СПОСОБ ПОДГОТОВКИ РАСТИТЕЛЬНОГО ОБЪЕКТА К ИЗУЧЕНИЮ СОСТОЯНИЯ УСТЬИЦ Российский патент 2009 года по МПК G01N33/00 G01B1/00 

Изобретение относится к области физиологии растений, а в частности к лабораторной практике исследования растительного объекта, и может быть использовано для подготовки растительного объекта к изучению состояния устьиц в процессе варьирования напряженностью внешних факторов (например, временем суток, температурой окружающей среды, составом химических соединений различных классов в качестве компонентов питания при их различной концентрациии).

Известен способ подготовки растительного объекта к изучению состояния устьиц, заключающийся в срезе полоски (полосок) эпидермиса с нижней стороны листа с использованием бритвы, быстром обезвоживании и фиксировании снятого эпидермиса в абсолютном спирте с последующим его исследованием с использованием микроскопа. Например, определение площади устьичных щелей с использованием окуляр-микрометра и объект-микрометра (Третьяков Н.Н. и др. Практикум по физиологии растений - М.: Агропромиздат, 1999, с.62-63).

Известное техническое решение обладает следующими недостатками.

1. Как правило, при отделении от листовой пластины вырезанного с помощью бритвы фрагмента эпидермиса на нем остаются в значительном количестве фрагменты соединительной ткани, что делает такой образец непригодным для проведения дальнейших операций по подготовке растительного объекта к изучению состояния устьиц с использованием микроскопа.

В результате этого операцию по получению среза эпидермиса растительного объекта с использованием бритвы необходимо проводить неоднократно, что вынуждает исследователя затрачивать значительное время на повторение операций по подготовке объекта к его изучению.

2. Нанесение на поверхности эпидермиса растительного объекта срезов с использованием бритвы неизбежно приводит к нарушению естественного хода водного обмена через устьичные щели, что в итоге дает искаженную картину хода транспирации воды из растительного объекта в динамических условиях длительного эксперимента.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ подготовки растительного объекта к изучению состояния устьиц, заключающийся в получении тонкой прозрачной пленки отпечатков устьиц с использованием полимерных соединений в органическом растворителе (например, нитроцеллюлоза, кинофотопленка в ацетоне) с последующим снятием полученного отпечатка и исследования его с использованием микроскопа. Например, определение площади устьичной щели с использованием окуляр-микрометра и объект-микрометра (Рябинина З.Н., Семенова Н.В. Практикум по физиологии растений: Учебно-методическое пособие. - Оренбург, - Издательство ОГУ, 1989, с.25-26) - прототип.

Однако данный способ подготовки растительного объекта к изучению состояния устьиц обладает следующими недостатками:

1. Очень часто при снятии полученной полимерной пленки с поверхности растительного объекта, происходит ее деформация (растяжение, изменение размера, толщины), либо происходит ее разрыв, что делает такой образец непригодным для подготовки растительного объекта к изучению состояния устьиц и микроскопирования, что приводит к необходимости повторения операции получения отпечатка.

В результате этого операцию по получению отпечатка эпидермиса растительного объекта с использованием полимерного материала в органическом растворителе необходимо проводить повторно, что вынуждает исследователя затрачивать дополнительное время на повторение операций по подготовке объекта к его изучению.

2. Нанесение на значительную часть поверхности листовой пластины (эпидермиса) растительного объекта полимерного материала в органическом растворителе приводит к возникновению глубоких химических ожогов с последующим некрозом клеток эпидермиса. Это в итоге также дает искаженную картину хода транспирации воды с поверхности изучаемого растительного объекта в динамических условиях длительного эксперимента.

3. Достаточно часто в момент снятия полученной полимерной пленки с поверхности растительного объекта происходит повреждение поверхности листовой пластины (происходит отрыв частиц эпидермиса совместно с полимерной пленкой).

Решаемая изобретением задача - повышение качества подготовки растительного объекта к изучению состояния устьиц, сокращение времени приготовления полимерной пленки, а также снижение интенсивности химического ожога на поверхности растительного объекта.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении заявленного способа - повышение качества отпечатков растительного объекта и высокий процент их пригодности для оценки состояния устьиц.

Для решения поставленной задачи с достижением указанного технического результата в известном способе подготовки растительного объекта к изучению состояния устьиц согласно изобретению перед нанесением на поверхность растительного объекта раствора полимера в органическом растворителе в зоне растительного объекта, подлежащей обработке раствором полимером, размещают пластинку, имеющую, по крайней мере, одну прорезь площадью 10-120 мм² для заливки раствора полимера в органическом растворителе. При этом толщина пластинки составляет 25-250 мкм, а в качестве материала пластинки используют: бумагу, кальку, металлическую фольгу или тонкий полимерный материал, не взаимодействующий с органическим растворителем (полиэтилен, фторопласт). В качестве полимера для формирования полимерной пленки с оттиском растительного объекта используют нитроцеллюлозу или полиметилметакрилат, а в качестве органического растворителя вещества, выбранные из группы: ацетон, дихлорэтан, хлороформ, диэтиловый эфир либо их смесь.

Нитроцеллюлоза: (целлюлозы нитрат, нитроклетчатка) [С₆Н₇O₂(ОН)_3-х(ONO₂)_х]_n, мол. масса 38-500 тыс., плотность 1,58-1,65 г/см³; растворима в ацетоне, сложных эфирах, неустойчива в кислотах и щелочах. Получается взаимодействием хлопковой целлюлозы с нитрующей смесью. Применяется: при производстве целлулоида, лаков.

Полиметилметакрилат: (плексиглас) [-СН₂-С(СН₃)(СООСН₃)-]_n, мол. масса от десятков тыс. до млн.; плотность 1,19 г/см³, растворим в сложных эфирах, ароматических углеводородах. Получается радикальной полимеризацией метилметакрилата в массе или суспензии. Применяется: листовое органическое стекло, основа лаков и клеев.

Ацетон: (диметилкетон) СН₃СОСН₃, t_пл. - 95,35°С, t_кип. 56,24°C, d²⁰ 0,7908; смешивается с водой и органическими растворителями; t_всп. - 18°C, КПВ (концентрационные пределы взрываемости) 2,9-12,8%. Получается гидратация пропилена с последующим дегидрированием образующегося изопропанола. Применяется: в производстве метилметакрилата, метакриловой кислоты, лекарственных средств, растворитель акриловых лаков, ацетатов целлюлозы.

Дихлорэтан: (1,2-дихлорэтан, этилендихлорид) ClCH₂CH₂Cl, t_пл. - 35,36°С, t_кип. 83,47°С, d²⁰ 1,253; растворимость в воде - 0,87%, смешивается с органическими растворителями; t_всп. 13°С, КПВ 6,2-16,9%. Получается прямым или окислительным хлорированием этилена. Применяется: в производстве винил-хлорида, этилендиамина, растворитель красок, клеев.

Хлороформ: (трихлорметан, хладон-20) CHCl₃, t_пл. - 63,5°С, t_кип. 61,2°С, d²⁰ 1,483; растворимость в воде - 0,32%, смешивается с органическими растворителями Получается хлорирование метана. Применяется: хладагент в холодильных установках, сырье в производстве фторопластов.

Диэтиловый эфир: (этиловый эфир, серный эфир, эфир) С₂Н₅OC₂Н₅, t_пл. - 116,2°C, t_кип. 34,48°С, d²⁰ 0,7135; растворим в спирте, бензоле, воде (6,5% при 20°С), t_всп. - 43°С, КПВ 1,9-48,0%. Получается дегидратация этанола. Применяется: растворитель нитратов целлюлозы, животных, растительных жиров, природных и синтетических смол, экстрагент.

Нанесение раствора полимера в органическом растворителе на растительный объект осуществляют таким образом, чтобы полимерная пленка формировалась как на поверхности листовой пластины ограниченной материалом пластинки с прорезью (прорезями), так и на внешней стороне наложенной на растительный объект пластинки с прорезью (прорезями). Отделение сформированной полимерной пленки от растительного объекта осуществляют с использованием кромки у пластинки с прорезью (прорезями), которая располагается либо перпендикулярно, либо под углом к растительному объекту.

Изобретение иллюстрируется примерами. Полученные данные приведены в таблице.

Примеры 1-7 иллюстрируют варианты реализации предлагаемого способа при нижних, оптимальных и верхних значениях отличительных признаков, примеры 8-10 иллюстрируют варианты реализации по способу-прототипу, а сравнительные примеры 11-15 обосновывают границы заявленных отличительных признаков.

Пример 1. Изучают состояние устьиц подсолнечника (Helianthus annuus).

На поверхность листовой пластины подсолнечника перед нанесением раствора полимера в органическом растворителе размещают пластинку с кромкой, расположенной перпендикулярно или под углом к растительному объекту из кальки толщиной 25 мкм, имеющую одну прорезь площадью 10 мм², наносят раствор полимера в органическом растворителе (нитроцеллюлоза - 5% вес. + ацетон - 95% вес.), сушат при комнатной температуре 3-7 минут, переносят пластинку из кальки с полимерной пленкой на предметное стекло, фиксируют объект покровным стеклом и микроскопируют вначале при малом (160х), а затем при большом увеличении (600х).

Кратность повторения примера - 50 раз.

Пригодные полимерные пленки для оценки состояния устьиц методом микроскопирования составляют - 88,0%. Полученные данные приведены в таблице.

Пример 2. Изучают состояние устьиц подсолнечника аналогично примеру 1, только в качестве материала пластинки используют медную фольгу толщиной 100 мкм, имеющую одну прорезь площадью 75 мм², наносят раствор полимера в органическом растворителе (нитроцеллюлоза - 5% вес. + ацетон - 95% вес.), сушат при комнатной температуре 3-7 минут, переносят пластинку из медной фольги с полимерной пленкой на предметное стекло, фиксируют объект покровным стеклом и микроскопируют вначале при малом (160х), а затем при большом увеличении (600х).

Кратность повторения примера - 50 раз.

Пригодные полимерные пленки для оценки состояния устьиц методом микроскопирования составляют - 86,0%. Полученные данные приведены в таблице.

Пример 3. Изучают состояние устьиц подсолнечника аналогично примеру 1, только в качестве материала пластинки используют пленку из полиэтилена толщиной 250 мкм, имеющую одну прорезь площадью 120 мм², наносят раствор полимера в органическом растворителе (нитроцеллюлоза - 5% вес. + ацетон - 95% вес.), сушат при комнатной температуре 3-7 минут, переносят пластинку из полиэтилена с полимерной пленкой на предметное стекло, фиксируют объект покровным стеклом и микроскопируют вначале при малом (160х), а затем при большом увеличении (600х).

Кратность повторения примера - 50 раз.

Пригодные полимерные пленки для оценки состояния устьиц методом микроскопирования составляют - 90,0%. Полученные данные приведены в таблице.

Пример 4. Изучают состояние устьиц подсолнечника аналогично примеру 1, только в качестве материала пластинки используют бумагу толщиной 150 мкм, имеющую три прорези площадью 75 мм² каждая, наносят раствор полимера в органическом растворителе (полиметилметакрилат - 10% вес. + дихлорэтан - 90% вес.), сушат при комнатной температуре 5-10 минут, переносят пластинку из бумаги с полимерными пленками на предметное стекло, фиксируют объект покровным стеклом и микроскопируют вначале при малом (160х), а затем при большом увеличении (600х).

Кратность повторения примера - 50 раз.

Пригодные полимерные пленки для оценки состояния устьиц методом микроскопирования составляют - 92,0%. Полученные данные приведены в таблице.

Пример 5. Изучают состояние устьиц подсолнечника аналогично примеру 1, только в качестве материала пластинки используют кальку толщиной 50 мкм, имеющую пять прорезей площадью 75 мм² каждая, наносят раствор полимера в органическом растворителе (полиметилметакрилат - 10% вес. + хлороформ - 90% вес.), сушат при комнатной температуре 5-10 минут, переносят пластинку из кальки с полимерными пленками на предметное стекло, фиксируют объект покровным стеклом и микроскопируют вначале при малом (160х), а затем при большом увеличении (600х).

Кратность повторения примера - 50 раз.

Пригодные полимерные пленки для оценки состояния устьиц методом микроскопирования составляют - 90,0%. Полученные данные приведены в таблице.

Пример 6. Изучают состояние устьиц подсолнечника аналогично примеру 1, только в качестве материала пластинки используют фторопласт толщиной 250 мкм, имеющую две прорези площадью 50 мм² каждая, две прорези площадью 75 мм² и одну прорезь площадью 120 мм², наносят раствор полимера в органическом растворителе (полиметилметакрилат - 10% вес. + ацетон - 90% вес.), сушат при комнатной температуре 5-10 минут, переносят пластинку из фторопласта с полимерными пленками на предметное стекло, фиксируют объект покровным стеклом и микроскопируют вначале при малом (160х), а затем при большом увеличении (600х).

Кратность повторения примера - 50 раз.

Пригодные полимерные пленки для оценки состояния устьиц методом микроскопирования составляют - 88,0%. Полученные данные приведены в таблице.

Пример 7. Изучают состояние устьиц подсолнечника аналогично примеру 1, только в качестве материала пластинки используют алюминиевую фольгу толщиной 50 мкм, имеющую пять прорезей площадью 25 мм² каждая, пять прорезей площадью 75 мм² каждая и пять прорезей площадью 120 мм² каждая, наносят раствор полимера в органическом растворителе (нитроцеллюлоза - 10% вес. + ацетон + диэтиловый эфир (1:1) 90% вес.), сушат при комнатной температуре 5-10 минут, переносят пластинку из алюминиевой фольги с полимерными пленками на предметное стекло, фиксируют объект покровным стеклом и микроскопируют вначале при малом (160х), а затем при большом увеличении (600х).

Кратность повторения примера - 50 раз.

Пригодные полимерные пленки для оценки состояния устьиц методом микроскопирования составляют - 86,0%. Полученные данные приведены в таблице.

Пример 8. Изучают состояние устьиц подсолнечника (Helianthus annuus).

На поверхность листовой пластины подсолнечника наносят раствор полимеру в органическом растворителе (нитроцеллюлоза - 5% вес. + ацетон - 95% вес.), сушат при комнатной температуре 3-7 минут, переносят полимерную пленку на предметное стекло, фиксируют объект покровным стеклом и микроскопируют вначале при малом (160х), а затем при большом увеличении (600х).

Кратность повторения примера - 50 раз.

Пригодные полимерные пленки для оценки состояния устьиц методом микроскопирования составляют - 34,0%. Полученные данные приведены в таблице.

Пример 9. Изучают состояние устьиц подсолнечника (Helianthus annuus).

На поверхность листовой пластины подсолнечника наносят раствор полимера в органическом растворителе (полиметилметакрилат - 10% вес. + хлороформ - 90% вес.), сушат при комнатной температуре 5-10 минут, переносят полимерную пленку на предметное стекло, фиксируют объект покровным стеклом и микроскопируют вначале при малом (160х), а затем при большом увеличении (600х)

Кратность повторения примера - 50 раз.

Пригодные полимерные пленки для оценки состояния устьиц методом микроскопирования составляют - 30,0%. Полученные данные приведены в таблице.

Пример 10. Изучают состояние устьиц подсолнечника (Helianthus annuus).

На поверхность листовой пластины подсолнечника наносят раствор полимера в органическом растворителе (полиметилметакрилат - 10% вес. + дихлорэтан - 90% вес.), сушат при комнатной температуре 5-10 минут, переносят полимерную пленку на предметное стекло, фиксируют объект покровным стеклом и микроскопируют вначале при малом (160х), а затем при большом увеличении (600х).

Кратность повторения примера - 50 раз.

Пригодные полимерные пленки для оценки состояния устьиц методом микроскопирования - 28,0%. Полученные данные приведены в таблице.

Пример 11. Изучают состояние устьиц подсолнечника аналогично примеру 1, только в качестве материала пластинки используют кальку толщиной 15 мкм, имеющую одну прорезь площадью 8,5 мм², наносят раствор полимера в органическом растворителе (нитроцеллюлоза - 5% вес. + ацетон - 95% вес.), сушат при комнатной температуре 3-7 минут, переносят пластинку из кальки с полимерной пленкой на предметное стекло, фиксируют объект покровным стеклом и микроскопируют вначале при малом (160х), а затем при большом увеличении (600х).

Кратность повторения примера - 50 раз.

Пригодные полимерные пленки для оценки состояния устьиц методом микроскопирования составляют - 62,0%. Полученные данные приведены в таблице.

Пример 12. Изучают состояние устьиц подсолнечника аналогично примеру 1, только в качестве материала пластинки используют медную фольгу толщиной 300 мкм, имеющую одну прорезь площадью 8,5 мм², наносят раствор полимера в органическом растворителе (нитроцеллюлоза - 5% вес. + ацетон - 95% вес.), сушат при комнатной температуре 3-7 минут, переносят пластинку из медной фольги с полимерной пленкой на предметное стекло, фиксируют объект покровным стеклом и микроскопируют вначале при малом (160х), а затем при большом увеличении (600х).

Кратность повторения примера - 50 раз.

Пригодные полимерные пленки для оценки состояния устьиц методом микроскопирования составляют - 52,0%. Полученные данные приведены в таблице.

Пример 13. Изучают состояние устьиц подсолнечника аналогично примеру 1, только в качестве материала пластинки используют полиэтилен толщиной 300 мкм, имеющую одну прорезь площадью 160 мм², наносят раствор полимера в органическом растворителе (нитроцеллюлоза - 5% вес. + ацетон - 95% вес.), сушат при комнатной температуре 3-7 минут, переносят пластинку из медной фольги с полимерной пленкой на предметное стекло, фиксируют объект покровным стеклом и микроскопируют вначале при малом (160х), а затем при большом увеличении (600х).

Кратность повторения примера - 50 раз.

Пригодные полимерные пленки для оценки состояния устьиц методом микроскопирования составляют - 48,0%. Полученные данные приведены в таблице.

Пример 14. Изучают состояние устьиц подсолнечника аналогично примеру 1, только в качестве материала пластинки используют бумагу толщиной 15 мкм, имеющую пять прорезей площадью 8,5 мм² каждая и пять прорезей площадью 160 мм² каждая, наносят раствор полимера в органическом растворителе (полиметилметакрилат - 10% вес. + хлороформ - 90% вес.), сушат при комнатной температуре 5-10 минут, переносят пластинку из бумаги с полимерными пленками на предметное стекло, фиксируют объект покровным стеклом и микроскопируют вначале при малом (160х), а затем при большом увеличении (600х).

Кратность повторения примера - 50 раз.

Пригодные полимерные пленки для оценки состояния устьиц методом микроскопирования составляют - 60,0%. Полученные данные приведены в таблице.

Пример 15. Изучают состояние устьиц подсолнечника аналогично примеру 1, только в качестве материала пластинки используют фторопласт толщиной 300 мкм, имеющую пять прорезей площадью 8,5 мм² каждая и пять прорезей площадью 160 мм² каждая, наносят раствор полимера в органическом растворителе (полиметилметакрилат - 10% вес. + хлороформ - 90% вес.), сушат при комнатной температуре 5-10 минут, переносят пластинку из фторопласта с полимерными пленками на предметное стекло, фиксируют объект покровным стеклом и микроскопируют вначале при малом (160х), а затем при большом увеличении (600х).

Кратность повторения примера - 50 раз.

Пригодные полимерные пленки для оценки состояния устьиц методом микроскопирования составляют - 56,0%. Полученные данные приведены в таблице.

Из данных, приведенных в таблице видно, что предлагаемый способ выгодно отличается от известного (способа-прототипа) тем, что достигается повышение качества подготовки растительного объекта к изучению состояния устьиц, сокращается время приготовления полимерной пленки, а также снижается интенсивность химического ожога на поверхности растительного материала за счет ограничения поверхности растительного объекта, контактируемого с органическим растворителем.

Достоверность полученных результатов доказана высокой кратностью (50 раз) повторения каждого из приведенных примеров.

Кроме того, по предлагаемому способу в 2,7-3 раза улучшается качество подготовки растительного объекта к изучению состояния устьиц.

Использование для реализации предлагаемого способа химических продуктов (полимеры, органические растворители) делает его доступным для реализации в лабораториях физиологии растений различного уровня.

Предложенный способ оценки состояния устиц растительного объекта иллюстрируется фиг.1-5.

Фиг.1. Варианты пластинок с прорезями для получения полимерной пленки, согласно заявленному изобретению.

Фиг.2. Состояние листовой пластины подсолнечника (Helianthus annuus) после воздействия раствором полимера (нитроцеллюлоза + ацетон 5 вес.% + 95 вес.%).

Фиг.3. Микрофотография полимерной пленки с поверхности растительного объекта (Helianthus annuus) сформирована согласно способу-прототипу (раствор нитроцеллюлозы + ацетон 5 вес.% + 95 вес.%) увеличение -600х.

Фиг.4. Вариант техники снятия отпечатков с растительного объекта (Helianthus annuus) согласно предлагаемому способу (материал пластинки - бумага толщиной 100 мкм, число прорезей в пластинке 6 штук, площадь каждой прорези 75 мм².

Фиг.5. Микрофотография полимерной пленки с поверхности растительного объекта (Helianthus annuus) сформирована согласно предлагаемому способу (раствор нитроцеллюлозы + ацетон 5 вес.% + 95 вес.%, материал пластинки - бумага толщиной 100 мкм, прорезь площадью 75 мм², увеличение -600х).

Способ может быть использован в лабораторной практике исследования растительного объекта, в частности при изучении состояния устьиц в процессе варьирования напряженностью внешних факторов. Согласно предложенному способу перед нанесением на поверхность растительного объекта раствора полимера в органическом растворителе на поверхности растительного объекта размещают пластинку. Пластинка имеет по крайней мере одну прорезь площадью 10-120 мм² для заливки раствора полимера в органическом растворителе. Затем осуществляют испарение растворителя, снятие и перенос полимерной пленки с оттиском поверхности растительного объекта на предметное стекло, фиксирование его под покровным стеклом и изучение под микроскопом состояние устьиц. Способ обеспечивает повышение качества отпечатков растительного объекта и высокий процент их пригодности для оценки состояния устьиц. 4 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл.

1. Способ подготовки растительного объекта к изучению состояния устьиц, включающий нанесение на поверхность растительного объекта раствора полимера в органическом растворителе, испарение растворителя, снятие и перенос полимерной пленки с оттиском поверхности растительного объекта на предметное стекло, фиксирование его покровным стеклом и изучение под микроскопом состояния устьиц, отличающийся тем, что перед нанесением на поверхность растительного объекта раствора полимера в органическом растворителе на поверхность растительного объекта в зоне, подлежащей обработке раствором полимера, размещают пластинку, имеющую, по крайней мере, одну прорезь площадью 10-120 мм² для заливки раствора полимера в органическом растворителе.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что пластинка дополнительно снабжена кромкой, расположенной перпендикулярно либо под углом к растительному объекту, и служит для удаления пластинки совместно с полимерной пленкой с поверхности растительного объекта.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что пластинка, имеющая прорезей более одной, имеет прорези равной или различной площади.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве материала пластинки используют бумагу, кальку, металлическую фольгу или тонкий полимерный материал, не взаимодействующий с органическими растворителями полимера, толщиной 25-250 мкм.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве полимера для формирования полимерной пленки с оттиском поверхности растительного объекта используют нитроцеллюлозу или полиметилметакрилат, а в качестве органического растворителя - вещества, выбранные из группы: ацетон, дихлорэтан, хлороформ, диэтиловый эфир, либо их смесь.