ЗАКЛЮЧАЮЩАЯ СРЕДА ДЛЯ СВЕТОВОГО МИКРОСКОПИРОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ И ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ МИКРОПРЕПАРАТОВ Российский патент 2019 года по МПК G01N1/28 

Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно к технике микроскопирования и подготовке образцов для исследования бактериологических препаратов и гистологических образцов тканей, взятых у человека или животных при хирургических вмешательствах.

В настоящее время рутинно используется в качестве заключающей среды для приготовления постоянных микропрепаратов так называемый Канадский бальзам. Так же используются среды на основе акрила и ксилола (гистологическая техника) и безксилольные среды иностранного производства.

Канадский бальзам чувствителен к температурному фактору и колебаниям влажности. Нередки случаи кристаллизации бальзама при длительном или кратковременном хранении постоянных препаратов. Длительный срок затвердевания бальзама ограничивает применение препаратов через короткий промежуток времени после их изготовления, затрудняет их хранение и транспортировку. Ксилольные среды в составе сред для заливки препаратов используются вещества (например ксилол) наличие которых не допускает использования микропрепаратов на уроках детьми, из за вредных воздействий на здоровье человека. Так же ксилольные среды вступают в взаимодействие с микробиологическими препаратами. Безксилольные среды отличаются очень высокой ценой.

Известен состав для заключения гистологических препаратов, включающий синтетическую смолу, растворитель и вспомогательный компонент. В качестве смолы (Пенополиуретан, это пластмасса, не смола) берут пенополиуретан (ППУ), в качестве растворителя - ксилол и вспомогательного компонента - дибутилфталат / Патент Ru 2499988, G01N 1/28, 27.11.2013/. К недостатки данного решения относится следующее.

Данная технология не подходит для изготовления бактериологических препаратов. Требует использования специального оборудования, вытяжных шкафов. В составе присутствует ксилол и дибутилфталат, что является ограничением для использования в учебном процессе, например в школах. Из-за очень короткого времени застывания, становится невозможной корректировка при заливке.

Невозможность устранения дефектов (пузырьки воздуха) нагреванием. Недостаточное (по описанию авторов - удовлетворительное) просветление, делает менее качественным и комфортным микроскопирование препаратов.

Известен также способ для обезвоживания и фиксации биологического материала, при котором используют ацетон в присутствии обезвоженного хлорида кальция, взятого в количестве 10-12% от массы биологического материала. В качестве пластин для закрепления гистологических срезов используют пластины из ламинационных пленок, а защитную среду создают путем закатки гистологических срезов между пластинами из ламинационных пленок с полимерным клеем, предназначенными для холодного ламинирования /Патент Ru 2613175, G01N 1/28, опубл. 15.03.2017/.

При рассмотрении данной технологии были выявлены следующие минусы.

Ацетон является токсичным веществом, следовательно, для изготовления препаратов с его использованием необходим вытяжной шкаф. Время работы при этом также ограничено.

Технология применима только для гистологических препаратов.

Ламинирование требует наличия ламинатора. Также очень важно достижение герметичности склеиваемых слоев пленки.

Пленка для ламинирования, даже двуслойная, слишком тонкая и мягкая. Возникает вопрос об удобстве микроскопирования на разных моделях микроскопов с разными механизмами фиксации препарата.

Отсутствие твердой основы, вопреки заявлению авторов, можно тоже отнести к недостаткам. С одной стороны, гибкие препараты не бьются. Но возникает проблема «перегибов» - препарат может быть согнут, после чего в месте перегиба изменяется его прозрачность, да и сам препарат трудно фиксировать для просмотра.

Пленка для ламинирования при своей упругости способна деформироваться при механическом воздействии: возникают полосы, вдавления, царапины, разрывы, снижающие качество препарата.

При использовании во время учебного процесса, например в школах, заламинированный препарат будет поврежден учащимися во время работы с ним.

Для изготовления бактериальных препаратов данная технология неприменима, так как требует подготовки с использованием ацетона, который будет изменять цвет микропрепарата, что в свою очередь делает невозможным дальнейшее использование препарата.

Еще одна причина, по которой данная технология не подходит для изготовления бактериальных препаратов кроется в технологии изготовления: фиксация материала производится нагревом над пламенем спиртовки или применением достаточно активных химических агентов, высушивание мазка, зачастую, также не обходится без нагрева. Маловероятно, что пленка сохранит свои структуру и свойства после таких воздействий. Даже при отказе от использования термической фиксации клей на внутренних поверхностях слоев пленки можем изменить свои свойства или вообще их потерять.

Известна среда для заключения гистологических срезов на основе раствора пенопласта в ксилоле с добавлением диметилфталата (патент №2117273, G01N 1/28, от 10.08.1998).

Недостатками данной среды является то, что указанная среда категорически не подходит для изготовления бактериальных микропрепаратов. При нагревании происходит выделение формалина, что требует использования специально оборудованных лабораторий и вытяжных шкафов. При массовом использовании без покровных стекол он выделяется в окружающий воздух, что делает невозможным работу с препаратами в школах и ВУЗах, не оборудованных специальными лабораториями Пленка легко отделяется от предметного стекла, что делает препараты неудобными в использовании, особенно при микроскопировании. Возможны смещения препарата во время перемещения предметного столика микроскопа

Невозможность использования техники иммерсионного микроскопирования. Поскольку иммерсионная среда наносится непосредственно на микропрепарат, он должен быть покрыт инертным материалом в обязательном порядке.

Очень высокая плотность пластификатора. Отказ от использования покровного стекла, снижает устойчивость препарата к внешним воздействиям, страдает объективность оценки микропрепарата.

Так же, из-за отказа от использования покровного стекла, поверхность препарата получается немного линзообразной, что влечет аберрации при микроскопировании на больших увеличениях.

Из-за использования диметилфталата, и ксилола, среда является нефротоксичной и нейротоксичной, что ограничивает использование препаратов в учебном процессе.

Следует также отметить необходимость создания для хранения препаратов определенных условий, трудность упаковки и транспортировки. Данное решение выбрано в качестве прототипа.

Таким образом, техническая проблема, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в невозможности использовании существующих сред для приготовления изготовления бактериальных микропрепаратов (микроорганизмы, бактерии, простейшие). Указанные решения разрабатывались для гистологической микроскопии (ткани организма, кусочки органов). Данные среды приводят к ухудшению оптических свойств изготовленных образцов, кристаллизации. Техническим результатом предлагаемого изобретения является улучшение оптических свойств микропрепаратов, сокращение времени их полимеризации, оптимизация режимов хранения микропрепаратов.

Для решения указанной технической проблемы и достижения заявленного технического результата предлагается среда для заключения микропрепаратов, содержащая смолу и отвердитель. Отличительной особенностью среды является то, что в качестве смолы используется эпоксидная смола, и краситель, при следующем соотношении компонентов, масс. %:

Смола CHS Ероху 520 от 39.925 до 69.925% Отвердитель 921 (ОП) от 30.000 до 60.000% Краситель от 0.060 до 0.090%

В качестве красителя используется состав, включающий фуксин - солянокислый розанилин, метиловый фиолетовый, сульфат железа(II), щавелевую кислоту при следующем соотношении компонентов, масс. %:

Фуксин-солянокислый розанилин от 30 до 40% метиловый фиолетовый от 40 до 50% сульфат железа(II) от 5 до 15% щавелевую кислоту от 5 до 15%.

Заявленная среда может использоваться для изготовления бактериальных и гистологических препаратов.

Технология получения среды для заключения микропрепаратов следующая.

Смешивается смола и отвердитель, перемешиваются ручным способом с помощью шпателя, в стеклянной посуде нагретой до 40-45°С. Из полученной смеси ручным способом (металлическая иголка) или с помощью центрифугирования удаляются воздушные пузыри, образовавшиеся при смешивании. Краситель добавляется в отвердитель нагретый до 40 С и перемешивается до исчезновения видимости (до перемешивания отвердителя со смолой).

Через 5-7 минут после перемешивания, на предметное стекло с подготовленным (окрашенным и высушенным) препаратом наносится приготовленная заключающая среда. Предметное стекло устанавливается над источником тепла с температурой 50-60°С (вертикальный обогреватель, лабораторная горелка) наносится заключающая среда (каплей со шпателя, или при помощи шприца) и накрывается покровным стеклом, под действием температуры заключающая среда становится более текучей и самостоятельно растекается по препарату в пределах покровного стекла. Далее препарат помещается в комнатную температуру и оставляется до полной полимеризации (20-24 часа).

Далее приводятся конкретные примеры реализации изобретения и фигуры.

Фиг. 1 Фотография Proteus vulgaris, промышленный способ (состав среды неизвестен).

Фиг. 2 Фотография Proteus vulgaris (препарат с использованием представленной заключающей среды)

Фиг. 3 Гистологический препарат (фрагмент аппендикса), увеличение X125

Фиг. 4 Гистологический препарат (фрагмент аппендикса), увеличение Х500

Пример 1.

Для изготовления микропрепарата использовался следующий состав:

Смола CHS Ероху 520 39.925%; Отвердитель 921 (ОП) 60.000%; Краситель 0.075%

При таком соотношении компонентов срок отвердения составляет до 10 часов. Заключающая среда твердая, на поверхности не остается следов механического воздействия. Одновременно среда достаточно хрупкая. В данном примере наиболее выражено и длительно сохраняется прозрачность.

Наиболее высокие результаты были получены при изготовлении бактериальных микропрепаратов. Готовое изделие сравнивалось с микропрепаратами фирмы 3BScientific. Несмотря на использование достаточно дешевой и простой технологии изготовления, микропрепараты не уступали по качеству зарубежному оппоненту

Пример 2.

Для изготовления микропрепарата использовался следующий состав:

Смола CHS Ероху 520 54.925%; Отвердитель 921(ОП) 45.000%; Краситель 0.075%

Заключающая среда оптимально сбалансирована для заливки бактериальных препаратов. Время отвердения 15-20 часов. Вязкость оптимальна для прилегания покровного стекла. Минимально количество оптических дефектов. Наиболее стабильная при микроскопировании бактериальных микропрепаратов.

Пример 3.

Для изготовления микропрепарата использовался следующий состав:

Смола CHS Ероху 520 69.925%; Отвердитель 921(ОП) 30.000%; Краситель 0.075%.

При данном соотношении время отвердения увеличивается до 24 часов. Данная среда подходит для изготовления микробиологических препаратов, при механических воздействиях на поверхности среды, выступающей из-под покровного стекла, остаются дефекты.

Пример 4.

В сравнении с бактериальными препаратами, изготовленными на производстве, данная заключающая среда, при добавлении красителя (фуксин-солянокислый розанилин от 30 до 40%; метиловый фиолетовый - от 40 до 50%; сульфат железа(II) - от 5 до 15%; щавелевую кислоту - от 5 до 15%) показывает улучшение оптических свойств при микроскопировании бактериальных препаратов.

В качестве примера представлены фотографии микроорганизма Proteus vulgaris. На фигуре 1-Proteus vulgaris, промышленный способ (состав среды неизвестен), на фиг.. 2 Proteus vulgaris (препарат с использованием представленной заключающей среды)

Фотографии выполнены на одном оборудовании (что подтверждает дефект линзы в центре). Более четко видны нижележащие слои в зоне расфокуссировки.

Пример 5.

Проведенные исследования, показали что при использовании заявленной среды время полимеризации сокращается с 2-7 суток до 10-20 часов (таблица 1).

Пример 6.

Предлагаемая заключающая среда является заменой канадскому бальзаму, при изготовлении гистологических микропрепаратов.

Для изготовления микропрепарата использовался следующий состав:

Смола - 59,940%

Отвердитель - 40,000%

Краситель - 0,060%

Более доступные компоненты, меньшие требования среды к условиям хранения, отсутствие необходимости применения токсичных растворителей, меньший срок, и наличие полного отвердения (полимеризации), безопасность готовых препаратов, меньшая требовательность готовых препаратов к условиям хранения, высокая стойкость к воздействию солнечного света и колебаниям температур, отсутствие потери качества с течением времени, высокое качество готовых микропрепаратов. Это отличает данную среду от рутинно используемых, и позволяет повысить удобство применения заключающей среды и качество готовых микропрепаратов.

Применение красителя в составе среды обеспечивает эффект просветления, что в свою очередь повышает качество готового изделия.

Также следует отметить, что при отвердении заключающей среды формируется нечто наподобие триплекса из предметного и покровного стекол а также среды между ними, что повышает ударостойкость и механическую прочность микропрепаратов.

Изготовленные гистологические микропрепараты, имеют высокое качество, как видно на рисунках фиг. 3 и 4.

Данный вариант с меньшей концентрацией красителя, более подходит для микроскопирования заранее окрашенных метиленовым синим препаратов, или более базофильных структур.

Пример 7.

Для изготовления микропрепарата использовался следующий состав:

Смола CHS Ероху 520 54.925%; Отвердитель 921 (ОП) 45.000%; Краситель 0.075%

Таким образом, использование изобретения, по сравнению с известными решениями той же задачи, позволяет изготавливать постоянные микропрепараты высокого качества, с хорошими оптическими свойствами благодаря использованию отвердителя с маркировкой (ОП-оптический, коэффициент преломления 1.50-1.55.) Постоянные микропрепараты изготовленные по такой технологии, не склонны желтеть. Данная заключающая среда не изменяет цвета, и свойств подготовленных биологических объектов, и не требует многоэтапной сложной предварительной подготовки объектов к заливке. Очень существенным моментом является возможность использования микропрепаратов уже через 20 часов после приготовления. Добавление красителя в состав среды позволяет получить эффект просветления, что положительно отражается на качестве прозрачности препарата. Немаловажна стоимость заключающей среды, которая ниже аналогов. Так же среда после полимеризации является нетоксичной, что позволяет использовать изготовленные с помощью данного изобретения препараты в учебном процессе без применения дополнительных средств защиты глаз и органов дыхания школьников и студентов.

Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно к технике микроскопирования и подготовки образцов для исследования бактериологических препаратов и гистологических микропрепаратов. Описана среда для заключения микропрепаратов, содержащая смолу и отвердитель, в которой в качестве смолы используется эпоксидная смола, а также состав красителя из фуксина, метилового фиолетового, сульфата железа, щавелевой кислоты, при следующем соотношении компонентов, масс. %: смола CHS Ероху 520 от 39,925 до 69,925, отвердитель 921(ОП) от 30,000 до 60,000, краситель (солянокислый розанилин, метиловый фиолетовый, сульфат железа, щавелевая кислота) от 0,060 до 0,090. Технический результат заключается в улучшении оптических свойств микропрепаратов, сокращении времени их полимеризации, оптимизации режимов хранения микропрепаратов. 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 7 пр.

1. Среда для заключения микропрепаратов, содержащая смолу и отвердитель, отличающаяся тем, что в качестве смолы используется эпоксидная смола, а также среда включает краситель из фуксина - солянокислого розанилина, метилового фиолетового, сульфата железа(II), щавелевой кислоты, при следующем соотношении компонентов, масс. %:

Смола CHS Ероху 520 от 39.925 до 69.925 Отвердитель 921 (ОП) от 30.000 до 60.000 Краситель (фуксин - солянокислый розанилин, метиловый фиолетовый, сульфат железа(II), щавелевая кислота) от 0.060 до 0.090

2. Среда по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве красителя используется состав, включающий фуксин - солянокислый розанилин, метиловый фиолетовый, сульфат железа(II), щавелевую кислоту, при следующем соотношении компонентов, масс. %:

Фуксин - солянокислый розанилин от 30 до 40 Метиловый фиолетовый от 40 до 50 Сульфат железа(II) от 5 до 15 Щавелевая кислота от 5 до 15

3. Среда по п. 1, отличающаяся тем, что может использоваться для изготовления бактериальных и гистологических препаратов.