ВАКЦИННЫЙ ПРЕПАРАТ ПРОТИВ КОЛИБАКТЕРИОЗА Российский патент 2009 года по МПК A61K39/108 A61P31/04 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к птицеводству, а именно к вакцинным препаратам против инфекционных заболеваний, а именно против колибактериоза.

Колибактериоз (колисептицемия, колиинфекция, эшерихиоз) - энзоотическая септическая болезнь различных видов домашних птиц (преимущественно кур, уток, гусей), вызываемая патогенными типами кишечной палочки различных серологических групп. Клинически колибактериоз проявляется угнетением, потерей аппетита, диареей, затрудненным дыханием, хрипами или прекращением яйцекладки. При патологоанатомическом вскрытии отмечают перикардит, перигепатит, аэросаккулит, сальпенгит, овариит, перитонит. Болезнь наносит существенный экономический ущерб птицеводству.

В настоящее время для профилактики и лечения инфекционных заболеваний широко используются антибиотики, сульфаниламидные, нитрофурановые и различные комплексные препараты. В частности, для профилактики и лечения колибактериоза рекомендуются окситетрациклин, тетрациклин, биовит, левомицитин, тетрахлорид, сульфагин, фтазин, биофузол и ряд других препаратов (Ветеринарные препараты: Справочник / Сост. Л.П.Маланин и др. М., Агропромиздат, 1988, с.5-33; Романов Е.А. Биологические ветеринарные препараты в России: вакцины, сыворотки, диагностикумы: Справочник. - Издательство: К.: РУТЕН, 2005, с.636).

Недостатками большинства препаратов является невысокая эффективность, особенно для решения профилактических задач, большое число противопоказаний, высокая себестоимость препаратов.

В профилактике колибактериоза основную роль играет строгое выполнение комплекса организационно-хозяйственных, зоогигиенических и ветеринарно-санитарных мероприятий, однако важная роль отводится специфической профилактике. При этом наиболее эффективным способом борьбы с ветеринарными инфекциями является вакцинация поголовья зараженного стада.

В настоящее время известно значительное количество живых и инактивированных вакцин, как правило, моно- или двухвалентных, предназначенных для профилактики отдельных инфекционных заболеваний, таких как болезнь Ньюкастла, реовирус птиц и т.д. (ЕР 0100752; ЕР 0044920; US 4515777; US 4302444; Н.Г.Рыбальский, B.C.Романова и др. Вакцины как объект изобретения, М., ВНИИГПЭ, 1988, с.110-229). Более удобные поливалентные вакцинные препараты, обеспечивающие защиту поголовья одновременно от нескольких вирусных заболеваний, не нашли пока широкого применения, т.к. создание таких препаратов весьма трудоемко в связи с необходимостью учета взаимодействия как самих компонентов вакцин, так и антител, возникающих в организме вакцинированного животного или птицы при их введении.

В частности, известна вакцина против колибактериоза птиц (SU 1792330), получаемая культивированием штамма Escherichia coli (E.coli) с последующей инактивацией клеток ацетоном и выделением полученного осадка. Недостатком вакцины является ее невысокая эффективность и высокая вероятность заражения птиц выжившими клетками бактерий.

Наиболее близкой к заявляемой вакцине по составу и достигаемому эффекту является инактивированная вакцина (ТУ 10-19.68-89), представляющая собой мелкодисперсную суспензию белого цвета, содержащую инактивированные формалином бактерии Escherichia coli серотипа 078 в смеси с адъювантом на основе гидроокиси алюминия (ГОА формолвакцина). Вакцинацию проводят методом однократной инъекции в грудную или бедренную мышцу в объеме 0.5 мл всем здоровым птицам в возрасте 28-32 дней.

Недостатками данной вакцины являются недостаточно высокие антигенная и иммуногенная активности, а также возможность возникновения воспалительных реакций на месте ее введения с последующим развитием гранулем и абсцессов.

Технической задачей, решаемой в рамках настоящего изобретения, являлось создание более эффективной вакцины против колибактериоза.

Технический результат достигался созданием вакцины, представляющей собой композицию, содержащую в жидком виде следующие ингредиенты, мас.%:

аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ)0,5-3,0;липосомообразующая смесь (ЛОС)7,3-15,0;суспензия инактивированных бактерий Е.coli серотипа 07882,0-91,5.

Дополнительно препарат, предназначенный для дальнейшей сушки, может содержать хлороформ или иной растворитель.

Получаемый вакцинный препарат представляет собой суспензию липосом, содержащих смесь инактивированного антигена к бактерии Escherichia coli штамм №389 (078) с аминоэтилэтиленимином, заключенный в липосомальную везикулу. Вместо штамма Е.coli №389 (078) может быть использован и другой штамм Е.coli, вызывающей колибактериоз.

В основе заявляемой новой вакцины было заложено предположение, что при обработке бактериальных клеток аминоэтилэтиленимином удается, с одной стороны, исключить наличие в вакцине живых микроорганизмов, а с другой стороны, обеспечить за счет разрушения клеток повышение содержания в суспензии антигена, что повышает ее эффективность. Вместе с тем, введение в композицию липосом обеспечивает помещение активного материала в везикулу, разрушающуюся непосредственно в организме животного, что обеспечивает максимальную концентрацию антигена в зоне введения и соответственно повышенную выработку антител организмом вакцинируемой птицы.

Использование АЭЭИ в концентрации менее 0.5 мас.% снижает эффективность вакцины и повышает опасность наличия в ней живых бактерий, обеспечивает повышение концентрации более 3%, не влияя на концентрацию антигена, делает вакцину более токсичной.

Природа используемых ЛИС на выработку антител практически не влияет. Так, в качестве ЛИС использовали промышленно выпускаемые как индивидуальные фосфолипиды, так и их смеси, полученные из растительного, животного или биотехнологического сырья; смесь фосфолипидов и сухих наполнителей (сахаров, полиолов, солей) по технологии, описанной в RU 2130771, или смесь, содержащую фосфолипиды, с 10-12% сахаров и 1-3% водорастворимых полимеров, ранее использованную в патенте авторов (RU 2169581, RU 012968). Природа используемых липосом на выработку антител практически не влияет.

Содержание ЛИС в концентрации более 15 мас.% повышает вязкость препарата, в концентрации менее 7,3% не обеспечивает полноту помещения антигена в везикулу и ухудшает его стабильность при хранении.

Вакцинация птиц с использованием заявляемой вакцины заключается во введении вышеупомянутой липосомальной вакцины в организм птицы парентерально, внутримышечно в грудную или бедренную мышцу.

Как правило, показанием к применению вакцины служит неблагополучие хозяйства по вышеназванным инфекциям. Вакцинируют всю клинически здоровую птицу в возрасте 28-32 дней. Препарат вводят внутримышечно в грудную или бедренную мышцу в дозе 0,5 мл на 1 голову.

Сущность и практическая применимость заявляемых изобретений иллюстрируются следующими примерами.

ПРИМЕР 1. Вакцину готовили по следующей методике. 0.45 л суспензии клеток Escherichia coli штамм №389 (078) с концентрацией 2×10¹⁰ КОЕ/см³, полученной из ВГНКИ, смешивали при температуре 37°С в режиме постоянного перемешивания с 50 мл 20% раствора АЭЭИ в течение 20 мин. Полученный препарат содержал антигены и не содержал жизнеспособных клеток бактерий.

20 мл препарата, содержащего антигены, смешали с 2.0 г суммарных фосфолипидов растительного лецитина, 0.5 г бутилоксианизола и 0.5 г лактозы. Смесь гомогенизировали в течение 10 минут при скорости вращения 700g и температуре смеси 22-24°С.

Жидкая вакцина в 1 мл содержала 1.5×10¹⁰ клеток Escherichia coli штамм №389 (078); 0.002 г АЭЭИ, 0,14 г ЛОС.

Пример 2. Вакцину готовили по следующей методике. 0.475 л суспензии клеток Escherichia coli штамм №389 (078) с концентрацией 2×10¹⁰ КОЕ/см³, полученной из ВГНКИ, смешивали при температуре 37°С в режиме постоянного перемешивания с 25 мл 20% раствора АЭЭИ в течение 20 мин. Полученный препарат содержал антигены и не содержал жизнеспособных клеток.

20 мл суспензии, содержащей антигены, 1.2 г суммарных фосфолипидов из семян подсолнечника, 0.8 г сорбита и 5.0 г хлороформа, помещали в герметически закрывающуюся емкость объемом 30 см, при температуре 37°С. Сушку проводили при вакуумировании в течение 1 часа, при температуре 37°С и постоянном перемешивании со скоростью 50 об/мин. В результате было получено 2.1 г сухого мелкодисперсного порошка с влажностью 0.7%, содержащего 2×10¹¹ клеток Escherichia coli штамм №389 (078); 0.2 г АЭЭИ, 1,8 г ЛОС.

Для вакцинации 0.5 г липосомального препарата растворяли в 10 мл дистилированной воды.

Пример 3. Вакцину готовили по следующей методике. 1.0 л суспензии клеток Escherichia coli штамм №389 (078) с концентрацией 2×10¹⁰ КОЕ/см³, полученной из ВГНКИ, смешивали при температуре 37°С в режиме постоянного перемешивания с 150 мл 20% раствора АЭЭИ в течение 20 мин. Полученный препарат содержал антиген и не содержал жизнеспособных бактерий.

20 мл препарата, содержащего антигены, смешали с 1.0 г суммарных фосфолипидов из семян подсолнечника, 0.6 г сорбита и 5.0 г хлороформа в герметически закрывающейся емкости объемом 150 см, при температуре 37°С. Емкость закрыли, откачали воздух до достижения вакуума 0.3 атм и выдерживали смесь в течение 1 часа при температуре 37°С и постоянном перемешивании со скоростью 50 об/мин. В результате было получено 15 мл концентрата, содержащего 2.0 г липосомальных везикул.

К 100 объемам концентрата липосомальных везикул антигенов добавляли 5 объемов 20% водного раствора желатины и 50 объемов 20% раствора сахарозы. Полученную смесь тщательно перемешивали и разливали в поддоны слоем толщиной 3.0-10.0 мм, закрывали крышками и переносили на полки сублимационной камеры. Материал замораживали до температуры - 30-40°С и выдерживали при этой температуре 2-3 часа, после чего камеру вакуумировали при 120-130 мм рт.ст. В дальнейшем полки нагревали до +24°С со скоростью 4 град/час. Общее время высушивания составляло 42-46 часов. Для вакцинации 0.5 г липосомального препарата растворяли в 10 мл дистилированной воды.

ПРИМЕР 4. Вакцину готовили по методике примера 1. 0.43 л суспензии клеток Escherichia coli штамм №389 (078) с концентрацией 2×10¹⁰ КОЕ/см³, полученной из ВГНКИ, смешивали при температуре 37°С в режиме постоянного перемешивания с 70 мл 25% раствора АЭЭИ в течение 20 мин. Полученный препарат содержал антигены и не содержал жизнеспособных клеток бактерий.

20 мл препарата, содержащего антигены, смешали с 2.3 г суммарных фосфолипидов растительного лецитина, 0.6 г бутилоксианизола и 0.6 г лактозы. Смесь гомогенизировали в течение 10 минут при скорости вращения 700 g и температуре смеси 22-24°С, после чего использовали для вакцинации.

ПРИМЕР 5. Вакцину готовили по методике примера 1. 0.489 л суспензии клеток Escherichia coli штамм №389 (078) с концентрацией 2×10¹⁰ _{КОЕ/см³ , полученной из ВГНКИ, смешивали при температуре 37°С в режиме постоянного перемешивания с 11 мл 25% раствора АЭЭИ в течение 20 мин. Полученный препарат содержал антигены и не содержал жизнеспособных клеток бактерий.}

20 мл препарата, содержащего антигены, смешали с 1.2 г суммарных фосфолипидов растительного лецитина, 0.3 г бутилоксианизола и 0.3 г лактозы. Смесь гомогенизировали в течение 10 минут при скорости вращения 700 g и температуре смеси 22-24°С, после чего использовали для вакцинации.

Состав полученных вакцинных препаратов (без учета его изменения при сушке) приведен в таблице 1.

Таблица 1Состав жидких вакцинных препаратовПримерСодержание ингредиентов в жидкой смеси, мас.%АЭЭИЛОССуспензияСодержание клеток Е.coli11,813,884,41.5×10¹⁰20.6* (0.9)7.5* (10,7)74,0* (88,4)1.4×10¹⁰32.0* (2.4)6.0* (7.3)73,2* (90,3)1.3×10¹⁰43.015.082,01.5×10¹⁰50.58.091,51.5×10¹⁰* концентрация с учетом присутствия в смеси хлороформа

Пример 6. Вакцину использовали для профилактики колибактериоза птиц в условиях опытной базы Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины. Препарат вводили внутримышечно в грудную или бедренную мышцу в дозе 0,5 мл на 1 голову.

Вакцину проверяли на безвредность антигенную и иммуногенную активность. Напряженность поствакцинального иммунитета определяют через 7, 28, 45, 60, 90 суток после прививки в реакции агглютинации. Полученные результаты испытаний представлены в таблицах 2-4.

Таблица 2Оценка места введения вакцины против колибактериоза по примеру 1 через 10 суток после инъекции.№№ВакцинаРезультаты исследованийСтепень пораженияСледы вакциныГранулемыОтечность1Липосомальная вакциналегкаяНе обнаруженоНе обнаружено202ГОА Формолвакцинасредняя60Не обнаружено40

Таблица 3Оценка места введения вакцины против колибактериоза по примеру 1 через 90 суток после инъекции.№№ВакцинаВидимые изменения в местах введения вакцин,%Степень пораженияБез видимых измененийНезначит. кол-во. вакциныФибрин1Липосомальная вакциналегкаяне обнаруженоне обнаруженоне обнаружено2ГОА Формолвакцинасредняя4060не обнаружено

Таблица 4.Уровень специфических антител в сыворотке крови вакцинированных цыплят (титры антител в log₂(M±m)).№№ГруппыДни исследований после иммунизации7284560901Липосомальная вакцина по прим. 16,1±0.29,5±0,39,9±0,29,8±0,19,8±0,22Липосомальная вакцина по прим.25,8±0.29,6±0,39,8±0,29,6±0,19,6±0,23Липосомальная вакцина по прим.36,0±0.29,3±0,39,6±0,29,1±0,19,1±0,24Липосомальная вакцина по прим.46,0±0.29,7±0,39,7±0,29,6±0.39,3±0,45Липосомальная вакцина по прим.55,9±0.29,0±0,49,2±0,29,0±0,19,1±0,26ГОА формолвакцина5,4±0,57,7±0,57,4±0.57,2±0,46,8±0,37Контрольне обнаруженоне обнаруженоне обнаружено0,5±0,10,7±0,1

Как следует из приведенных результатов, вакцинный препарат безвреден для птицы, обладает выраженной антигенной и иммуногенной активностью.

Изобретение относится к области биотехнологии. Вакцинный препарат содержит инактивированные бактерии Escherichia coli штамм №389 (078) и вспомогательные вещества. Дополнительно препарат содержит аминоэтилэтиленимин, а в качестве вспомогательных веществ липосомообразующую смесь при следующем соотношении ингредиентов в жидкой форме, мас.%: аминоэтилэтиленимин - 0,5-3; липосомообразующая смесь - 7,3-15; суспензия инактивированных бактерий Escherichia coli серотипа 078-82,0-91,5. Препарат безвреден для птицы, обладает повышенной антигенной и иммуногенной активностью. 2 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Вакцинный препарат против колибактериоза, содержащий в своем составе инактивированные бактерии Escherichia coli штамм №389 (078) и вспомогательные вещества, отличающийся тем, что он дополнительно содержит аминоэтилэтиленимин, а в качестве вспомогательных веществ липосомообразующую смесь при следующем соотношении ингредиентов в жидкой форме, мас.%:

аминоэтилэтиленимин0,5-3липосомообразующая смесь7,3-15суспензия инактивированных бактерий Escherichia coli серотипа 07882,0-91,5