичной плацентарной недостаточности;

- улучшить показатели перинатальной заболеваемости и смертности в условиях обострившейся демографической ситуации.

Установлено, что иммунные механизмы активируют клеточные и биохимические реакции, запускающие целый каскад патофизиологических процессов, приводящих к отторжению плода. Так, касаясь проблемы спонтанных повторных абортов, на сегодняшний день можно с уверенностью говорить о том, что потеря плода в ранние сроки беременности имеет преимущественно иммунную этиологию (Ширшев С.В. 1999, Айламазян Э.К., Павлов О.В., Сельков С.А, 2004). Одной из основных причин репродуктивных потерь являются нарушения иммунных механизмов, как на локальном, так и на системном уровнях, обеспечивающих нормальное оплодотворение яйцеклетки, имплантацию, инвазию трофобласта и дальнейшее прогрессирование беременности (Кирющенков П.А., Ходжаева З.С., Верясов В.Н, 2003). Несомненным является тот факт, что нервная система оказывает важное регуляторное влияние на органы иммунной системы. Физиологическая нейрорегуляция иммунного ответа необходима для его полноценного развития (Сотникова Н.Ю., Громова О.А., Новикова Е.А., 2004).

Субстанция Р - нейропептид, присутствует в немиелинизированных волокнах С-типа и маленьких миелинизированных А-дельта-типа и синтезируется клетками дорзальных рогов ганглиев, а затем транспортируется вдоль аксонов в нервные окончания, где они накапливаются в плотных везикулах. Как провоспалительный агент SP стимулирует Т-клеточную пролиферацию (Payany et al.,1985), увеличение синтеза иммуноглобулинов, вызывает хемотаксис моноцитов, нейтрофилов, фибробластов, индуцирует дегрануляцию мастоцитов и высвобождение гистамина, стимулирует фагоцитоз в макрофагах, секрецию интерлейкинов (IL-1, 6, фактора некроза опухоли-α) моноцитами (Goode et al., 1998).

Таким образом, этот нейропептид действует не только как трансмиттеры для импульсов, направленных в ЦНС, но также служит локальным «контролером» микроокружения благодаря действию на эндотелиальные клетки, макрофаги, лимфоциты, синовиоциты, тучные клетки (Geppetti P.A., Holzer P., 1996; McDonald D.M. et al., 1996).

С точки зрения физиологической беременности неоправданным является деление цитокинов на "вредные" и "полезные". Оказалось, что повышение продукции некоторых цитокинов (в том числе и так называемых вредных) тканью плаценты сопровождает не только патологические процессы, такие как выкидыш и преждевременные роды, но и является характерным признаком нормальных своевременных родов. В экспериментах на грызунах убедительно доказано абортогенное действие субстанции Р за счет увеличения продукции фактора некроза опухоли-α, интерлейкина-1 макрофагами и снижения содержания трансформирующего фактора роста - β2, обладающего иммуносупрессивными свойствами (Arck P.C., 1997; Markert U.R., 1997), т.о. субстанция Р нарушает "цитокиновый баланс" в матке, существующий во время беременности. Нарушение этого равновесия в результате действия экзогенных или эндогенных факторов может привести к осложнениям беременности, крайним проявлением которых является спонтанное преждевременное ее прерывание (Павлов О.В., Сельков С.А., Лалаян Д.В., Аржанова О.Н., 2003).

С целью изучения компонентов нейрогенного воспаления при угрозе невынашивания беременности в первом триместре нами были исследованы субстанция Р и фактор некроза опухоли-α в сыворотке крови 51 женщин в сроке от 6 до 12 недель беременности с верифицированным диагнозом угрожающего самоаборта, находившихся на стационарном лечении в отделении патологии беременности, составивших основную группу.

Группу контроля составили 28 женщин с физиологическим течением беременности в те же гестационные сроки по данным ретроспективного анализа их наблюдения в рамках программы "Акушерский мониторинг", осуществляющей поликлинический этап ведения беременных. У всех женщин получено информированное согласие, помимо этого одобрение на проведение исследований было получено от локального этического комитета Ростовского НИИ акушерства и педиатрии. Всем пациенткам проведено клинико-лабораторное обследование, включающее динамическое клиническое, гормональное, биохимическое, генетическое, ультразвуковое и допплерометрическое исследование, а также определено содержание в сыворотке крови субстанции Р, фактора некроза опухоли-α. В основной клинической группе проводилось двукратное иммунологическое обследование, соответственно до и после курса стандартной терапии, направленной на пролонгирование беременности.

Полученные нами результаты позволяют по-новому взглянуть на процессы межклеточных взаимодействий, существующие в ранние сроки беременности.

Исследование фактора некроза опухоли-α (FNO-α) в обеих клинических группах выявило статистически значимые различия концентрации этого показателя. В контрольной группе он был почти в 3 раза выше, чем в основной и составил 17,34 (9,59-29,2) пг/мл и 6,03 (2,33-15,53) пг/мл соответственно (р<0,001), кроме того, после курса сохраняющей терапии отмечена тенденция к его увеличению до 9,06 (4,1-13,62) пг/мл.

Исследование субстанции Р при физиологической гестации показало низкий уровень ее содержания, равный 0,19 (1,11-0,24) нг/мл. В сыворотке крови беременных с угрозой невынашивания этот показатель возрастал практически в 1,7 раза и составил 0,32 (0.22-0.4) нг/мл (р<0,001), и несколько увеличивался несмотря на проводимую терапию. При повторном обследовании концентрация субстанции Р была сравнима с первичным обследованием 0,33 (0,24-0,47) нг/мл и достоверно отличалась от контроля (р<0,001).

Таким образом, на основании собственных исследований мы можем утверждать, что угроза прерывания беременности в первом триместре может развиваться при повышенном содержании субстанции Р в сыворотке крови. Разработанный нами метод позволяет в первом триместре беременности определять только 2 показателя, а именно уровни субстанции Р и FNO-α, что является достаточным для расчета диагностического критерия.

Субстанция Р является важным модулятором воспаления, т.к. индуцирует синтез «провоспалительных» медиаторов (интерлейкина 1, 6, фактора некроза опухоли и др.) макрофагами и активирует фагоцитоз, в то же время снижает содержание иммуносупрессивных факторов. В первом триместре беременности особенно велико влияние FNO-α в регуляции процессов апоптоза на самых ранних этапах беременности (S.L. Staszewski-Chavez et al., 2005). Поскольку плацента является развивающимся органом, ее ткани подвергаются постоянному обновлению (I.M.Mayhew, 2001). Апоптические клетки идентифицированы как в материнских, так и в плодовых компонентах плаценты на разных этапах физиологического течения беременности, что может быть связано с адгезией яйцеклетки и инвазией трофобласта (A. Galan et al.. 2000); трансформацией спиральных артерий (S.V. Ashton et al.., 2005), дифференцировкой трофобласта (G.Ivioretal., 2002).

Способ осуществляют следующим образом.

У беременной женщины утром натощак из локтевой вены забирают кровь (желательно самотеком в пластиковую или силиконированную пробирку), затем стандартным методом получают сыворотку крови. Определяют методом ИФА субстанции Р, FNO-α и рассчитывают прогностический коэффициент К по формуле:

K=(0,006*FNO*SP-0,065*FNO*SP²-0,00004*FNO)/(0,005-0,031*FNO),

где SP - уровень субстанции Р в абсолютных величинах,

FNO - уровень фактора некроза опухоли-α в абсолютных величинах,

если значение прогностического коэффициента К больше, чем 0,48, то у данной беременной прогнозируют угрозу прерывания беременности.

Если значение прогностического коэффициента К меньше, чем 0,48, то данную пациентку можно отнести в группу с физиологическим течением беременности.

Уровень FNO-α в сыворотке крови определяют методом иммуноферментного анализа наборами фирмы BIOSOURCE (USA).

Промывочный буфер, растворы стандартов, стрептавидин-пероксидазного конъюгата готовят согласно инструкции к набору. Во все лунки планшета, покрытые поликлональными антителами к FNO-α человека, вносят по 50 мкл инкубационного буфера. В лунку-бланк вносят 100 мкл раствора для разведения стандартов, в лунки для построения стандартной кривой вносили по 100 мкл приготовленных стандартных проб, в остальные лунки - по 100 мкл исследуемых проб. Накрывают планшет пленкой и инкубируют 2 часа при комнатной температуре.

По окончании инкубации промывают лунки планшета промывочным буфером 4 раза на промывочном устройстве для микропланшетов ELISA WASHER HUMAN (USA).

Затем во все лунки вносят по 100 мкл раствора биотинилированных антител к FNO-α человека. Инкубируют планшет при комнатной температуре в течение 1 часа. Промывают планшет 4 раза промывочным буфером, как описано выше. Во все лунки вносят по 100 мкл раствора стрептавидин-пероксидазного конъюгата и инкубируют планшет 30 минут при комнатной температуре. Затем проводят промывку по вышеописанной методике.

Во все лунки вносят по 100 мкл раствора субстрата и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут. Останавливают цветную реакцию добавлением 100 мкл стоп-реагента в каждую лунку. Измерение оптической плотности при 450 нм и обсчет результатов проводят на фотометре MULTILABEL COUNTER 1420 (Дания).

В компьютерное обеспечение прибора вводят численные значения концентраций FNO-α в стандартных растворах и получают после измерения концентрацию FNO-α в опытных пробах в пг/мл. Для вычисления прогностического коэффициента используют значение FNO-α в абсолютных величинах.

Уровень субстанции Р в сыворотке крови пациентов определяют методом иммуноферментного анализа наборами фирмы ВАСНЕМ GROUP (USA).

Приготовление растворов стандартов, конъюгатов, промывочного и рабочего буфера проводят согласно инструкции к набору.

Во все лунки планшета вносят по 25 мкл первичной антисыворотки и инкубируют планшет в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем в соответствующие лунки планшета вносят по 50 мкл растворов стандартов или исследуемых проб, инкубируют 2 часа при комнатной температуре. Во все лунки планшета вносят по 25 мкл раствора биотинилированного конъюгата, накрывают планшет пленкой и оставляют на ночь при температуре 2-8 С. По окончании инкубации 5 раз промывают лунки планшета промывочным буфером на промывочном устройстве для микропланшетов ELISA WASHER HUMAN (USA). Во все лунки планшета вносят по 100 мкл раствора стрептавидин-пероксидазного конъюгата и инкубируют планшет в течение 1 часа при комнатной температуре. Промывают планшет, как описано выше.

Во все лунки планшета вносят по 100 мкл раствора ТМБ, инкубируют в темноте в течение 15 минут, останавливают цветную реакцию добавлением в каждую лунку 100 мкл раствора 2N HCl.

Измерение оптической плотности при 450 нм и обсчет результатов проводят на фотометре MULTILABEL COUNTER 1420 (Дания).

В компьютерное обеспечение прибора вводят численные значения концентраций субстанции Р в стандартных растворах и получают после измерения концентрацию субстанции Р в опытных пробах в нг/мл. Для вычисления прогностического коэффициента используют значение субстанции Р в абсолютных величинах.

Работоспособность и промышленная применимость заявляемого метода подтверждается следующими клиническими примерами.

Пример 1. Беременная М-а Е.В., 28 лет. В анамнезе 2 нормальных срочных родов. На очередном приеме в женской консультации жалоб не предъявляет. Диагноз: беременность 6-7 недель.

По УЗИ: в матке лоцируется одно плодное яйцо, соответствующее 6-7 неделям беременности. Придатки без особенностей. Признаков угрозы невынашивания беременности нет.

При влагалищном исследовании: шейка матки отклонена кзади, влагалищная часть шейка матки длиной 2,5-3 см, плотная, наружный зев закрыт. Матка увеличена соответственно сроку гестации, вне тонуса. Придатки с обеих сторон без особенностей.

Таким образом, клинических симптомов угрожающего самопроизвольного аборта не выявлено.

С целью выбора дальнейшей тактики ведения беременной проведено исследование уровня субстанции Р, составивший 0,291 нг/мл, и FNO-α, равный 5,33 пг/мл, эти значения в абсолютных величинах подставляют в приведенную формулу и проводят расчет прогностического коэффициента К. Расчетная величина К равна 1,01368, (т.е. больше, чем 0,48), что позволяет отнести беременную в группу риска по невынашиванию. Принимая во внимание отсутствие отягощенного акушерско-гинекологического анамнеза, хорошее самочувствие, беременная от курса сохраняющей терапии отказалась. Через неделю больная поступает в гинекологическое отделение с жалобами на боли внизу живота, кровянистые выделения. Диагноз: Беременность 7-8 недель. Угрожающий самоаборт. По УЗИ: по гестации 7 нед. 4 дн. плодное яйцо - 31 мм соответствует 8 нед. 1 дн., КТР-13 мм-7 нед. 4 дн., сердцебиение ритмичное. Хорион по передней стенке матки. В нижнем полюсе плодного яйца визуализируется щелевидное эхо-негативное образование 12*3 мм - участок отслойки. Заключение: Беременность 7-8 нед. УЗ: признаки угрозы прерывания беременности. В зеркалах: шейка матки не изменена. Влагалищное исследование матки не проводилось в связи с явлениями угрозы прерывания беременности. Больной проведена терапия в условиях стационара, направленная на пролонгирование беременности. Беременность сохранена.

Пример 2. Первобеременная С-а, 26 лет, проходила очередной прием в женской консультации. Жалоб нет. Диагноз: Беременность 10 нед. По УЗИ: по гестации 10 нед. Плодное яйцо 46 ммм - 10 нед., КТР-31 мм - 10 нед. 3 дн. Сердцебиение ритмичное. Хорион по передней стенке, толщина 11 мм. Заключение: Беременность 10 нед. При влагалищном исследовании: шейка матки отклонена кзади, влагалищная часть шейка матки длиной 2,5-3 см, плотная, наружный зев закрыт. Матка увеличена соответственно сроку гестации, вне тонуса. Придатки с обеих сторон без особенностей.

С целью решения вопроса о целесообразности превентивной терапии, проведено обследование на определение в сыворотке крови уровней субстанции Р (равен 0,114 нг/мл) и FNO-α (равен 2,73 пг/мл). Эти значения в абсолютных величинах подставляют в приведенную формулу и проводят расчет прогностического коэффициента К. Полученное значение К равно 0,006975, (т.е. меньше, чем 0,48), что позволяет отнести больную в группу здоровых беременных, не требующих медикаментозной терапии. Данная беременность имела физиологическое течение.

Достоверность заявляемого способа подтверждена клинико-лабораторными исследованиями.

Процедура статистической обработки полученных эмпирических данных предусматривала последовательное выполнение нескольких этапов. Проверялось распределение исходных переменных на нормальность. Далее проводилась процедура описательной статистики, с помощью которой находились медианы, моды и доверительные интервалы, а также проверялись выборочные средние у различных групп. Достоверность полученных результатов рассчитывалась при доверительной вероятности 0,95. Полученные результаты представлены в таблицах 1-3,

*** - достоверность различий р<0,001 по сравнению с контрольной группой.

Таблица 1.
Содержание компонентов нейрогенного воспаления в сыворотке крови у беременных контрольной группыпоказательFNOSP (пг/мл)(нг/мл)медиана17,34***0,19***19,590,11квартиль  229,200,24квартиль  Таблица 2.
Содержание компонентов нейрогенного воспаления в сыворотке крови у беременных основной группы до терапиипоказательFNOαSP (пг/мл)(нг/мл)медиана6,03***0,32***12,330,22квартиль  215,530,4квартиль  

Таблица 3.
Содержание компонентов нейрогенного воспаления в сыворотке крови у беременных основной группы после терапиипоказательFNOαSP (пг/мл)(нг/мл)медиана9,05***0,33***14,10,24квартиль  213,620,47квартиль  

Обработка исходных рядов признаков осуществлялась с использованием пакета Poly Analyst 3.5 PRO и EXCEL 2003.

Для сравнения межгрупповых различий использовали метод Вилкоксона для независимых групп с помощью пакета AtteStat 6.4. Для анализа многомерных нелинейных зависимостей использовали пакет PolyAnalist 3.5 Pro, одна из функций которого включает в себя технологию «эволюционного программирования».

Специальный модуль непрерывно преобразует "лучшую" на данный момент программу с внутреннего представления во внешний язык PolyAnalyst - язык символьных правил (Symbolic Rule Language), понятный человеку: математические формулы, условные конструкции и так далее. Это позволяет пользователю понять суть полученной зависимости, контролировать процесс поиска, а также получать графическую визуализацию результатов.

Преимущество заявляемого метода состоит в том, что у беременных во втором триместре на основании высокочувствительных современных лабораторных маркеров производится прогнозирование невынашивания беременности с целью раннего назначения адекватной терапии. В клинической практике это позволит снизить угрозу перинатальных потерь за счет своевременного выявления беременных группы риска по развитию данной патологии и провести раннее профилактическое лечение, которое существенно снизит частоту невынашивания беременности и благоприятно отразится на показателях перинатальной заболеваемости и смертности в условиях обострившейся демографической ситуации. Возможность одновременной подготовки к исследованию большого количества проб крови и небольшие затраты времени исследования позволят использовать способ в скрининговых исследованиях.

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству, и может быть использовано для прогнозирования невынашивания в первом триместре беременности. Сущность способа: у беременных определяют содержание субстанции P(SP) и фактора некроза опухоли-α (FNO) в сыворотке крови методом ИФА. Затем по формуле рассчитывают прогностический коэффициент К:

K=(0,006*FNO*SP-0,065*FNO*SP²-0,00004*FNO)/(0,005-0,031*FNO), где SP - уровень субстанции Р в абсолютных величинах, FNO - уровень фактора некроза опухоли-α в абсолютных величинах. Если значение прогностического коэффициента К больше, чем 0,48, то у данной беременной прогнозируют угрозу прерывания беременности. Использование способа позволяет повысить точность, чувствительность и специфичность прогнозирования течения первого триместра беременности. 3 табл.

Способ прогнозирования невынашивания беременности в первом триместре беременности путем исследования сыворотки крови, отличающийся тем, что определяют в сыворотке крови методом ИФА содержание субстанции P(SP) и фактора некроза опухоли-α (FNO), значения которых подставляют в формулу и рассчитывают прогностический коэффициент К

K=(0,006·FNO·SP-0,065·FNO·SP²-0,00004·FNO)/(0,005-0,031·FNO),

где SP - уровень субстанции Р в абсолютных величинах;

FNO - уровень фактора некроза опухоли-α в абсолютных величинах, если значение прогностического коэффициента К больше, чем 0,48, то у данной беременной прогнозируют угрозу прерывания беременности.