СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРНЫХ ГИДРОГЕЛЕЙ, СОДЕРЖАЩИХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА Российский патент 2008 года по МПК A61K31/727 A61K38/58 A61P7/02 

Предлагаемое изобретение относится к области химии полимеров, биохимии и медицины, а именно к способу получения полимерных гидрогелей, содержащих физиологически активные вещества и используемых для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний, которые в настоящее время являются одной из основных причин смерти человека.

При образовании тромба в просвете артерии возникает нарушение притока крови к области, снабжаемой данным сосудом. Так, при тромбозе коронарных артерий сердца возникает инфаркт миокарда, тромбоз сосудов мозга может привести к инсульту, тромбоз крупных артерий конечностей - к развитию гангрены. Одними из наиболее распространенных лекарственных средств, применяемых для предотвращения и лечения этих заболеваний, являются антикоагулянты крови - вещества, активно воздействующие на свертывающую систему крови и предотвращающие образование тромба. Наибольшее распространение в качестве антикоагулянта крови в настоящее время находит гепарин - кислый мукополисахарид с молекулярной массой от 10000 до 30000. Гепарин не является полисахаридом в чистом виде: его углеводная цепь связана с белковым компонентом. Соотношение белкового и углеводного компонентом зависит от источника и способа выделения гепарина. В наибольших количествах он содержится в печени и легких, меньше - в скелетных мышцах, селезенке, мышце сердца. Гепарин добывают из легких крупного рогатого скота [Ульянов А.М., Ляпина Л.А. Современные данные о гепарине и его биохимических свойствах. Успехи современной биологии. 1977. Т.83. №1. С.69-85].

Гепарин является естественным противосвертывающим фактором. Механизм действия гепарина, в основном, заключается в нейтрализации свертывающей активности тромбина путем ускорения его реакции с антитромбином III [Зубаиров Д.М. Биохимия свертывания крови // М., Медицина. 1978. 259 с.]. Применяют для профилактики и терапии различных тромбоэмболических заболеваний и их осложнений: для предотвращения или ограничения (локализации) тромбообразования при остром инфаркте миокарда, при тромбозах и эмболиях магистральных вен и артерий, сосудов мозга, глаза, при операциях на сердце и кровеносных сосудах, для поддержания жидкого состояния крови в аппаратах искусственного кровообращения и аппаратуре для гемодиализа, а также для предотвращения свертывания крови при лабораторных исследованиях [Машковский А.Д. Лекарственные средства. М., Медицина. 1993. Т.2. С.79-81].

В противоположность гепарину антикоагулянтное действие гирудина не зависит от присутствия в плазме крови антитромбина III. По своей химической природе гирудин является полипептидом, состоящим из 65-68 аминокислотных остатков [Markwardt F. Hirudin as an inhibitor of thrombin. // Methods in Enzymol. 1970. V.19. P.924-932]. Изучение действия гирудина на отдельные стадии процесса свертывания крови показало, что гирудин специфически ингибирует действие тромбина. Гирудин не вступает в реакцию с другими факторами системы свертывания крови и оказывает свое ингибирующее действие на тромбин без участия каких-либо находящихся в крови компонентов [Markwardt F., Walsmann P. // Hoppe-Seyler's Zeitschrift fur physiologische Chemic. 1960. V.1-4. P.64-77]. В связи с этим гирудин получил широкое распространение при лечении заболеваний или состояний, при которых гепаринотерапия оказывается недостаточно эффективной, например в остром периоде инфаркта миокарда, при нестабильной стенокардии и т.д. Основным способом введения антикоагулянтов в организм являются внутривенные, внутримышечные или подкожные инъекции. Попытки введения антикоагулянтов наиболее физиологическим и удобным для больных пероральным путем (через рот) оказались безуспешными, поскольку эти соединения легко гидролизуются ферментами пищеварительной системы, в первую очередь, протеолитическими ферментами и α-амилазой, с потерей биологической активности.

Известен способ получения полимерных гидрогелей, содержащих физиологически активные вещества, путем иммобилизации физиологически активного вещества в объеме сшитого полимера, модифицированного ингибитором ферментов [Greenley R.Z., Brown T.M., Garlow J., Vogt C.E., Zia H., Rodgers R.L., Christie M., Luzzi L.A., Polymer Matrices for Oral Delivery/ Polymer Preprints. 1990. V.31. №2. P.182-173]. В качестве физиологически активного вещества используют инсулин, в качестве сшитого полимера используют акриловую или метакриловую кислоты, сшитые триэтиленгликольди(мет)акрилатом, а в качестве ингибитора ферментов используют апротенин - панкреатический ингибитор трипсина.

Недостатком этого способа является низкая биологическая активность иммобилизованного физиологически активного вещества при пероральном применении (пероральное введение полученного полимерного гидрогеля кроликам в количестве, соответствующем 50 единиц инсулина, не приводит к уменьшению концентрации глюкозы в крови, в то время как подкожная инъекция кроликам всего 0.23 единиц инсулина приводит к снижению концентрации глюкозы в крови на 74%), а также невозможность использования гидрогеля в качестве антикоагулянта.

Наиболее близким (прототип) к заявляемому по технической сущности является способ получения полимерных гидрогелей, содержащих физиологически активные вещества, путем иммобилизации физиологически активного вещества в объеме сшитого полимера, модифицированного ингибитором ферментов [Патент РФ №2066551, МКИ А61К 38/28, Бюл. №26. 1996]. В качестве сшитого полимера используют сшитые полиакриламид, полиакриловую кислоту, полиметакриламид, поли-N-винилпирролидон, полигидроксиэтилметакрилат, в качестве физиологически активного вещества используют инсулин, а в качестве ингибитора ферментов используют овомукоид из белка утиных яиц. Получаемый полимерный гидрогель обладает высокой биологической активностью (активность инсулина при пероральном введении его в составе гидрогеля составляет 60-70% от активности исходного инсулина при его подкожном применении).

Недостатком этого способа является невозможность использования синтезированных полимерных гидрогелей в качестве антикоагулянта.

Задачей предлагаемого изобретения является получение гидрогелей, обладающих антикоагулянтными свойствами и пригодных к пероральному применению.

Решение поставленной задачи достигается тем, что в способе получения полимерных гидрогелей, содержащих физиологически активные вещества, путем иммобилизации физиологически активного вещества в объеме сшитого полимера, модифицированного овомукоидом из белка утиных яиц, сшитый полимер дополнительно модифицирован ингибитором α-амилазы из семян пшеницы, а в качестве физиологически активного вещества используют гепарин или гирудин.

Сшитый полимер, модифицированный овомукоидом и ингибитором α-амилазы, получают путем химической модификации полимера смесью овомукоида и ингибитора α-амилазы, количество которых составляет 0,5-15 мг овомукоида на 1 г набухшего сшитого полимера и 0,5-5,0 мг ингибитора α-амилазы на 1 г набухшего сшитого полимера.

Реакцию модификации проводят путем ацилирования овомукоида и ингибитора α-амилазы хлорангидридом акриловой кислоты в водном растворе (рН 7,0-9,0), смешиванием полученных растворов и последующей сополимеризацией полученных производных с гидрофильным мономером и бифункциональным сшивающим агентом в присутствии окислительно-восстановительной каталитической системы: персульфат аммония -N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин. После промывания дистиллированной водой до полного удаления непрореагировавших соединений сшитый полимер лиофильно высушивают.

Иммобилизацию антикоагулянтов проводят путем погружения лиофильно высушенного, модифицированного полимера в водный раствор антикоагулянта с концентрацией 0.04-1.5 мг антикоагулянта на 1 мл раствора до полного набухания полимера (30-60 минут). Модифицированный полимер используют в количестве 0,05-0,8 г на 1 мл раствора антикоагулянта.

Предположительный механизм действия заявленной полимерной системы заключается в следующем. Овомукоид из белка утиных яиц является гликопротеином, то есть состоит из белкового и углеводного участка [Шульгин М.Н., Валуева Т.А., Кестере А.Я., Мосолов В.В. Свойства утиного овомукоида, очищенного методом аффинной хроматографии на трипсин-сефарозе. Биохимия. 1981. Т.46. №3. С.473-480]. Молекулярная масса овомукоида равна 31000. В составе модифицированного полимера белковый участок овомукоида взаимодействует с протеолитическими ферментами и подавляет их активность, защищая антикоагулянт от действия этих ферментов, а углеводный участок способен реагировать с лектинами, содержащимися на слизистой тонкого кишечника, обеспечивая тем самым направленный транспорт всей системы на стенки тонкого кишечника, где и происходит всасывание содержащегося в сшитом полимере, но химически с ним не связанного антикоагулянта.

Ингибитор α-амилазы из семян пшеницы имеет молекулярную массу 20000 и относится к бифункциональным ингибиторам, то есть способен подавлять активность α-амилазы - фермента, ответственного за гидролиз полисахаридов, активность ряда протеолитических ферментов [Мосолов В.В., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ и их функции у растений. Прикладная биохимия и микробиология. 2005. Т.41. №3. С.261-281]. Таким образом, одновременная модификация сшитых полимеров овомукоидом и ингибитором α-амилазы обеспечивает защиту введенного в полимер полисахарида - гепарина и белка - гирудина и направленный транспорт всей системы на слизистую оболочку кишечника.

Пример 1. 0,05 г лиофильно высушенного полиакриламида, модифицированного овомукоидом ингибитором α-амилазы, помещают в 1 мл водного раствора гепарина с концентрацией 0,04 мг/мл на 60 минут при комнатной температуре. В течение этого времени полимер полностью набухает в растворе и готов к употреблению. Для определения антикоагулянтной активности синтезированный полимер перорально (через рот) с помощью катетера вводят кролику и затем измеряют время свертывания крови, отобранной из ушной вены животного. Время свертывания крови равно 6,2±1,1 мин. * Исходное время свертывания крови (без добавления антикоагулянта) в стеклянной пробирке равно 3,0±0,5 мин.

Примеры 2-12. Процесс проводят по примеру 1, используя различные сшитые полимеры и их количества, различные количества овомукоида и ингибитора α-амилазы в составе сшитого полимера, различные антикоагулянты. Результаты приведены в таблице.

Примеры 13-18. Процесс проводят по примеру 1, используя сшитый полиакриламид, в котором количества овомукоида и ингибитора α-амилазы, выходят за заявленные пределы, а также растворы антикоагулянтов, в которых количества антикоагулянтов также выходят за заявленные пределы. Результаты приведены в таблице.

Примеры 19-20. Сравнительные примеры, в которых раствор антикоагулянтов вводят кроликам путем подкожной инъекции. Результаты приведены в таблице.

Таблица.№Количество антикоагулянта в 1 мл исходного раствора, мгКоличество сшитого полимера*, гКонцентрация в сшитом полимере, мг/г набухшего полимераВремя свертывания крови, мин**ГепаринГирудинОвомукоидИнгибитор α-амилазы10,04-ПАА, 0,050,53,16,2±1,120,12-ПАА, 0,20,85,08,0±0,830,28-ПМА, 0,23,92,711,4±1,540,50-ПВП, 0,19,80,512,0±2,051,03-ПГЭМ, 0,812,30,914,2±2,061,50-ПАА, 0,115,01,415,7±2,57-0,04ПАА, 0,10,53,111,2±1,68-0.09ПАА, 0,20,85,018,6±2,09-0,18ПМА, 0,23,92,721,0±2,510-0,87ПВП, 0,19,80,523,5±2,011-1,25ПГЭМ, 0,312,30,925,0±2,512-1,50ПАА, 0,115,01,426,0±2,513к.0,03-ПАА, 0,153,92,74,0±1,014к.-0,03ПАА, 0,159,80,56,0±1,515к.0,28-ПАА, 0,15-2,73,5±0,516к.0,50-ПАА, 0,153,9-4,0±1,017к.-0,87ПАА, 0,15-2,73,0±0,518к.-1,25ПАА, 0,153,9-5,5±1,519 с.Подкожная инъекция 0,02 мг гирудина18,0±1,520 с.Подкожная инъекция 0,1 мг гепарина15,5±1,5* ПАА- полиакриламид, ПМА- полиметакриламид, ПВП - поли-N-винилпирролидон, ПГЭМ - полигидроксиэтилметакрилат.
** Исходное время свертывания (без добавления антикоагулянта) 1 мл крови в стеклянной пробирке равно 3,0±0,5 мин.

Сравнительный анализ с прототипом показывает, что заявленный объект отличается химической природой используемого физиологически активного вещества и модифицированного сшитого полимера, то есть заявленное решение соответствует критерию «новизна». Оно также соответствует критерию «изобретательский уровень», так как способность смеси овомукоида и ингибитора α-амилазы, химически связанных с макромолекулами полимера, предотвращать гидролитическое расщепление полисахаридов и обеспечивать направленный транспорт всей системы на слизистую оболочку тонкого кишечника является неизвестной функцией и впервые обнаружена в данном изобретении. Использование овомукоида и ингибитора α-амилазы в модифицированном полимере в количествах, выше заявленных, нецелесообразно, так как заявленных количеств вполне достаточно для защиты терапевтических доз антикоагулянтов. Возможность перорального введения антикоагулянтов не только создает большие удобства для больных, но и позволяет усовершенствовать стратегию лечения, а главное предупреждения, ряда сердечно-сосудистых заболеваний.

Изобретение относится к области химии полимеров, биохимии и медицины, а именно к способу получения полимерных гидрогелей, содержащих физиологически активные вещества, обладающих антикоагулянтным действием и используемых для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Способ включает получение полимерных гидрогелей, содержащих физиологически активные вещества, путем иммобилизации физиологически активного вещества в объеме сшитого полимера, модифицированного овомукоидом из белка утиных яиц, сшитый полимер дополнительно модифицирован ингибитором α-амилазы из семян пшеницы, а в качестве физиологически активного вещества используют гепарин или гирудин. Сшитый полимер, модифицированный овомукоидом и ингибитором α-амилазы, получают путем химической модификации полимера смесью овомукоида и ингибитора α-амилазы, количество которых составляет 0,5-15 мг овомукоида на 1 г набухшего сшитого полимера и 0,5-5,0 мг ингибитора α-амилазы на 1 г набухшего сшитого полимера. Изобретение обеспечивает получение гидрогелей, обладающих антикоагулянтными свойствами и пригодных к пероральному применению. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения полимерных гидрогелей, содержащих физиологически активные вещества, путем иммобилизации физиологически активного вещества в объеме сшитого полимера, модифицированного овомукоидом из белка утиных яиц, отличающийся тем, что сшитый полимер дополнительно модифицирован ингибитором α-амилазы из семян пшеницы, а в качестве физиологически активного вещества используют гепарин или гирудин.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация овомукоида в сшитом полимере равна 0,5-15 мг/г набухшего сшитого полимера, а концентрация ингибитора α-амилазы равна 0,5-5,0 мг/г набухшего сшитого полимера.