СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕМОСОВМЕСТИМЫХ ПОЛИМЕРНЫХ ГИДРОГЕЛЕЙ Советский патент 1998 года по МПК C08F267/10 C08F220/56 

Изобретение относится к химии полимеров и медицине, к способу получения гемосовместимых полимерных гидрогелей, обладающих способностью лизировать стабилизированный фибрин. Изобретение может быть использовано в медицинской технике и практике для cоздания долговременных протезов органов или изделий, контактирующих с кровью в условиях функционирования живого организма.

В настоящее время полимерные гидрогели на основе гидрофильных мономеров и бифункциональных мономеров-сшивателей (представляющие собой нерастворимые, но хорошо набухающие в воде и физиологических средах сополимеры) находят широкое применение в качестве гемосовместимых материалов. Как правило, содержание воды в таких системах достигает 80 90% что приводит к улучшению гидродинамических характеристик этих материалов и к увеличению их гемосовместимости. Однако гемосовместимость известных полимерных гидрогелей зачастую является недостаточной, и поэтому введение в них биологически активных соединений, способных воздействовать на процессы тромбообразования и фибринолиза, в настоящее время является лучшим способом повышения гемосовместимости материалов, контактирующих с кровью. В качестве таких соединений используют фибринолитические ферменты, например урокиназу, стрептокиназу и др. Фибринолитические ферменты используют в основном для кратковременного повышения гемосовместимости, поскольку при введении в живой организм эти ферменты довольно быстро теряют свою ферментативную активность вследствие воздействия на них ингибиторов и других денатурирующих агентов, присутствующих в крови.

Известно, что введение в гидрогели природного антикоагулянта крови - гепарина существенно повышает их гемосовместимость, в основном за счет ингибирования начальных стадий процесса тромбообразования на полимерной матрице.

Однако в больших конструкциях из гидрогелей иммобилизованный гепарин не предотвращает свертывания крови, особенно в области зайстойных зон, где вероятность гемокоагуляции наиболее высока. Кроме того, гепарин не обладает литической активностью и не способен лизировать тромб в случае его образования.

Известен способ полученная гемосовместимых полимерных гидрогелей путем радикальной сополимеризации в растворе предварительно ацилированного хлорангидридами акриловой или метакриловой кислоты биологически активного соединения с гидрофильным мономером и бифункциональным мономером-сшивателем, в котром в качестве биологически активного соединения используют сывороточный альбумин человека [1]
Недостаток способа заключается в неспособности гидрогеля ингибировать свертывающую систему крови и лизировать стабилизированный фибрин.

Известен способ получения гемосовместимых полимерных гидрогелей путем радикальной сополимеризации в водном растворе предварительно ацилированного хлорангидридами акриловой или метакриловой кислоты биологически активного соединения с гидрофильным мономером и бифункциональным мономером-сшивателем, в котором в качестве биологически активного соединения используют фибринолитические ферменты плазмин и антиназу, выделенную из лучистого грибка [2]
Недостаток способа заключается в том, что такие полимерные гидрогели имеют недостаточно высокие гемосовместимые свойства (время свертывания крови на них составляет около 120 мин, что недостаточно для долговременного контакта с кровью). Кроме того, такие гидрогели не способны воздействовать на процесс тромбообразования, что приводит к тромбированию изделий из этого материала (скорость тромбообразования превосходит скорость лизиса тромба), и не обладают способностью лизировать стабилизированный фибрин.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемым результатам является способ получения гемосовместимых полимерных гидрогелей путем ацилирования хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты гепарина в водном растворе с последующим введением акриламида, бифункционального мономера-сшивателя и проведением инициированной радикальной сополимеризации [3]
Недостаток способа также заключается в невысокой гемосовместимости гидрогелей (низкие значения тромбинового времени и неспособность лизировать стабилизированный фибрин.

Целью изобретения является повышение гемосовместимости полимерных гидрогелей (за счет придания им свойств одновременно ингибировать начальные стадии тромбообразования и вызывать лизис тромба в случае его образования).

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения гемосовместимых полимерных гидрогелей путем ацилирования хлорангидриром акриловой или метакриловой кислот гепарина в водном растворе с последующим введением акриламида, бифункционального мономера-сшивателя и проведением инициированной радикальной сополимеризации в реакционный раствор дополнительно вводят ацилированный хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты трипсин при весовом соотношении ацилированный гепарин ацилированный трипсин, равном 10 50:1.

Гидрогели с ковалентно включенным трипсином и гепарином обладают высокой гемосовместимостью: они обладают высокими тромбиновыми временами и высокой лизирующей способностью стабилизированного тромба, по-видимому, за счет образования комплекса гепарин-трапсин, литическая активность которого выше, чем у трипсина, взятого в таких же и даже больших количествах.

Выбор предлагаемого количества этих биологически активных соединений и их соотношения обусловлен невысокой растворимостью трипсина в воде (не более 0,5 мг фермента в 100 мл воды), а также тем, что увеличение количества гепарина в полимерном гидрогеле до выше 1 15% не приводит к существенному увеличению тромбинового времени.

Количества акриламида и бифункционального мономера-сшивателя являются стандартными для получения гидрогелей, обладающих удовлетворительными физико-механическими свойствами (прочность, набухаемость, размер пор и прочие). Регулирование этих свойств производят изменением количества сшивающего агента и концентрации мономера в растворе, а также типом используемого сшивателя, в качестве последнего возможно использование бифункциональных соединений, таких как диэфиры акриловой или метакриловой кислоты и энтиленгликоля, N, N метиленбисакриламид и др.

Сополимеризацию мономеров проводят при 0 30^oC, используя в качестве иннициаторов водорастворимые инициаторы, например персульфат аммония в смеси с активатором N, N, N' N'- тетраметилэтилендиамином, или рибофлавин при облучении УФ светом.

Ацилирование трипсина и гепарина необходимо проводить при 0 4^oC и pH 6-9, достигаемом использованием соответствующих буферных растворов, при мольном соотношении биологически активное вещество хлорангидрид 1:10 - 1:250.

При проведении полимеризации в соответствующей форме гидрогели можно получать в различном конструкционном оформлении (пленки, пластинки, трубки, пробирки, гранулы), что существенно упрощает процесс изготовления изделий из них.

Пример 1. Раствор 3 г гепарина в 20 мл бикарбонатного буфера с pH 8,0 обрабатывают при 0^oC 0,089 г хлорангидрида акриловой кислоты (ХАК) в течение 15 мин при интенсивном перемешивании и доводят до комнатной температуры. Раствор 0,3 г трипсина в том же буфере (20 мл) обрабатывают при 0^oC 0,0684 г ХАК (мольное отношение трипсин: ХАК 1:50) в течение 15 мин и доводят до комнатной температуры. Растворы объединяют, добавляют 3,63 г акриламида и 0,1089 г сшивателя (метиленбисакриламида), продувают аргоном в течение 10 мин и вводят 0,3% от массы мономеров инициатора (персульфата аммония) и активатора (N, N, N', N' тетраметилэтилендиамина). Полимеризацию ведут при комнатной температуре 1 ч. Полученный гель измельчают на нейлоновых ситах, промывают водой и физиологическим раствором до отсутствия в промывных водах поглощения при 280 нм, определяемого спектрофотометрически. Гидрогелю дают набухнуть в течение 5 ч и определяют величину емкости по растворителю (25 г воды на 1 мл исходного геля). Тромбиновое время, определяемое как время начала образования сгустка фибрина при реакции раствора фибриногена с тромбином или как время начала образования "белого" тромба при инкубировании гидрогеля со свежей плазмой крови, составляет 1800 с. Тромбиновое время в этих системах в отсутствие геля составляет 2 и 14 с соответственно. Гель инкубируют со сгустком стабилизированного фибрина ("белого" тромба) и измеряют оптическое поглощение раствора над тромбом при 280 нм (спектрофотометрически) после определенных промежутков времени. Значение Д₂₈₀ становится максимальным после инкубирования в течение 3,5 ч и составляет 0, 175. Появление в растворе над тромбом фрагментов белковой природы подверждается реакцией Лоури (проба с реактивом Фолина-Чиокальтеу).

Данные по примерам 2-8 представлены в таблице, а данные по кинетике лизиса стабилизированного фибрина гидрогелями, содержащими одинаковое количество трипсина, гепарина и их смеси, приведены на графике.

Таким образом, изобретение по сравнению с известным способом позволяет получать гемосовместимые полимерные гидрогели с повышенными гемосовместимыми свойствами (повышенное тромбиновое время и лизис сгустка стабилизированного фибрина). Такое повышение гемосовместимости определяется одновременным ингибированием начальной стадии тромбообразования и лизисом сгустка образующегося фибрина. Простота способа позволяет применять его для создания полимерных материалов, обладающих гемосовместимостью, а устойчивость полимерной матрицы позвояет использовать такие материалы в течение длительного времени в условиях физиологического окружения.

Кинетика лизиса сгустка стабилизиpованного фибpина полимеpными гидpогелями, содеpжащими одинаковое количество (0,83%) ацилиpованного гепаpина (I), ацилиpованного тpипсина (II) и смеси ацилиpованных гепаpина и тpипсина, взятых в весовом соотношении 30:1 (III).

Способ получения гемосовместимых полимерных гидрогелей путем ацилирования хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты гепарина в водном растворе с последующим введением акриламида, бифункционального мономера-сшивателя и проведением инициированной радикальной сополимеризации, отличающийся тем, что, с целью повышения гемосовместимости гидрогелей, в реакционный раствор дополнительно вводят ацилированный хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты трипсин при массовом соотношении ацилированный гепарин : ацилированный трипсин, равном 10 - 50 : 1.

Способ получения гемосовместимых полимерных гидрогелей путем ацилирования хлорангидридом акриловой или метакриловой кислот гепарина в водном растворе с последующим введением акриламида, бифункционального мономера-сшивателя и проведением инициированной радикальной сополимеризации, отличающийся тем, что, с целью повышения гемосовместимости гидрогелей, в реакционный раствор дополнительно вводят ацилированный хлорангидридом акриловой или метакриловой кислот трипсин при массовом соотношении ацилированный гепарин ацилированный трипсин 10 50 1.