БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНАЯ ДОБАВКА К ПИЩЕ Российский патент 2009 года по МПК A23L1/30 A23L1/302 A23L1/304 A23L1/305 

Изобретение относится к биологически активным добавкам (БАД) к пище, обладающим широким спектром физиологических эффектов на организм: существенной активацией неферментативного звена антиоксидантной системы и уменьшением повреждающего воздействия свободных радикалов при развитии сосудистой патологии, повышением детоксицирующей функции печени, адаптогенным и цитопротектавным эффектом, выражающимся в увеличении устойчивости при воздействии неблагоприятных факторов, снижении утомляемости, повышении физической выносливости, улучшении умственной деятельности и может быть использовано в фармацевтической и пищевой промышленности.

В настоящее время в связи с ростом числа онкологических, соматических, инфекционных и прочих заболеваний различной этиологии, углублением тяжести их течения и увеличением длительности лечения весьма актуальной является задача поиска средств, способных за счет повышения общей неспецифической резистентности организма к различным воздействиям предупреждать и облегчать как сами заболевания, так и их осложнения, а также ускорять реабилитацию больных после критических состояний.

При решении рассматриваемой проблемы все более широкое использование находят специализированные продукты питания - БАД к пище, содержащие разнообразные концентраты натуральных или идентичных натуральным синтетических биологически активных веществ [1]. Ежедневное длительное применение указанных БАД самостоятельно или в составе пищевых продуктов и налитков обеспечивает поставку организму комплекса биологически активных веществ, проявляющих выраженное физиологическое действие и оказывающих на организм регулирующее влияние.

Необходимость дополнительного приема специальных продуктов связана, прежде всего, с применением во все возрастающих масштабах при производстве основных продуктов питания современных высокотехнологичных процессов, способствующих «очищению» их от многих незаменимых компонентов пищи, в результате чего человек недополучает ряд важных для нормальной жизнедеятельности биологически активных веществ. Продолжительное несбалансированное питание с использованием таких продуктов, содержащих зачастую токсины (нитраты, нитриты), особенно в сочетании с неблагоприятной экологической обстановкой и дисбиотическими состояниями, наблюдаемыми у 90% населения России, приводит к нарушению важных функций организма и может вызвать целый ряд серьезных заболеваний.

Одни из таких продуктов (БАД-нутрицевтики) позволяют быстро восполнить дефицит необходимых организму веществ - витаминов, минеральных солей, макро- и микроэлементов, отдельных аминокислот, пищевых волокон и других в пределах их физиологической нормы. Другие (БАД-парафармацевтики) оказывают регулирующее и стимулирующее влияние на определенные функции организма, стимулируют реакции регенерации, активируют секреторные функции, сердечно-сосудистую и нервную системы.

Вместе с тем, при применении таких препаратов для регулирования функций организма должен учитываться и тот фактор, что одним из «пусковых» механизмов развития различных поражений является оксидативный стресс - состояние несоответствия уровня продукции свободных радикалов емкости антиоксидантных систем, вследствие чего формируются предпосылки для избыточного окисления биосубстратов, модификации и необратимого изменения ферментных систем, нарушения структуры и проницаемости биологических мембран, энергетического дефицита и снижения жизнеспособности клеток [2-7]. Под воздействием оксидативного стресса происходит значительное увеличение содержания в тканях и в крови водо- и жирорастворимых прооксидантов, прежде всего активных кислородных метаболитов, продуктов перекисного окисления липидов и оксида азота. Указанные вещества чрезвычайно реактогенны и неконтролируемое увеличение их содержания в организме вызывает цитотоксические и генотоксические эффекты. При этом происходит как окисление полиненасыщенных жирных кислот мембран, так и изменение белков, часть из которых выполняет ферментативную функцию, а также ДНК, что проявляется в увеличении мутагенных эффектов.

В интактной клетке оксидативные процессы находятся под строгим и чрезвычайно разнообразным контролем механизмов антиоксидантной защиты, обеспечивающих протекание свободнорадикальных реакций на стационарном уровне, необходимом для нормальной жизнедеятельности клетки. Важную роль в защите организма от активных кислородных радикалов играет система ферментативных (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионзависимые пероксидаза и трансфераза, церулоплазмин, глутатионредуктаза) [8-12] и неферментативных антиоксидантов (тиоловые соединения - глутатион, цистеин, таурин; витамины - аскорбиновая кислота, токоферол, бета-каротин; биогенные амины - серотонин, гистамин, катехоламины; олигопептиды - карнитин, карнозин, ансерин, эндорфины, энкефалины; полифенолы; фосфолипиды; убихинон), обладающих способностью в определенных условиях подавлять процессы свободнорадикального окисления [13-16].

Воздействие на организм человека разнообразных экстремальных факторов приводит к изменениям в состоянии антиоксидантной системы и, если ресурсы данной защитной системы исчерпываются, возникает дисбаланс между антиокислительными и окислительными процессами, который имеет решающее значение в генезе различных форм патологии [17, 18]. В результате наступившего дисбаланса происходят существенные нарушения как ферментативного, так и неферментативного звеньев антиоксидантной защиты. Снижается активность каталазы, супероксиддисмутазы, содержание бета-каротина, токоферола и убихинона в митохондриях гепатоцитов.

Указанные обстоятельства определили необходимость пристального внимания к оценке регуляции процессов свободнорадикального окисления, а перспективы изыскания БАД с более эффективным регулирующим воздействием на организм человека связали, прежде всего, с созданием рецептур, компенсирующих недостаток эндогенных детоксикационных факторов.

К числу указанных БАД относится антиокислительная композиция [19], разработанная американскими специалистами, представляющая собой сложную многокомпонентную систему, состав которой изменяется в зависимости от пола и возраста людей (от 13 до 66 лет и старше) и включает: витамин А (2500-5000 ME), бета-каротин (7,5-15 мг), витамин С в виде аскорбата кальция (250-2500 мг), витамины D₃ (200-400 ME) и D (100 ME), витамин Е в виде d-альфа токоферола (50-100 ME) и d-альфа токоферола ацетата (50-300 ME), витамины B₁ (тиамина мононитрат) (2-4 мг), B₂ (рибофлавин) (2,5-5 мг), В₆ (пиридоксина гидрохлорид) (2,5-5 мг), B₁₂ (цианокобаламин) (5-10 мкг), Н (d-биотин) (100-200 мкг), ниациномида аскорбат (15-30 мг), d-кальция пантотенат (5-10 мг), фолиевую кислоту (400-800 мкг), N-ацетилцистеин (250 мг), альфа-липоевую кислоту (30 мг), 1-селенометионин (50-100 мкг), хрома пиколинат (25-50 мкг), цинка глицинат (7,5-15 мг), кальция цитрат (125-1500 мг), магния цитрат (62,5-750 мг), кофермент Q₁₀ (30 мг).

Существенными недостатками, ограничивающими возможности применения указанной БАД, взятой в качестве прототипа, являются:

- отсутствие БАД-прототипа на фармацевтическом рынке России;

- существенные отличия климатических условий проживания, образа жизни, культуры питания россиян и непредсказуемость реакции их организма в случае приема БАД-прототипа;

- многокомпонентный состав БАД-прототипа и необходимый в таком случае сложный технологический процесс изготовления в совокупности определяют ее высокую стоимость и, следовательно, недоступность для многих групп населения России;

- состав БАД-прототипа нельзя считать сбалансированным с точки зрения антиоксидантного воздействия, имеющего превалирующее значение в регулирующем воздействии на системы организма, так как для усиления биологической активности ферментативного антиоксиданта - глутатионзависимой пероксидазы, играющей важную роль в защите организма от активных кислородных радикалов, применен l-селенометионин, хотя использование селена в данной форме не позволяет максимально реализовать его антиоксидантный эффект, и, кроме того, это более дорогая и менее устойчивая при хранении форма селена, что существенно сокращает срок годности БАД-прототипа;

- для БАД-прототипа не определена препаративная форма (таблетки, капсулы, порошки и др.), хотя применение отдельных ее составляющих с учетом состояния людей должно быть регламентировано от состава и времени приема пищевых продуктов, что очень усложняет, а в ряде случаев делает практически невозможным, их своевременное принятие. При этом использование такой БАД должно осуществляться многими группами людей под строгим наблюдением врача.

Учитывая изложенное, целью изобретения явилось расширение ассортимента биологически активных добавок к пище за счет создания высокоэффективного сбалансированного антиоксидантного комплекса, не содержащего опасные для здоровья вещества, не обладающего сенсибилизирующим действием, способностью к кумуляции, токсическим влиянием на репродуктивную функцию, мутагенным эффектом и отдаленными негативными последствиями, отличающегося широким спектром физиологических эффектов на организм, хорошо переносимого и доступного для широких групп населения.

Указанная цель достигается за счет создания сбалансированного антиоксидантного комплекса, компоненты которого обеспечивают эффективное гашение свободных радикалов в водной и липидной средах организма, увеличивают активность антиоксидантных ферментов, способствуют ускоренному рециклированию окисленных форм антиоксидантов и блокированию инициации свободнорадикальных процессов.

Сбалансированность качественного и количественного состава заявляемой БАД обеспечивается тем, что:

- она содержит комплекс водо- и жирорастворимых антиоксидантных витаминов (витамин С и витамины Е, А) для подавления свободнорадикальных реакций в водной среде и липидном бислое клеточных мембран;

- молярное соотношение водо- и жирорастворимых антиоксидантных витаминов составляет 2:1;

- для обеспечения более активного гашения свободных радикалов в липидном бислое биомембран используется витамин А в молярном соотношении с витамином Е, равном 1:1;

- используется соединение 4-валентного селена (Na₂SeO₃) в дозе, позволяющей исключить его токсическое действие и максимально проявить антиоксидантный эффект, выражающийся в поддержании и стимуляции активности антиоксидантных ферментов и ускорении рециклирования их окисленных форм;

- в состав рецептуры введены низкомолекулярные тиолы (SH-содержащая аминокислота в виде метионина и липоевая кислота) при соотношении антирадикальной емкости (способности к окислительной модификации) тиосодержащих соединений, водо- и жирорастворимых актиоксидантных витаминов, составляющем 2:1:1,1, для обеспечения рециклирования витамина С и детоксикации гидроперекисей жирных кислот;

- использование тиосодержащего соединения (липоевой кислоты) с дополнительной метаболической активностью позволяет существенно улучшить окислительные процессы в митохондриях;

- входящие в нее ингредиенты, представляющие собой естественные метаболиты, содержатся в дозах, обеспечивающих их суточную потребность, а также усиливают эффект друг друга (синергизм) при комбинированном применении и предупреждают возможность развития прооксидантных эффектов.

Ингредиенты подобраны таким образом, что заявляемая БАД представляет собой сбалансированный антиоксидантный комплекс, а количество их в одной капсуле составляет, мг:

Витамин А (ретинола ацетат)1,5Витамин Е (α-токофорола ацетат)50Витамин С (кислота аскорбиновая)70Метионин149Кислота липоевая0,041Селенит натрия0,02 (в пересчете на селен)Целлюлоза микрокристаллическаядо содержания капсулы 390

Возможность достижения цели изобретения доказывается следующими примерами.

Пример 1. Изготовление заявляемой БАД в капсулированной препаративной форме.

При изготовлении заявляемой БАД в капсулированной препаративной форме для повышения технологичности процесса изготовления в качестве фармакологически приемлемого наполнителя используют целлюлозу микрокристаллическую, представляющую собой концентрат пищевых волокон, являющуюся прекрасным энтеросорбентом и оказывающую детоксикационное действие на различные системы организма.

Процесс изготовления заявляемой БАД представляет собой последовательность следующих операций.

Сырье для приготовления массы для капсулирования предварительно просеивают. Массу для капсулирования получают смешением компонентов в супермиксере-грануляторе или двухконусном миксере-опудривателе. Расчетное количество натрия селенита тщательно измельчают в фарфоровой ступке, предварительно смешивают с небольшим количеством целлюлозы микрокристаллической, затем просеивают вручную через капроновую ткань и добавляют при тщательном перемешивании к массе для капсулирования. Массу для капсулирования после выгрузки просеивают на вибросите и передают на стадию капсулирования. Наполнение твердых желатиновых капсул осуществляют на автомате для наполнения капсул. Обеспыливание капсул осуществляют на автомате для полировки капсул.

Пример 2. Оценка безопасности заявляемой БАД.

Безопасность заявляемой БАД оценивали путем проведения санитарно-химического анализа и определения ряда токсикологических характеристик: острой токсичности при внутрижелудочном введении, хронической токсичности и способности к кумуляции, раздражающего и сенсибилизирующего действия, возможных отдаленных последствий [20-23].

Санитарно-химический анализ.

Подготовку проб проводили по ГОСТ 26929-86 «Сырье и продукты пищевые. Подготовка проб. Минерализация для определения токсичных элементов». Содержание токсичных элементов и хлорорганических пестицидов определяли с использованием газожидкостного хроматографа «Карло Эрба» (модель HRGC 5700) и атомно-адсорбционного спектрометра «Перкин-Элмер» (модель 303).

Суммарную удельную радиоактивность образцов заявляемой БАД измеряли с использованием гамма-спектрометра «УСК-Гамма-плюс» (Россия).

Результаты проведенных измерений представлены в табл.1 и 2 и показали, что содержание токсичных и опасных для здоровья веществ в заявляемой БАД не превышает допустимых уровней.

Исследование острой токсичности при внутрижелудочном введении.

Для определения показателей острой токсичности содержимое капсул заявляемой БАД в виде водных разведении вводили белым крысам обоего пола внутрижелудочно через атравматичный металлический зонд в возрастающих дозах по Литчфилду-Уилкоксону. Большие дозы вводили повторно в течение 15 минут. Контрольным животным вводили аналогичные объемы дистиллированной воды (контроль объема).

Гибель животных при внутрижелудочном введении смертельных доз заявляемой БАД (более 7 г/кг) наблюдалась в течение 1,5-5 часов от момента введения при явлениях возбуждения, последующей вялости, заторможенности, оглушения, бокового положения, резкого поверхностного дыхания, судорог в агональной стадии и паралича.

Наблюдаемые эффекты заявляемой БАД представлены в табл.3 и показали, что по показателю летальной токсичности ЛД50» составляющему 8500 мг/кг, заявляемая БАД относится к малоопасным (IV класс опасности) веществам [24].

Исследование хронической токсичности и способности к кумуляции.

Исследования хронической токсичности проводили на белых нелинейных крысах обоего пола при введении заявляемой БАД внутрижелудочно через атравматичный металлический зонд в течение 30 дней. Суточная доза составляла 1,0 г/кг, за 30 дней общее количество введенной заявляемой БАД составило 30 г/кг. Контрольные животные получали дистиллированную воду в аналогичных объемах.

Измерение основных физиологических показателей производили в конце исследования, через 30 дней ежедневного введения заявляемой БАД.

На протяжении всего периода наблюдения летальных эффектов не наблюдали. Общее состояние и поведение подопытных животных оставалось нормальным и не отличалось от контроля в течение всего эксперимента.

Результаты исследования основных физиологических показателей подопытных и контрольных животных представлены в табл.4 и показали, что заявляемая БАД достоверно снижает продолжительность гексеналового сна по сравнению с контролем, что, безусловно, является одним из результатов ее фармакологического действия, выражающимся в повышении детоксицирующей функции печени. По остальным из исследованных показателей не имелось статистически значимых (на 95% доверительном уровне) различий с контролем или патологических отклонений за пределы варьирования физиологической нормы.

Таким образом, ежедневное в течение 30 дней внутрижелудочное введение крысам заявляемой БАД в дозе 1,0 г/кг не вызывало летальных эффектов и не приводило к значимым изменениям физиологических показателей. Из уровня интегральных показателей хронической нелетальной токсичности следует, что заявляемая БАД не обладает способностью к кумуляции и нетоксична.

Исследование сенсибилизирующего действия.

Изучение сенсибилизирующего действия заявляемой БАД проводили на морских свинках. Для этого в кожу наружной поверхности уха животных туберкулиновым шприцем вводили однократно 0,2 мл водного разведения заявляемой БАД в соотношении 1:2, а через 10 дней на предварительно выстриженные участки кожи боковой поверхности спины размером 2×2 см наносили и фиксировали порошок содержимого капсул из расчета 20 мг/см². Кровь у животных брали через 3 часа после постановки кожных проб.

Результаты оценки влияния заявляемой БАД на показатели сенсибилизирующего действия представлены в табл.5 и показали отсутствие признаков сенсибилизации (эозинофилии или увеличения уровня лизиса в РСЛЛ по сравнению с контролем) в периферической крови. При осмотре кожи спины подопытных животных признаков раздражения не отмечалось. Следовательно, заявляемая БАД при эпикутанном контакте не обладает сенсибилизирующим действием, то есть не провоцирует развитие аллергии.

Исследование возможных отдаленных последствий.

Изучение возможного гонадотоксического эффекта проводили в соответствии с методическими рекомендациями по показателям, обязательным при первичной оценке химических веществ [25, 26]. Изучение мутагенной активности проводили по частоте образования микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга (из бедренной кости) белых мышей в соответствии с методическими рекомендациями [27, 28].

Результаты изучения возможных гонадотоксического и мутагенного эффектов заявляемой БАД при введении ее в течение 10 дней в дозе 1 г/кг, проведенного через 15 дней после окончания введения, представлены в табл.6 и свидетельствуют об отсутствии достоверно значимых сдвигов показателей гонадотоксичности и мутагенности при введении животным заявляемой БАД. Угнетения сперматогенеза или увеличения частоты мутаций не наблюдалось.

Следовательно, заявляемая БАД не обладает токсическим влиянием на репродуктивную функцию и не оказывает мутагенного эффекта. Это свидетельствует о ее безопасности в плане развития отдаленных негативных последствий.

Пример 3. Оценка биологической активности заявляемой БАД.

Оценку биологической активности проводили путем изучения адаптогенной активности, нейротрофического и цитопротективного эффектов, антиоксидантных и антигипоксантных свойств на модели ишемии головного мозга.

Указанные характеристики эффективности заявляемой БАД оценивали на крысах после ее четырехнедельного ежедневного однократного внутрижелудочного (через зонд) введения. Необходимую дозу введения заявляемой БАД рассчитывали исходя из массы капсулы, составляющей 390 мг и предназначенной для приема среднестатистическим человеком массой 70 кг. Опыты выполняли на белых крысах-самцах с массой тела 220-300 г.

Влияние заявляемой БАД на устойчивость крыс к воздействию высоких температур.

Адаптогенные свойства заявляемой БАД оценивали путем изучения воздействия на опытных животных температурного фактора, позволяющего провести комплексную оценку влияния заявляемой БАД на метаболические системы, устойчивость функционирования которых в условиях гипертермии определяет выживаемость особей.

Для оценки устойчивости крыс в условиях гипертермии подопытную и экспериментальную группы по 6 животных в клетке помещали в вентилируемый термостат и выдерживали при температуре 60°С. Устройство термокамеры позволяло обеспечить адекватный газообмен, достаточный для предупреждения кислородной недостаточности, и предусматривало наблюдение за животными через смотровое застекленное отверстие. В ходе наблюдения регистрировали развитие симптоматики поражения и отмечали время манифестации судорожного синдрома и время гибели особей.

Результаты экспериментов приведены в табл.7 и свидетельствуют о том, что заявляемая БАД при четырехнедельном введении оказывает положительное влияние на устойчивость крыс к гипертермии. Насыщение тканей тиоловыми антиоксидантами способствует более интенсивной инактивации оксида азота, играющего важную роль в детерминации судорожной готовности.

Скорость развития судорожного синдрома у животных, получавших заявляемую БАД, имеет отчетливую тенденцию к снижению, а продолжительность жизни животных подопытной группы в условиях гипертермии достоверно выше. Таким образом, заявляемая БАД обладает адаптогенным действием и при курсовом применении увеличивает устойчивость к воздействию экстремальных факторов.

Влияние заявляемой БАД на процессы краткосрочной памяти.

Нейротрофические эффекты заявляемой БАД оценивали по ее влиянию на краткосрочную память крыс, определяемую по степени формирования и закрепления у животных элементарных оборонительных условных рефлексов, в частности условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ). Путем наблюдения за угасанием УРПИ регистрировали нарушения высшей нервной деятельности (ВНД) в динамике.

Аппарат для выработки рефлекса пассивного избегания представлял собой длинный фанерный ящик, разделенный на 6 отсеков. Каждый отсек состоял из освещенной камеры, в которую была вмонтирована лампа накаливания мощностью 40 Вт, и затемненной камеры, пол которой был выполнен медными стержнями диаметром 2 мм. К стержням через латер и замыкающий ключ подавали ток от сети. Камеры были разделены перегородкой с отверстием, которое перекрывалось заслонкой.

Предварительно проводили отбор крыс с легко вырабатываемым рефлексом. Отбраковывали животных, которые после помещения в светлую камеру не заходили в темную зону в течение 60 с или находились в ней менее 15 с.

Для выработки рефлекса 6 животных одномоментно помещали в освещенную камеру, хвостом к отверстию в перегородке. Обследуя светлую камеру, крысы находили отверстие и переходили в темную зону. В это время отверстие закрывали перегородкой и крыс подвергали импульсному воздействию электрического тока (пять ударов продолжительностью по 10 с при напряжении 40 В). После раздражения отверстие открывали и животные переходили в ярко освещенные камеры. Рефлекс считался выработанным и сохранившимся в случае пребывания крысы в освещенной зоне более 1 мин. УРПИ формировали через 14 суток после начала применения заявляемой БАД, а его проявления регистрировали до окончания приема БАД и на протяжении недельного восстановительного периода.

Результаты экспериментов по оценке частоты воспроизведения УРПИ после однократной электростимуляции крыс (напряжение 10 В, продолжительность 2 с) контрольной (вводилась дистиллированная вода) и подопытной (вводилась заявляемая БАД на протяжении 28 суток) групп, представленные на чертеже, дают основание заключить, что применение заявляемой БАД позволяет активировать когнитивные процессы и в большей степени закрепить сформированный оборонительный рефлекс. Через 4 и 10 суток после электроболевого воздействия память о нем в большей степени сохраняется у животных подопытной группы. В последующем периоде наблюдения достоверных различий между подопытной и контрольной группами животных не отмечено. Установлено, что отмена применения заявляемой БАД не влияет на скорость угасания УРПИ.

Таким образом, заявляемая БАД оказывает позитивное влияние на когнитивные процессы и способствует улучшению памяти.

Влияние заявляемой БАД на устойчивость крыс к воздействию гиперкапнической гипоксии.

Оценку адаптогенного и цитопротективного эффектов заявляемой БАД проводили при гипоксических нагрузках в силу универсальности данного состояния при различных экстремальных воздействиях и патологических состояниях.

Гипоксию моделировали с помощью эксикатора с водяным замком, позволяющим обеспечить гипоксическую нагрузку при разряжении воздуха, эквивалентном атмосфере на высоте 11,5 км, и при постоянном увеличении количества углекислого газа за счет поступления выдыхаемого животными воздуха. Крыс помещали в камеру попарно (по одной из подопытной и контрольной групп) и выдерживали в ней до момента их гибели, регистрируя частоту и скорость развития судорожного синдрома, а также продолжительность жизни животных.

Результаты экспериментов приведены в табл.8 и свидетельствуют о том, что заявляемая БАД интенсифицирует гидроксилирование и окисление липофильных ксенобиотиков, способствует значимому повышению устойчивости животных при воздействии неблагоприятных факторов, моделирующих условия закрытых помещений, задымленной среды и подземного транспорта, то есть проявляет цитопротективное действие.

Влияние заявляемой БАД на степень ишемических повреждений головного мозга при стенозе двух сонных артерий.

Исследовали эффективность заявляемой БАД на моделях ишемии головного мозга (ишемического инсульта) по показателям развития оксидативного стресса с регистрацией как его выраженности, так и исходов в виде накопления продуктов пероксидации.

Из четырех сосудов, принимающих участие в кровоснабжении головного мозга крысы, были одномоментно перевязаны 2 сонные артерии. Операцию выполняли под кетаминовым наркозом. Наблюдение за наркотизированными животными осуществляли в течение 2,5 ч после стенозирования, после чего крыс декапитировали и извлекали головной мозг для биохимического исследования. Активность каталазы эритроцитов оценивали по скорости распада перекиси водорода, введенной в среду в известном количестве. Антирадикальную емкость плазмы крови и гомогенатов головного мозга оценивали по восстановлению свободного радикала, дифенилпикрилгидразила, причем более низкие показатели оптической плотности этого окрашенного продукта свидетельствовали о восстановлении радикала и характеризовали эффект антиоксидантного препарата. Диеновые конъюгаты гидроперекисей жирных кислот экстрагировали из крови и гомогенатов головного мозга изопропанолом и гептанолом для раздельного определения в фосфолипидной фракции мембран. Известно, что продукты пероксидации способны поглощать проходящий свет с длиной волны, составляющей 232 нм, тогда как неокисленные двойные связи - при длине волны в 220 нм. Отношение показателей экстинции свидетельствовало о доли продуктов пероксидации в общей липидной фракции. Определение показателей оптической плотности производили с использованием спектрофотометра марки СФ-26. Результаты спектрофотометрии проб крови приведены в табл.9.

При исследовании крови животных выявлены существенные различия между показателями контрольной и подопытной групп. Активность каталазы в крови у животных, принимавших заявляемую БАД, остается на низком уровне, что отражает отсутствие субстрата для данного фермента, появляющегося в ходе реакций оксидативного стресса. Не исключено, что даже в случае появления перекиси водорода в крови она будет инактивирована неферментативным звеном антиоксидантной системы, о чем свидетельствует высокий уровень инактивации дифенилпикрилгидразина у крыс, в течение четырех недель употреблявших в пищу антиоксидантный комплекс. Диеновые конъюгаты гидроперекисей жирных кислот выявляли в крови подопытных крыс в гораздо меньшем количестве, чем у животных контрольной группы.

Заявляемая БАД, представляющая собой сбалансированный антиоксидантнын комплекс, способствует инактивации свободных радикалов и повышает устойчивость клеток головного мозга к ишемическим нагрузкам, проявляя нейропротективный эффект.

Наряду с исследованием характеристик содержания продуктов перекисного окисления липидов в крови, проводили изучение процессов перекисного окисления непосредственно в очаге повреждения. Результаты спектрофотометрии проб гомогенатов головного мозга приведены в табл.10. Установлено, что в случае применения заявляемой БАД снижается содержание диеновых конъюгатов в экстрагируемой изопропанолом фосфолипидной мембранной фракции, чем обеспечивается защитный эффект на уровне клеток и тканей. Применение заявляемой БАД способствует существенной активации неферментативного звена антиоксидантной защиты.

Таким образом, введение заявляемой БАД в течение четырех недель позволяет достичь адекватного цитопротективного эффекта, сопряженного с ограничением пероксидации липидов и существенной активацией неферментативного звена антиоксидантной системы.

Влияние заявляемой БАД на длительность плавания мышей.

Плавание, являющееся тяжелой физической динамической нагрузкой, позволяющей оценить эффективность адаптогенов и активность окислительно-восстановительных процессов в мышцах мышей, осуществлялось при температуре воды 38-39°С и выполнялось с грузом, представляющим собой свинцовую трубку на резиновом кольце, прикрепляемую к корню хвоста мыши, и составляющим 5% от веса тела. Критерием утомления и прекращения плавания считали первое «ныряние» мыши с погружением носовых ходов в воду. В большой ванне одновременно плавали по 5 животных из контрольной и подопытной групп.

Результаты тестирования мышей, проведенного через 20 дней после ежедневного приема заявляемой БАД, представлены в табл.11 и позволили установить, что заявляемая БАД в 1,6 раз увеличивает продолжительность плавания мышей, то есть оказывает протективное действие и снижает утомляемость.

Влияние заявляемой БАД на статико-силовую выносливость мышей.

Влияние заявляемой БАД на статико-силовую выносливость изучали путем регистрации времени висения мышей опытной и контрольной групп на вертикальной сетке. Животных тестировали после 20-дневного введения заявляемой БАД. Критерием истощения статической силы считали время, когда мышь уже не могла удерживать вес своего тела и падала с сетки вниз (собственный вес мышей составлял в среднем 25 г). Результаты эксперимента представлены в табл.12 и демонстрируют увеличение статической физической выносливости под воздействием заявляемой БАД.

Таким образом, проведенные исследования показали, что заявляемая БАД, представляющая собой сбалансированный антиоксидантный комплекс, включающий водо- и жирорастворимые антиоксидантные витамины (С, Е, А) при определенном их молярном соотношении, SH-содержащие соединения при регламентированном соотношении антирадикальной емкости тиосодержащих соединений, водо- и жирорастворимых витаминов, соединение 4-валентного селена в виде селенита натрия в дозе, позволяющей максимально проявить антиоксидантный эффект:

- обладает цитопротективным эффектом, сопряженным с ограничением пероксидации липидов и существенной активацией неферментативного звена антиоксидантной системы организма и выражающимся в снижении утомляемости и увеличении статической физической выносливости;

- повышает детоксицирующую функцию печени;

- обладает адаптогенным действием и способна увеличить устойчивость при воздействии экстремальных факторов;

- оказывает позитивное влияние на когнитивные процессы и способствует улучшению памяти;

- способствует инактивации свободных радикалов и снижает их повреждающие эффекты при развитии сосудистой патологии;

- не обладает сенсибилизирующим действием и не провоцирует развитие аллергии;

- не обладает токсическим влиянием на репродуктивную функцию, не оказывает мутагенного эффекта и безопасна в плане развития отдаленных негативных последствий.

Кроме того, заявляемая БАД не содержит токсичные и опасные для здоровья компоненты в количествах, превышающих допустимые уровни, относится к малоопасным веществам, не обладает способностью к кумуляции и нежелательными побочными эффектами.

Заявляемое изобретение удовлетворяет критерию «новизна», так как впервые предложен состав высокоэффективной биологически активной добавки к пище, представляющей собой сбалансированный комплекс, компоненты которого обеспечивают эффективное гашение свободных радикалов в водной и липидной средах организма, увеличивают активность антиоксидантных ферментов, способствуют ускоренному рециклированию окисленных форм антиоксидантов и блокированию инициации свободнорадикальных процессов, обеспечивают взаимное усиление (синергизм) эффектов и достижение оптимального соотношения между прооксидантными и антиоксидантными системами организма. Кроме того, в состав БАД включено тиосодержащее соединение (липоевая кислота) с дополнительной метаболической активностью.

Заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень», так как из доступной информации адекватно обоснованное молярное соотношение водо- и жирорастворимых антиоксидантных витаминов, строго определенное молярное соотношение тиолов и других антиоксидантов, соотношение антирадикальной емкости тиосодержащих соединений, водо- и жирорастворимых витаминов, учитывая двойственную сущность низкомолекулярных антиоксидантов, их способность при определенных условиях выступать в качестве прооксидаятов, а также оптимальное количество селена при введении его в виде селенита натрия не представляются очевидными.

Соответствие заявляемого изобретения критерию «пригодность для применения» подтверждается приведенными примерами, показавшими несложную технологию производства заявляемой БАД в капсулированной препаративной форме, ингредиенты которой недороги, доступны и обладают высокой стойкостью при хранении, а также результатами многочисленных исследований, подтвердивших безопасность и высокую биологическую активность созданного антиоксидантного комплекса.

Литература

1. Федорова B.C., Буданцева Е.П., Павлюченко И.В. БАД к пище как предмет изобретения // Патенты и лицензии. 2003. - № 6. - С.18-21.

2. Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.Н. Человек и противоокислительные вещества. - Л.: Наука. Ленингр. отд-ние. 1985. - 232 с.

3. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов. - М., 1989. - 368 с.

4. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И., Козлов А.В., Осипов А.А., Рощупкин Д.И. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. / ВНИИТИ. - М. 1991. - Т.29. - 250 с.

5. Жуков А.А., Жирнов Г.Ф. Механизм оксигеназных реакций: основные, промежуточные и побочные продукты оксигеназного цикла // Вестник АМН СССР. 1988. - № 1. - С.33-43.

6. Журавлев А.И. Спонтанная биохемилюминесценция животных тканей // Биохемилюминесценция. - М.: Наука. 1983. - С.3-29.

7. Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах // Успехи соврем, биологии. 1993. - Т.113, № 3. - С.286-296.

8. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов // Успехи соврем, биологии. 1993. - Т.113, № 4. - с.442-455.

9. Плужников Н.Н., Софронов Г.А. Фармакологическая коррекция состояния актиоксидантной системы организма // Патофизиология экстремальных состояний: Избранные лекции и доклады. / Под ред. В.Ю.Шанина и В.И.Захарова. - СПб., 1993. - С.108-113.

10. Bryan C.L., Campbell G.D., Lawrence R.A., Jenkinson S.G. Diphosphoryl lipid-A protects rats from lethal hyperoxid // J. Lab. Clin. Med. 1992. - Vol.161, № 2. - P.559-566.

11. Cadenas E., Boveris A., Chanse B. Jow-level chemiluminescence of biological systems // Free Radicals in Biology. 1984. - Vol.6, - P.211-242.

12. Fridovich I. Superoxide dismutases - anadaptation to a paramagnetic gas // J. Biol. Chem. 1989. - Vol.264, № 14. - P.7761-7764.

13. Воскресенский О.Н., Бобырев В.Н. Биоантиоксиданты обигатные факторы питания // Вопр. мед. химии. 1992. - № 4. - с.21.

14. Метелица Д.Н. Активация кислорода ферментными системами. - М.: Наука, 1982. - 256 с.

15. Маеда X., Акаике Т. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке // Биохимия. 1998, Т.63, вып.7. - С.1007-1019.

16. Воскресенский О.Н., Бобырев В.Н. Биоантиоксиданты - облигатные факторы питания // Вопр. мед. химии. 1992. № 4. - С.21-26.

17. Соколовский В.В. Тиоловые антиоксиданты в молекулярных механизмах неспецифической реакции организма на экстремальные воздействия // Вопр. мед. химии. 1988. Т.34, № 6. - С.2-11.

18. Fliss H., Menard М. Oxidant-induced mobilization of zinc from metallothionein. Note // Arch. Biochem. Biophys. 1992. - Vol.293, № 1. - P.195-199.

19. Патент США № 6849613. Multiple antioxidant micro-nutrients. Заявка № US 2003147996 от 07.08.2003 г., опубликовано 01.02.2005 г.

20. Определение безопасности и эффективности биологически активных добавок к пище. Методические указания 2.3.2.721-98. - М., 1999, - 87 с.

21. Методические указания к постановке исследований для обоснования санитарных стандартов вредных веществ в воздухе рабочей зоны. МУК 2163-80. - М., 1980, - 20 с.

22. Постановка исследований по гигиеническому нормированию промышленных аллергенов в воздухе рабочей зоны. Методические рекомендации 2121-80. - Рига, 1980, - 22 с.

23. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. СаНПиН 2.3.2.1078-01. - М., 2002, - 144 с.

24. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности. ГОСТ 12.1.007-76.

25. Методы экспериментальных исследований по установлению порогов действия промышленных ядов на генеративную функцию. Методические рекомендации. - М., 1969, 25 с.

26. Методы экспериментальных исследований по установлению порогов действия промышленных ядов на генеративную функцию с целью гигиенического нормирования. Методические рекомендации 1744-77. - М., 1978, - 35 с.

27. Оценка мутагенной активности химических веществ микроядерным методом. Методические рекомендации 28/10. - М., 1984, - 21 с.

28. Критерии оценки и методы прогнозирования отдаленных последствий действия на организм вредных веществ в воздухе рабочей зоны. Информационное письмо. НИИ гиг. тр. и проф. забол. - М., 1985, - 15 с.

Таблица 1
Содержание в заявляемой БАД токсичных элементов токсикантовИсследуемые показателиСодержание токсичных элементов и хлорорганических пестицидов, мг/кгНорма по СанПиН 2.3.2.1078-01, п.1.5.2В заявляемой БАД123Токсичные элементы:  - свинец1,00,01- кадмий0,10,03- ртуть0,010,002- мышьяк1,00,01Хлорорганические пестициды:  - ГХЦГ (контроль по сырью)0,005<0,001- ДДТ и метаболиты0,005<0,001Таблица 2
Суммарная удельная радиоактивность заявляемой БАДРадионуклидыСуммарная удельная радиоактивность, Бк/кгНорма по СанПиН 2.3.2.1078-01, п.1.5.2В заявляемой БАД123⁹⁰Sr10025¹³⁷Cs16032Таблица 3
Летальные эффекты при в/ж введении заявляемой БАД крысамВводимый составЛетальные эффекты (пало/всего) при введение заявляемой БАД в дозе, мг/кг50006000700080009000100001234567Заявляемая БАД0/50/51/52/53/55/5ЛД_{50 заявляемой БАД}=8500±500 мг/кг

Таблица 4
Влияние заявляемой БАД на показатели общей нелетальной токсичности белых крыс, М±mПоказатель общей нелетальной токсичностиЗначение показателя общей нелетальной токсичностиКонтрольПосле введения заявляемой БАД123Вес тела, г212±10221±4Массовые индексы органов, г/100 г массы тела:  - легкие5,9±0,15,9±0,2- печень29,8±1,129,6±1,6- почки7,5±1,27,5±1,5- селезенка4,8±0,095,0±0,2- сердце3,4±0,13,1±0,1Показатели мочи:
- белок мочи, мг %4,2±0,34,5±0,5- удельный вес мочи, г/мм³1,001±0,0451,030±0,035Биохимические показатели крови:
- сахар крови, мг %82±682±6- белок сыворотки, г %7,98±0,198,21±0,20- липидный фосфор, ммоль/л34,12±0,5530,70±0,43- АлТ, мккат/л0,43±0,050,40±0,01- АсТ, мккат/л0,88±0,040,89±0,04- ЩФ, мккат/л0,96±0,160,90±0,17- тимоловая проба, ед. помутн.1,80±0,211,87±0,17Морфологические показатели крови:
- эритроциты, млн./мм³6,2±0,086,3±0,08- гемоглобин, г %11,9±0,112,5±0,4- лейкоциты, тыс./мм³6,8±0,26,9±0,09Физиологические показатели:
- СПП, В14,1±1,314,3±1,8- продолжительность гексеналового сна, мин.34,5±2,522,0±2,0*Примечание: * - достоверные отличия от контроля при Р<0,05Таблица 5
Влияние заявляемой БАД на показатели сенсибилизирующего действияПоказатель сенсибилизирующего действияЗначение показателя сенсибилизирующего действияКонтрольПосле введения заявляемой БАД123Лейкоциты, тыс./мм³10,2±0,410,6±0,6Эозинофилы, %5±06±1Лимфоциты, %34±335±4Моноциты, %4±06±1Нейтрофилы, %54±660±5РСЛЛ, % лизиса10±19±1

Таблица 6
Показатели гонадотоксичноского и мутагенного действия заявляемой БАД, М±mПоказатель гонадотоксического и мутагенного эффектовЗначение показателя гонадотоксического и мутагенного эффектовКонтрольПосле введения заявляемой БАД123Весовой коэффициент гонад крыс-самцов, г/100 г веса тела6,98±0,367,01±0,47Количество спермиев, 10⁶/мл156±25186±38Продолжительность движения спермиев, мин.96±12101±4Осмотическая резистентность MNaCl2,47±0,092,46±0,12Число проанализированных клеток костного мозга мышей4200±1004200±120Частота клеток с микроядрами, %0,036±0,0040,035±0,012Таблица 7
Влияние заявляемой БАД при четырехнедельном введении на устойчивость крыс к воздействию высоких температур (Х+mx, n=6)Группа животныхКонтролируемый показатель, минНачало судорогВремя гибели113Контрольная (вводилась дистиллированная вода)33,2±1,640,0±2,2Подопытная (вводилась заявляемая БАД)40,8±1,744,7±1,9*Примечание: * - различие с контролем достоверноТаблица 8
Влияние заявляемой БАД при четырехнедельном введении на устойчивость крыс при гиперкапнической гипоксии (Х+mx, n=6)Группа животныхКонтролируемый показатель, мин.Начало судорогВремя гибели123Контрольная (вводилась дистиллированная вода)26,0±1,428,8±0,9Подопытная (вводилась заявляемая БАД)42,2±2,3*44,3±2,0*Примечание: * - различие с контролем достоверно

Таблица 9
Влияние заявляемой БАД при четырехнедельного применении на показатели перекисного окисления липидов в крови крыс после двусторонней перевязки сонных артерийПоказатель кровиУровень показателя для группы животныхИнтактные (без перевязки)Получавшие дистиллированную воду (контроль)Получавшие заявляемую БАД1234Активность каталазы0,250+0,0090,242+0,0210,219+0,025*Восстановление дифенилпикрилгидразила0,573±0,0230,556±0,0280,474±0,026*Диеновые конъюгаты - изопропанольная фракция0,201±0,0310,238±0,0290,166±0,035Диеновые конъюгаты - гептанольная фракция0,842±0,0310,851±0,0570,735±0,027*Примечание: * - различие с контролем достоверноТаблица 10
Влияние заявляемой БАД при четырехнедельном применении на показатели спектрофотометрии проб гомогенатов головного мозга крыс после двусторонней перевязки сонных артерийПоказательУровень показателя для группы животныхИнтактные (без перевязки)Получавшие дистиллированную воду (контроль)Получавшие заявляемую БАД, 1 доза1234Восстановление дифенилпикрилгидразила0,095±0,0220,103±0,0350,048±0,010*Диеновые конъюгаты - изопропанольная фракция0,179±0,0350,168±0,0210,145±0,008*Диеновые конъюгаты - гептанольная фракция0,555±0,0300,546±0,0090,552±0,005Примечание: * - различие с контролем достоверноТаблица 11
Влияние заявляемой БАД на длительность плавания мышей с грузом (М±m)Группа животныхДлительность плавания мышей, мин12Контрольная (вводилась дистиллированная вода)26,3±4,7Подопытная (вводилась заявляемая БАД)43,1±4,4*Примечание: * - достоверные отличия от контроля при Р<0,05Таблица 12
Влияние заявляемой БАД на статико-силовую выносливость мышей в тесте силовой нагрузки собственным весом (М±m)Группа животныхДлительность висения мышей, мин12Контрольная (вводилась дистиллированная вода)20,4±0,4Подопытная (вводилась заявляемая БАД)27,9±0,4*Примечание: * - достоверные отличия от контроля при Р<0,05

Изобретение относится к биологически активным добавкам (БАД) к пище. Биологически активная добавка к пище представляет собой сбалансированный антиоксидантный комплекс, включающий водо- и жирорастворимые антиоксидантные витамины С, Е и А, тиосодержащие соединения (аминокислота метионин и липоевая кислота), селенсодержащее соединение в виде селенита натрия. При этом молярное соотношение водо- и жирорастворимых антиоксидантных витаминов составляет 2:1, молярное соотношение витамина А и витамина Е составляет 1:1. Причем соотношение антирадикальной емкости тиосодержащих соединений, водо- и жирорастворимых антиоксидантных витаминов составляет 2:1:1,1. Изобретение позволяет обеспечить эффективное гашение свободных радикалов в водной и липидной средах организма, увеличивает активность антиоксидантных ферментов, ускоряет рециклирование окисленных форм антиоксидантов и блокирует инициации свободнорадикальных процессов. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 12 табл.

1. Биологически активная добавка к пище, включающая антиоксидантные витамины: водорастворимый витамин С в виде аскорбиновой кислоты, жирорастворимые витамины Е в виде α-токоферола ацетата и А в виде ретинола ацетата, тиосодержащие соединения в виде аминокислоты метионин и липоевой кислоты, селенсодержащее соединение, отличающаяся тем, что представляет собой сбалансированный антиоксидантный комплекс, в котором в качестве селенсодержащего соединения используют соединение 4-х валентного селена в виде селенита натрия Na₂SeO₃, молярное соотношение водо- и жирорастворимых антиоксидантных витаминов составляет 2:1, молярное соотношение витамина А и витамина Е составляет 1:1, а соотношение антирадикальной емкости тиосодержащих соединений, водо- и жирорастворимых актиоксидантных витаминов составляет 2:1:1,1.2. Биологически активная добавка к пище по п.1, отличающаяся тем, что выполнена в капсулированной препаративной форме, для чего дополнительно содержит фармакологически приемлемый технологический наполнитель, а в качестве фармакологически приемлемого технологического наполнителя используют целлюлозу микрокристаллическую.3. Биологически активная добавка к пище по пп.1 и 2, отличающаяся тем, что содержит ингредиенты в одной капсуле, мг:

Витамин А (ретинола ацетат) 1,5Витамин Е (α-токоферола ацетат) 50Витамин С (кислота аскорбиновая) 70Метионин 149Кислота липоевая 0,041Селенит натрия (в пересчете на селен) 0,02Целлюлоза микрокристаллическая Остальное до содержания капсулы 390