СТАБИЛИЗАТОР ВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 1996 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к области прикладной биотехнологии и может быть использовано в медицине и сельском хозяйстве для получения вакцинных, инсектицидных и других биопрепаратов, содержащих живые вирусы, хранения производственных и музейных штаммов и т.д.

В настоящее время для хранения препаратов, содержащих живые вирусы, используют методы замораживания и высушивания вируссодержащих материалов.

Недостатками этих методов являются частичная потеря активности препаратов, высокая вероятность бактериальной контаминации.

Наиболее близким к заявляемому является способ с использованием химических добавок. В качестве добавок использовались хлорид натрия, глицин, альбумин, желатин, формальдегид, мальтоза и антибиотики.

Недостатком данных стабилизирующих добавок является низкая эффективность (мальтоза), инактивация вирусов (фенол, формальдегид), слабая защита от контаминации бактерий и грибов (глицин, мальтоза).

Задачей, стоявшей перед авторами, являлось создание стабилизатора, способность сочетать антиконтаминационную и стабилизирующую эффективность.

Указанная цель достигается использованием в качестве стабилизатора смеси холестеринсодержащего продукта с химическим агентом тиомерсалом (натриевой солью этилмеркуртиосалициловой кислоты или иначе мертиолятом натрия), хинозолом (сернокислым гамма-оксихинолином) или их смесью.

В качестве холестеринсодержащего продукта используют холестерин или продукты, содержащие не менее чем 0,05% например, различные сыворотки крови (наиболее удобна лошадиная сыворотка в связи с низкой стоимостью и большой универсальностью).

Оптимальные результаты достигаются при соотношении холестерин:химреагент 1-20: 1, при использовании в качестве химического агента смеси тиомерсала с хинолином в соотношении 1:20:1.

В результате смешения холестерина с указанными агентами образуются комплексы, способные, по-видимому, ингибировать радикальные и иные негативные процессы в системе, вызывающие деактивацию вирусов. В результате удается сохранять активность вирусных препаратов на уровне 90-99% в течение по крайней мере 12-20 мес.

Выбор оптимального соотношения производных производится исходя из того, что понижение содержания тиомерсала снижает защищенность препарата от температурных воздействий, а пониженная концентрация хинозола ухудшает гомогенность системы. Повышение же концентрации обоих агентов выше данного предела оказывается токсичным для некоторых вирусов.

Таким образом в зависимости от используемой вирусной системы используется либо смесь холестерина с тиомерсалом и хинозолом в соотношении 1 20 0,5
1 0,5 1 или смеси холестерина с одним из агентов в соотношении 1 20:1.

Указанные композиции в литературе не описаны, что свидетельствует о их новизне, хотя использование отдельных препаратов в вирусологии известно.

Так, холестеринсодержащие продукты используют для наработки антител к вирусам, тиомерсал для создания инактивированных бактериальных вакцин против сальмонеллеза.

Приготовление стабилизатора из компонентов заключается в смешении навесок, разведение перед использованием дистиллированной водой до гомогенного состояния и добавление к вирусной суспензии, исходя из содержания в конечном продукте 0,5 3% в зависимости от состава стабилизатора и природы суспензии.

Практическая применимость иллюстрируется примерами.

Пример 1. При комнатной температуре смешением были приготовлены образцы, содержащие
7 г холестерина и 1 г тиомерсала (композиция 1),
7 г холестерина и 1 г хинозола (композиция 2),
100 г лошадиной сыворотки, содержащей 0,07% холестерина, 0,4 г тиомерсала и 0,4 г хинозола (композиция 3).

Перед употреблением полученную смесь доводили дистиллированной водой до 500 мл.

Бактериостатическую активность композиций изучали на штаммах E.coli, выделенных из эмбрионов кур на птицефабриках России при n 117.

Исследования проводили методом серийных разведений с учетом количества устойчивых штаммов E. coli к различным концентрациям композиций (цифрами в табл.1 показано количество устойчивых штаммов в n 117).

Затем в том же опыте изучали бактерицидную активность композиции (см. табл.2 цифрами показано количество устойчивых штаммов (%), n 117
Те же пробирки проверили на "пророст" через 24 дня хранения в холодильнике при +4^oС, определив таким образом консервирующий эффект композиций (см. табл.3 цифрами показано общее количество "проросших" пробирок в опыте (%), n 117.

Как видно из данных приведенных таблиц, бактериостатическая, бактерицидная и консервирующая активность предлагаемых композиций выше, чем у прототипа.

Фунгицидную активность композиций изучали на грибах Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Candida albicans, Sacharomices cerevisia методом серийных разведений в жидкой среде Сабуро. Учет вели через 2 мес. культивирования при 22^oС (см. табл.4).

Как видно из приведенной табл.4, фунгицидная консервирующая активность у прототипа отсутствует, а у предлагаемых композиций достаточно высока.

Действие композиций на микоплаз изучали на 4 штаммах M.gallisepticum, выделенных от птиц методом серийных разведений в среде Эдварда (см. табл.5 - цифрами указано количество устойчивых штаммов).

Как видно из табл.5, микоплазмостатическая активность всех композиций высока и не ниже, чем у прототипа.

Действием композиций на вирусы изучали методом определения биологической активности законсервированных вирусов на развивающихся эмбрионах птиц. Опыт проводили через 1 мес. хранения при +4^oС. (см. табл.6 цифрами указана остаточная активность вируса (%).

Как видно из данных табл.6, прототип не снижал биологическую активность вирусов. Добавление в вирусные суспензии водных растворов тиомерсала и хинозола достоверно инактивировали вирусы в различной степени. Добавление к вирусной суспензии смесей холестерина и растворов тиомерсала и хинозола в 1% концентрации и их смеси с содержанием по 0,4% каждого вещества не снижало активность вирусов при хранении в жидком состоянии.

При сублимационном высушивании всех исследованных образцов вирусов установлено, что ни одна из композиций не снижала растворимости сухих вирусов в воде (см. табл.7).

Влияние различных стабилизаторов на хранение вирусных суспензий представлено в табл.8.

Вышеприведенные данные свидетельствуют об эффективности и безопасности использования стабилизаторов для различных вируссодержащих биопрепаратов.

Основные исследования проводились в Институте болезней птиц (С.-Петербург). Выпуск препарата предполагается на базе ГМП "Ветфарм". ТТТ1 ТТТ2 ТТТ3 ТТТ4 ТТТ5 ТТТ6 ТТТ7

Использование: вирусология, иммунология. Сущность изобретения: стабилизатор вирусных препаратов содержит холестериносодержащий продукт и химический реагент. В качестве холестериносодержащего продукта используют холестерин или продукты, содержащие его не менее 0,05%, например, сыворотка лошади. В качестве химического реагента используют мертиолят натрия, хинозол или их смесь. Оптимальный результат достигается при соотношении холестерин: химический реагент 1:20. 8 з.п. ф-лы, 8 табл.

1. Стабилизатор вирусных препаратов на основе химических добавок, отличающийся тем, что в качестве добавок он содержит смесь холистеринсодержащего продукта (в расчете на холистерин) с натриевой солью этилмеркуртиосалициловой кислоты и сернокислого γ- оксихинолина в массовом соотношении (1 20): (0,5 -1):(0,5 1) соответственно. 2. Стабилизатор вирусных препаратов на основе химических добавок, отличающийся тем, что в качестве добавок он содержит смесь холистеринсодержащего продукта (в расчете на холистерин) с натриевой солью этилмеркуртиосалициловой кислоты в соотношении (1 20):1. 3. Стабилизатор по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве холистеринсодержащего продукта он содержит холистерин. 4. Стабилизатор по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве холистеринсодержащего препарата он содержит продукты, содержащие по крайней мере 0,05% холистерина. 5. Стабилизатор по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве холистеринсодержащего продукта он содержит сыворотку крови лошадей. 6. Стабилизатор вирусных препаратов на основе химических добавок, отличающийся тем, что в качестве добавок он содержит холистеринсодержащие продукты (в расчете на холистерин). 7. Стабилизатор по пп. 1 и 6, отличающийся тем, что в качестве холистеринсодержащего продукта он содержит холистерин. 8. Стабилизатор по пп. 1 и 6, отличающийся тем, что в качестве холистеринсодержащего препарата он содержит продукты, содержащие по крайней мере 0,05% холистерина. 9. Стабилизатор по пп. 1 и 6, отличающийся тем, что в качестве холистеринсодержащего продукта он содержит сыворотку крови лошадей.