ПРИМЕНЕНИЕ КАУРАНОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ В ПРОИЗВОДСТВЕ МЕДИКАМЕНТОВ Российский патент 2009 года по МПК A61K31/19 A61P9/00 

Область техники

Данное изобретение описывает фармацевтическое применение каурановых соединений, в частности соединений А и Б.

Предшествующий уровень техники

Непроходимость коронарных сосудов является одним из самых распространенных заболеваний сердца. Она зачастую ведет к развитию аритмий, ишемической болезни сердца, инфаркту миокарда и сердечной недостаточности. Повреждение сердечной мышцы может произойти во время реперфузии, когда заблокированные коронарные сосуды внезапно открываются во время проведения клинических процедур, таких как коронарная ангиопластика, коронарное шунтирование или применение тромболитических медикаментов. Реперфузия зачастую ведет к развитию серьезных аритмий и сердечной недостаточности. Несколько препаратов были разработаны для лечения повреждений сердечной мышцы и аритмии, вызванных ишемией или реперфузией. Однако токсичность или низкая эффективность данных препаратов сильно ограничивает их клиническое применение.

Ишемический или геморрагический инсульт является одной из главных причин смерти в США. Он может привести к повреждению нейронов и церебральной дисфункции. Ишемия головного мозга также развивается в результате черепно-мозговой травмы или геморрагического шока. Высокий уровень обмена веществ и потребления кислорода головным мозгом и центральной нервной системой ведет к тому, что они являются наиболее уязвимыми к повреждениям, вызванным ишемией или гипоксией, каждая из которых может привести к смерти или необратимой травме. Разработка новых препаратов, способных защитить от церебральной ишемической травмы, является крайне желательной.

Многие природные соединения менее токсичны и обладают лекарственными свойствами. Например, гликозиды, выделенные из растений рода Digitalis, играют важную роль в лечении аритмии и сердечной недостаточности. К сожалению, эти препараты должны использоваться крайне осторожно, так как их токсическая доза очень близка к терапевтической. Одним из наиболее многообещающих подходов к улучшению медикаментозного лечения непроходимости коронарных сосудов, аритмии, сердечной недостаточности и инсульта является поиск новых более активных медикаментов среди природных соединений.

Биологические и фармацевтические свойства каурановых соединений (Форм. 1) были известны достаточно давно. Большинство исследований были направлены на изучение влияния каураноидов на обмен веществ (Kinghom, AD. 2002, Stevia, by Taylor & Francis Inc.). В частности было показано, что эти соединения влияют на клеточный метаболизм, углеводный метаболизм, абсорбцию глюкозы кишечником, энергетический обмен в митохондриях гепатоцитов, а также на углеводный и кислородный метаболизм в клетках почки. Также было показано, что вышеупомянутые соединения вызывают расширение сосудов и гипотонию. Однако эффекты каураноидов на функцию сердца не вызвали достаточного научного интереса. В частности, эффекты каураноидов на церебральную и сердечную ишемию, аритмию или частоту сокращения сердечной мышцы не были опубликованы.

Где:

R¹ - водород, гидроксил или алкоксил;

R²: карбоксил, карбоксилат, ацил галиды, альдегид, метилгидроксил и эфир ациламида, ацил или эфирная группа, гидролизуемая до карбоксила;

R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁸ (независимо): кислород, гидроксил, метилгидроксил и эфирная или алкилоксиметильная группа, гидролизуемая до метилгидроксила;

R⁷: метил, гидроксил, а также эфир или алкилоксиметил, гидролизуемый до метилгидроксила;

R⁹: метилен или кислород.

Природный стевиозид имеет каурановый скелет в форме агликона; он обладает сладким вкусом (в триста раз слаще сахара) и на протяжении долгого времени использовался во многих странах в качестве пищевой добавки. Ранее было показано, что стевиозид может понизить уровень сахара в крови (Gregersen et al., 2004), а также способен понизить кровяное давление (Chen P et al., 2000). При этом он не влияет на частоту сокращения сердечной мышцы или другие параметры, относящиеся к функции сердца (Hseih МН et al., 2003). В экспериментах на животных было показано, что стевиозид обладает диуретической активностью и способен повысить секрецию инсулина (Jeppeesen РВ, 2000) и понизить энергетический обмен в митохондриях (WHO, 1999). Однако данных о влиянии стевиозида на сердечную и церебральную ишемию в научной литературе нет.

Два хорошо известных каурановых соединения, относящихся к стевиозиду, - это соединение А (Форм.2) и соединение Б (Форм.3).

Агликоновая форма стевиозида, соединение Б, привлекло к себе наибольший научный интерес. Его биологические и фармакологические свойства были подробно исследованы в различных экспериментах на животных. К этим свойствам относятся стимуляция секреции инсулина; ингибирование абсорбции, транспорта и метаболизма углеводов; ингибирование энергетического обмена (Jeppesen ВР, 2000); а также ингибирование тубулярного транспорта некоторых ксенобиотиков и стимулирование выделения натрия и воды в почках (Chatsudthipong et al., 2001). Также было показано, что соединение Б обладает заметной мутагенной активностью (Puzzuto LM et al., 1984). Однако данных, указывающих на влияние соединения Б на нормальную функцию сердца или какие-либо терапевтические свойства в лечении ишемии сердца и реперфузионной травмы, аритмии и инсульта, в научной литературе не имеется.

Соединение Б не может быть катализировано и кливировано от стевиозида при помощи пищеварительных ферментов, но оно подвержено действию кишечной микрофлоры, в результате которого оно может быть абсорбировано. Стевиозид не может быть расщеплен до соединения Б или А после внутривенного введения. Следовательно, результаты, полученные с использованием стевиозида, не могут быть использованы для интерпретации биологической активности агликонов стевиозида, в частности соединения Б или соединения А.

Соединение А и соединение Б обладают относительно низкой биологической токсичностью. Для соединения А минимальная летальная доза (в случае орального приема) составляет 5060 мг/кг для мышей и 3160 мг/кг для крыс. В случае внутривенного введения медиана летальной дозы (LD₅₀) для крыс составляет 503 мг/кг. Основными симптомами токсичности при получении летальной дозы являются расширение сосудов и острая почечная недостаточность (Zhongguo et al., 1994). Медиана летальной дозы соединения Б (в случае орального приема) для крыс составляет 1500 мг/кг (WHO, 1999). По сравнению с другими широко распространенными лекарственными препаратами соединение А и соединение Б являются относительно безопасными.

Основываясь на нашем знании предшествующего уровня техники, мы можем утверждать, что соединение А и соединение Б не использовались в качестве лекарственных препаратов.

Коронарные заболевания и инсульт являются серьезным риском для здоровья человека. Природные лекарственные препараты (например, соединения, полученные из растений рода Digitalis) доступны и эффективны в лечении этих заболеваний. Однако токсичность данных препаратов ограничивает их более широкое клиническое применение. Каурановые соединения (Форм.1) составляют класс природных веществ, которые были досконально изучены и широко применяются в качестве пищевых добавок. Широкое применение этих соединений показало их безвредность для здоровья. Несмотря на распространенность каурановых соединений, их возможное применение для лечения коронарных заболеваний и инсульта ранее не было продемонстрировано. В данном изобретении мы впервые продемонстрировали и сообщаем о терапевтическом применении каурановых соединений, представленных в Форм.1, а также их наиболее эффективные формы для лечения сердечной и мозговой ишемии. Данные свойства были продемонстрированы на общепринятой крысиной модели данных заболеваний. А наиболее эффективные соединения были определены в результате более тщательного фармакологического скринирования.

Сущность изобретения

Цель изобретения

Целью данного изобретения является разработка нового способа или лекарственного препарата, полученного из менее токсичных каурановых соединений, для лечения и профилактики коронарных заболеваний и инсульта. Данный способ или лекарство должны быть эффективнее и безопаснее по сравнению со способами и медикаментами, используемыми при лечении тканевой ишемии и ишемии органов в настоящее время.

Целью данного изобретения также является разработка каурановых соединений для лечения сердечной недостаточности.

Целью данного изобретения также является разработка каурановых соединений для лечения аритмии.

Цель изобретения может быть достигнута путем применения каурановых соединений в производстве фармацевтических препаратов для лечения ишемического повреждения тканей и органов.

Цель данного изобретения может также быть достигнута путем использования нижеописанных способов и технологий.

Вышеописанные ишемические заболевания тканей и органов включают в себя сердечную и мозговую ишемию.

Вышеописанные ишемические заболевания тканей и органов включают в себя повреждение или некроз дистальных отделов конечностей, сетчатки, зрительного нерва и почек.

Вышеописанные сердечная и мозговая ишемии включают в себя коронарные заболевания, инсульт, ишемические травмы головного мозга и травмы вызванные блокировкой-реперфузией сосудов.

Вышеописанные коронарные заболевания включают в себя angina pectoris или острый инфаркт миокарда.

Вышеупомянутый инсульт включает в себя ишемический и геморрагический инсульты.

Вышеупомянутая церебральная ишемия может быть вызвана травмой, геморрагическим шоком, или ухудшенным кровоснабжением, произошедшим в результате стеноза или атеросклероза.

Вышеупомянутые травмы, вызванные блокировкой-реперфузией сосудов, возникают во время коронарной ангиопластики, коронарной тромболитической терапии, при использовании аппаратов искусственного кровоснабжения, церебральной тромболитической терапии.

Цель изобретения может быть достигнута путем применения каурановых соединений в производстве фармацевтических препаратов для лечения сердечной недостаточности. Цель данного изобретения может также быть достигнута путем использования нижеописанных способов и технологий.

Такая сердечная недостаточность включает в себя хроническую недостаточность или недостаточность, вызванную временным снижением функции миокарда.

Цель изобретения может быть достигнута путем применения каурановых соединений в качестве фармацевтических препаратов для лечения и профилактики аритмии.

Цель данного изобретения может также быть достигнута путем использования нижеописанных способов и технологий.

Вышеупомянутая аритмия вызывается сердечной ишемией и реперфузией.

Такая аритмия включает в себя вентрикулярную, супервентрикулярную или атриальную аритмии, в зависимости от их происхождения.

Такая аритмия включает вентрикулярную тахикардию или вентрикулярную фибрилляцию.

В соответствии с данным изобретением, вышеупомянутые каурановые соединения, имеют общую структуру, представленную в Формуле 1.

Где:

R¹ - водород, гидроксил или алкоксил;

R²: карбоксил, карбоксилат, ацил галиды, альдегид, метилгидроксил и эфир ациламида, ацил или эфирная группа, гидролизуемая до карбоксила;

R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁸ (независимо): кислород, гидроксил, метилгидроксил и эфирная или алкилоксиметильная группа, гидролизуемая до метилгидроксила;

R⁷: метил, гидроксил, а также эфир или алкилоксиметил, гидролизуемый до метилгидроксила;

R⁹: метилен или кислород.

Также вышеупомянутые каурановые соединения, где веществом Форм 1. является соединение А, представлены в Форм.2.

Также вышеупомянутые каурановые соединения, где веществом Форм 1. является соединение Б, представлены в Форм.3.

А также вышеупомянутые каурановые соединения, где карбоксилат заменен земельно-щелочным металлом, основным металлом или карбоксилатом аммония.

Вышеуказанные каурановые соединения, в которых описанные медикаменты или фармацевтические препараты включают в себя таблетки, капсулы, гранулы, жидкость для инъекций, анальные или вагинальные свечи, мази и любые медленно растворимые препараты, доставляемые оральным путем, инъекцией, имплантом, катетером и т. д.

Вышеупомянутые цели достигаются данным изобретением путем применения наилучших соединений, описанных ниже.

Раскрытие изобретения

Данное изобретение описывает эффекты каурановых соединений (Форм. 1) в лечении сердечной и церебральной ишемии, аритмии и сердечной недостаточности. Соединения, представленные в Форм. 1, представляют собой класс природных, синтетических или полусинтетических веществ. Многие из них широко известны (Kinghorn AD, 2002, р.86-173; Sinder BB, et al., 1998; Chang FR, et al., 1998; Hsu FL, et al., 2002). Эти вещества могут иметь один или более асимметричных центра и они могут существовать в виде различных стереоизомеров.

Где:

R¹ - водород, гидроксил или алкоксил;

R²: карбоксил, карбоксилат, ацил галиды, альдегид, метилгидроксил, и эфир ациламида, ацил или эфирная группа, гидролизуемая до карбоксила;

R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁸ (независимо): кислород, гидроксил, метилгидроксил и эфирная или алкилоксиметильная группа, гидролизуемая до метилгидроксила;

R⁷: метил, гидроксил, а также эфир или алкилоксиметил, гидролизуемый до метилгидроксила;

R⁹: метилен или кислород.

Группа наиболее активных соединений представлена в Форм.1'. Эти соединения имеют каурановую структуру с заменами в районе 13-го углерода и производными в районе углеродов 17 и 18. Данные соединения могут иметь множество асимметрических центров, и они существуют в форме различных стерео- или диастереоизомеров. Абсолютная конфигурация относительно положений 8 и 13 следующая - (8R, 13S) или (8S, 13R).

Формула 1'Где:R²: карбоксил, карбоксилат, альдегид, метилгидроксил, метил эфир, ацил метил, ацил галиды.R⁷: метил, метил-гидроксил, или метил эфир.R⁹: метилен или кислород

Соединение А может быть получено путем кислотного гидролиза природного стевиозида. Соединение Б является агликоном стевиозида, который в свою очередь является гликозидом соединения Б. Соединения А и Б являются изомерами. Соединение Б может быть получено из стевиозида путем химического гидролиза и окисления или с помощью каталитической бактериальной реакции в кишечнике животных.

Соединение А, химическая формула - С₂₀Н₃₀О₃; химическое название - (4α, 8β, 13β)-13-метил-16-оксо-17-норкауран-18-овая кислота. Оно также называется изостевиол, энт-16-кетобейран-18-овая кислота. Данное соединение является тетрадитерпеном с каурановой структурой и следующей конфигурацией асимметрических углеродов: (4R, 5S, 8R, 9R, 10S, 13S)-, замененная метильная группа у углерода 13, карбонильная группа у углерода 16 и карбоксильная группа у углерода 18 (Rodrigues et al., 1988).

Соединение Б, химическая формула - С₂₀Н₃₀О₃; химическое название - энт-13-гидроксикаур-16-ен-18-овая кислота. Оно также называется стевиол. Данное соединение также является тетрадитерпеном с каурановым каркасом и следующей конфигурацией асимметрических углеродов: (4R, 5S, 8R, 9R, 10S, 13S)-, замененная гидроксильная группа у углерода 13, метиленовая группа, соединенная двойной связью у углерода 16, и карбоксильная группа у углерода 18 (Rodrigues et al., 1988).

Соединения А и Б могут также существовать в форме карбоксилатов в положении 18, где карбоксилат - это натрий и основной металл или хлорид и галоген.

Оба соединения имеют каурановую структуру и являются каурановыми соединениями. Соединению А отдается предпочтение в данном изобретении.

Это изобретение показывает, что соединение А или Б имеют похожий терапевтический эффект при лечении и профилактике ишемической травмы миокарда и аритмии, вызванной ишемией или реперфузией, а также в улучшении функции ишемического миокарда. Подразумевается, что все другие соединения, представленные в Форм. 1, обладают похожими терапевтическими свойствами. Ранее было показано, что большие количества соединения Б, в определенных условиях in vitro, могут вызвать мутагенез. В результате чего, применение соединения А в фармацевтических препаратах предпочтительнее, чем применение соединения Б.

Данное изобретение также описывает связь между активностью и структурой соединений, представленных в Форм.1. Эта связь была установлена в результате сравнения активности соединений А и Б. Подразумевается, что их терапевтическая активность связана с основной структурой кауранового каркаса. Замены некоторых радикалов (у углеродов 13 и 17) или изменение стереоконфигурации (у углеродов 8 и 13) влияют на уровень активности, но не на эффект этих препаратов. Эти данные показывают, что все другие соединения в Форм. 1 могут иметь такой же терапевтический эффект, какой имело соединение А в лечении сердечной ишемии, церебральной ишемии, аритмии, а также в улучшении сердечной функции.

Данное изобретение демонстрирует способы использования соединений Форм. 1 для формирования солей и их применение в приготовлении фармацевтических препаратов для последующего назначения этих препаратов нуждающимся пациентам. Соединения А и Б могут формировать фармацевтически приемлемые соли с щелочными металлами (например, с натрием) и галогеном для того, чтобы повысить их водорастворимость. Соединения А и Б могут быт смешаны с подходящими фармацевтическими носителями и растворителями в твердой или жидкой форме, которые включают в себя таблетки, капсулы, контролируемые или медленнорастворимые формы, инъекции, анальные или вагинальные свечи, трансдермальные аппликаторы, мази и т. д. Эти дозировки, применимые для длительного или короткого использования, могут быть доставлены оральным, внутривенным, анальным, вагинальным путями, или при помощи внутривенного или внутриартериального катетера.

Это изобретение описывает эффективную дозу соединения А, как дозу 0,5-4,0 мг/кг при максимально допустимой дозе 40 мг/кг, введенной внутривенно. Предыдущие данные показали крайне низкую острую токсичность соединения А, медиана летальной дозы составляет 650 мг/кг внутривенно. Основываясь на этих данных, мы можем предсказать безопасную клиническую дозу между 0,1 и 0,2 мг/кг. Другие соединения в Форм. 1, например соединение Б, тоже имеют относительно низкую эффективную и высокую безопасную дозы. В этом изобретении эффективная доза соединения Б составляла 2-8 мг/кг. Ранее было показано, что острое отравление наступает при введении 1500 мг/кг (WHO, 1999). Более того, соединение Б обладает лечебными свойствами, сходными со свойствами соединения А. К таковым относятся: улучшение функции сердца во время ишемии, защита против травмы миокарда, вызванной ишемией и реперфузией, антиаритмическая активность и т.д. В общем, для достижения сопоставимого эффекта требуется больше соединения Б, чем соединения А.

Данное изобретение описывает минимальную эффективную дозу соединений А и Б. Так как соединение А обладает высокой летальной дозой и является относительно безопасным, исследователи традиционно использовали высокие дозы этого вещества и не замечали его эффект при более низких концентрациях. В данном изобретении эффективные дозы соединений А и Б были от 1 до 2 мг/кг для крыс. Эквивалентная доза для свиней составляет от 0,2 до 0,4 мг/кг и для людей - от 0,1 до 0,2 мг/кг, основываясь на относительной поверхности тела. Эффективная доза соединения А и Б в данном изобретении была гораздо ниже, чем ранее описанные дозы. Эти дозы составляли 25 мг/кг соединения А для крыс (Liu CJ, et al., 2001), 250 мг/кг соединения Б для хомяков (Wasuntrawat С, 1998). Для людей применялось 250 и 500 мг стевиозида три раза в день для лечения гипертонии (Chen P, et al., Hseih MH et al., 2003), что соответствует приему 80-160 мг/кг соединения Б перорально, или от 1,2 до 2,4 мг/кг. Последнее было вычислено исходя из молекулярного соотношения соединения Б в стевиозиде.

Предшествующие исследования не смогли обнаружить, что соединения Форм. 1, особенно соединения А и Б, обладают терапевтической активностью в лечении сердечной и церебральной ишемии, что показано в данном изобретении. Данное обстоятельство может иметь под собой две причины: 1) дозы, используемые в ранних исследованиях, были слишком высоки; 2) экспериментальные животные модели, использованные в ранних экспериментах, были не адекватны для изучения ишемии.

Ранее было показано, что интраперитонеальная инъекция большой дозы соединения А (25 мг/кг) вызывает у крыс расширение сосудов и понижение артериального давления (Lucy, et al., 2001). В данном изобретении внутривенное введение соединения А не вызывает у крыс какой-либо гипотонической реакции, но обеспечивает защиту от кардио- и церебральной ишемии. Это указывает на механистическое различие между антиишемической и гипотонической активностью данных препаратов. Более того, различие между эффективными дозами не может быть объяснено различиями в путях введения препаратов (интраперитониально или внутривенно). Результаты токсикологических исследований показали, что медиана летальной дозы соединения А в крысах, не зависит от пути введения. Она составила 503 мг/кг при внутривенном и 617 мг/кг при интраперитониальном введении (Zhonggou et al., 1994). Это, в свою очередь, указывает на отсутствие различия в абсорбции и утилизации соединения А при внутривенном или интраперитониальном введении. Более того, в этом же исследовании было показано, что медиана летальной дозы при оральном употреблении данного препарата составила 3160 мг/кг, что гораздо выше двух вышеупомянутых доз.

Терапевтические эффекты соединений А и Б могут быть обусловлены несколькими механизмами. Ранее было показано, что гипотоническая активность соединения А может быть обусловлена вовлечением калиевых каналов на мембране миоцитов (Wang KL et al., 2004). В то же время было показано, что калиевые каналы не вовлечены в стимуляцию секреции инсулина под действием соединения A (Jeppesen PB, et al., 2000). В данном изобретении мы показали, что антиишемическая активность соединений А и Б может быть только частично заблокирована 5-ОН-декадонатом (блокатором АТФ-зависимых калиевых каналов).

Цели данного изобретения достигаются благодаря использованию хорошо охарактеризованной крысиной модели ишемии-реперфузии, которая достоверно отражает симптомы клинической патологии. Сердечная недостаточность, аритмия и повреждения сердечной мышцы были очевидны во время блокировки/открытия коронарных сосудов у крыс, что хорошо корреллируется с клиническими симптомами сердечного приступа и коронарной реперфузии, вызванной тромболитической терапией или ангиопластикой.

Данная экспериментальная модель также подходит для изучения аритмии. Так как ишемия-реперфузия вовлечена во многие патологические процессы, аритмия, воспроизведенная в данном изобретении, может соответствовать клинической аритмии, вызванной различными факторами.

Данная экспериментальная модель также подходит для изучения сердечной недостаточности, в которой снижение сердечной функции ведет к локальным ишемическим повреждениям миокарда, которые в конечном итоге приводят к остановке сердца. Данные симптомы соответствуют клинической сердечной недостаточности.

Как указанно выше, изобретение описывает способ лечения и профилактики коронарных заболеваний, сердечной недостаточности, аритмии и инсульта с применением каурановых соединений в качестве активных компонентов фармацевтических препаратов. Среди таких соединений, соединение Б, агликон стевиозида, является предпочтительным. Более желательным является соединение А, продукт кислотного гидролиза стевиозида. Изобретение описывает способ использования вышеописанных изобретений для защиты от повреждений, вызванных ишемией и реперфузией, улучшения функции сердечной мышцы, защиты против аритмии и снижения риска вентрикулярной тахикардии и фибрилляции. Изобретение также демонстрирует, при помощи использования модели ишемии головного мозга, применение вышеуказанных соединений для защиты от инсульта и ишемии и для сохранения функции головного мозга во время ишемии.

Главные преимущества данного изобретения включают в себя следующие аспекты.

1. Терапевтическое применение каурановых соединений, включая соединения А и Б, для лечения и профилактики сердечной и церебральной ишемических болезней, аритмии и сердечной недостаточности. Эти соединения получены из растений, которые употреблялись и употребляются человеком на протяжении многих лет. В частности, соединения А и Б могут обладать большим клиническим потенциалом благодаря их относительно высокой эффективности и высокой безопасной дозе, а также благодаря их лечебной и профилактической природе.

2. Изобретение впервые изучает эффекты соединений Форм. 1 на ультраструктуру кардиомиоцитов. Изобретение, с использованием морфологических и функциональных методов, воспроизводит патологию ишемии миокарда в экспериментальных животных моделях и демонстрирует, что данные соединения, особенно соединения А и Б, эффективны в защите от ишемических повреждений сердечной мышцы и митохондрий, уменьшении области инфаркта, сохранении и улучшении функции сердечной мышцы и снижении риска острой аритмии во время ишемии.

3. Изобретение впервые описывает значительный положительный ионотропный эффект каурановых соединений на миокард, который может снизить уровень ухудшения функции сердечной мышцы или сохранить нормальную функцию миокарда во время ишемии. В клинике, острая или хроническая сердечная недостаточность, связанная с ухудшением функции сердца, может быть излечена при помощи соединений А и Б. Уникальным преимуществом соединений Форм. 1 является то, что они снижают риск острой аритмии и предотвращают повреждение миокарда во время ишемии, при этом улучшая функцию сердечной мышцы. Терапевтический индекс каурановых соединений гораздо выше терапевтического индекса гликозидов, выделенных из растений рода Digitalis. Данные гликозиды находятся в широком употреблении как класс положительных ионотропных соединений, в то же время, в случае превышения дозы, они ухудшают состояние ишемического миокарда, увеличивают область инфаркта и вызывают острую аритмию. Учитывая данные ограничения, введение в клиническое использование каурановых соединений крайне важно.

4. Изобретение описывает значительный эффект, защищающий от реперфузионной травмы. Сердечная реперфузионная травма может возникнуть во время проведения клинических процедур, включая ангиопластику, установку стента, оперативное коронарное шунтирование, тромболитическую терапию, медикаментозную коронарную диаляцию, использование аппарата искусственного кровообращения и т. д. Механизмы, вызывающие данную травму, могут включать избыток кислородных радикалов, кальциевую перегрузку и другие факторы. Реперфузия может привести к остановке сердца, летальной аритмии, в частности к вентрикулярной тахикардии, и фибрилляции, что было показано в данном изобретении. Изобретение указывает на то, что применение соединений А и Б может значительно снизить повреждение миокарда, понизить риск вентрикулярной тахикардии и фибрилляции, вызванных реперфузией, и сохранить нормальную функцию сердца. Таким образом, вышеуказанные каурановые соединения, в частности соединения А и Б, могут быть использованы в качестве медикаментов для лечения и профилактики реперфузионных повреждений, вызванных ранее описанными процедурами или спонтанной коронарной реперфузией, вызванной спазмом или тромбами.

5. Данное изобретение описывает применение каурановых соединений для лечения аритмии. Частота возникновения и продолжительность вентрикулярной тахикардии и фибрилляции, вызванных коронарной ишемией и реперфузией у крыс, были значительно снижены введением соединений А или Б. Соединения Форм. 1, в частности соединения А и Б, описанные в данном изобретении, могут быть использованы в качестве лекарственных препаратов для лечения аритмии, вызванной ишемией и реперфузией, а также для лечения аритмии, вызванной другими факторами. Последнее утверждение основывается на том, что экспериментальная модель реперфузии вовлекает в себя многие патологические процессы.

6. Данное изобретение описывает применение каурановых соединений для защиты от инсульта или травмы головного мозга. Основные жизненно важные функции головного мозга, например дыхательная функция, теряются очень быстро после нарушения кровоснабжения головного мозга у мышей. Однако продолжительность сохранения дыхательной функции головного после потери кровоснабжения головного мозга у мышей, получивших каурановые соединения А или Б, значительно удлинена. Данный результат указывает на то, что каурановые соединения обладают значительной терапевтической активностью в лечении и профилактике инсульта (включая ишемический и геморрагический инсульты), церебральной ишемии или травмы, вызванной нарушением кровообращения или черепно-мозговой травмой.

7. Данное изобретение описывает способ применения каурановых соединений для защиты сердечных или мозговых тканей от ишемии. Оно также описывает способ применения данных соединений для лечения и профилактики ишемического некроза дистальных отделов конечностей, вызванных диабетом или периферической артериальной ненормальностью, ишемии сетчатки и зрительного нерва, ишемии почек (острой почечной недостаточности) и т. д.

8. Данное изобретение показывает нелинейную зависимость между дозой каурановых соединений и ответом организма. Введение соединения А вызывает дозонезависимое усиление сокращаемости сердечной мышцы, повышение вводимой дозы выше определенного уровня не приводит к соответствующему повышению сокращаемости миокарда. При достижении крайне высокой дозы, эффект каураноидов на сокращаемость миокарда может быть устранен. В экспериментах на свиньях катетер, оснащенный надувным баллончиком на конце, был введен в левую нисходящую коронарную артерию при помощи рентгенового ангиографа. Коронарная ишемия и реперфузия была репродуцирована с помощью инфляции или дефляции баллончика на конце катетера. Острая аритмия, вызванная ишемией, была эффективно предотвращена у свиней, получивших низкую дозу каурановых соединений (т.е. соединение А). Данная доза, как таковая, не обладает заметным эффектом на сердце до наступления ишемии. Введение через катетер в коронарную артерию крайне высокой дозы соединения А (в 20 раз превышающей предыдущую) привело к значительному снижению функции сердечной мышцы. Этот результат указывает на то, что каурановые соединения могут влиять на различные рецепторы или клетки-мишени с различной аффинностью.

Высокая доза каурановых соединений может вызвать противоположный или нежелательный эффект, который может снизить или предотвратить ранее описанные терапевтические эффекты.

9. Данное изобретение также направлено на разработку способа для терапевтического и профилактического применения каурановых соединений. Исходя из того что назначение животным соединений А или Б может эффективно защитить сердце и головной мозг от ишемической и реперфузионной травмы и каурановые соединения обладают хорошим профилем безопасности, данные соединения подходят для лечения и профилактики коронарных и церебральных артериальных заболеваний. В клинике соединение А может быть использовано в течение долгого времени как профилактическое средство для пациентов повышенной группы риска развития ишемической болезни сердца, сердечного приступа, церебральной ишемии или эмболии, острой аритмии, а также реперфузионной травмы.

В целом, данное изобретение относится к способам применения каурановых соединений Форм. 1 в качестве активных ингредиентов в различных фармацевтических препаратах, используемых для лечения и профилактики коронарных заболеваний, инсульта, заболеваний, относящихся к ишемии тканей или органов, аритмии и сердечной недостаточности. Соединение Б и А являются предпочтительным и более предпочтительным соединением соответственно в данном изобретении.

Соединения Форм. 1 существуют в природе или производятся путем искусственного синтеза. Согласно изобретению соединения Форм. 1 проскринированы и эвалюированы с использованием экспериментальных моделей ишемии-реперфузии у крыс и церебральной ишемии у мышей. Главными терапевтическими и фармацевтическими эффектами, открытыми данным изобретением, являются: положительный ионотропный эффект в ишемическом сердце, повышение левого вентрикулярного систолического давления, максимально изменяемый уровень левого вентрикулярного давления (dp/dt_Max mmHg/s) и сокращаемости сердца. Гистологическое исследование выявило, что соединения Форм. 1 предотвращают ишемическую травму миокарда и митохондрий и уменьшают размер области ишемического инфаркта, а также сохраняют контрактильную функцию миокарда во время реперфузии. В контрольной группе острая аритмия или вентрикулярная тахикардия и фибрилляция наблюдается у всех животных во время обоих периодов ишемии и реперфузии. Одна треть животных умерла в результате продолжения вентрикулярной фибрилляции. В экспериментальной группе животных, получивших соединения Форм. 1, аритмия не вызвала ни одного случая смертельного исхода. Частота возникновения, количество повторных случаев и продолжительность вентрикулярной фибрилляции во время ишемии и реперфузии были значительно сокращены. Замечательным преимуществом соединений Форм. 1 является их способность одновременно предотвратить ишемию миокарда и аритмию и в то же время улучшить контрактильную функцию сердца. Данные соединения очевидно обладают лучшим терапевтическим индексом по сравнению с Digitalis гликозидами, которые обладают побочными эффектами, включая усиление аритмии и ухудшение ишемии миокарда. У животных, страдающих церебральной ишемией, соединения Форм. 1 могут защитить головной мозг от ишемии и значительно продлить его функцию. Согласно данному изобретению каурановые соединения Форм. 1 могут быть использованы в качестве лечебных препаратов для следующих клинических аспектов: для лечения и профилактики ишемических заболеваний сердца (коронарных заболеваний), таких как angina pectoris и острый инфаркт миокарда; в качестве положительного ионотропного агента для лечения и профилактики нарушения функции или сердечной недостаточности (в том числе хронической сердечной недостаточности); для лечения и профилактики аритмии, в том числе вентрикулярной тахикардии и фибрилляции; для лечения и профилактики кардио- или церебральной реперфузионной травмы; для лечения и профилактики ишемического инсульта, геморрагического инсульта и других сосудистых заболеваний головного мозга, а также повреждений головного мозга, вызванных шоком или травмой головы; для лечения и профилактики ишемических повреждений поверхности конечностей, сетчатки и зрительного нерва или почек.

Терапевтический эффект соединений Форм.1 дозозависим внутри определенных пределов. В целом, соединение А эффективнее соединения Б.

Соединения Форм.1, включая соединения А и Б, можно формировать с фармацевтически приемлемыми солями с другими веществами, такими как основные металлы (натрий) и галогены. Они могут быть комбинированы с фармацевтическими носителями для формирования фармацевтических препаратов. Соединения Форм.1 и их фармацевтические препараты могут быть введены орально, внутривенно или другими путями и доставлены через катетер внутривенно или внутриартериально.

В настоящее время существует недостаток клинически доступных медикаментов, обладающих высокой эффективностью и низкой токсичностью, для лечения коронарных заболеваний, инсульта, сердечной недостаточности и аритмии. Учитывая данный недостаток, изобретение предлагает более желательное лекарство, обладающее высокой эффективностью и низкими побочными эффектами, полученное из низко биотоксичных каурановых соединений. Данные соединения лучше, чем соединения, используемые в настоящее время для лечения коронарных заболеваний, инсульта, сердечной недостаточности и аритмии. Предшествующие эксперименты с применением каурановых соединений не применяли похожие экспериментальные модели и не обнаружили свойства каураноидов, описанных в данном изобретении. Изобретение впервые демонстрирует влияние каурановых соединений на структуру кардиомиоцитов. Изобретение описывает максимальную активность и эффективность данных соединений in vivo, которые были гораздо выше ранее описанных. Далее, данные соединения обладают терапевтическим индексом выше, чем таковой, присущий соединениям, используемым для лечения сердечной недостаточности и аритмии в настоящее время. Очевидно что данное изобретение описывает новое терапевтическое применение каурановых соединений, и данное применение не являлось очевидным.

Выше было приведено общее описание изобретения. Методы и технологии, соответствующие данному изобретению, проиллюстрированы ниже таким образом, что они могут быть воспроизведены квалифицированным работником.

Методологии и сущность данного изобретения приведены в следующих примерах.

Примеры

Для того чтобы проиллюстрировать технологии, использованные для достижения цели данного изобретения, методы, процедуры и особые свойства, относящиеся к обнаружению и определению фармацевтической и терапевтической пользы каурановых соединений, подробно описаны ниже.

Примеры описывают экспериментальные методы и результаты, которые использовались для поддержки изобретения и для валидирования животных моделей, использованных в данном изобретении. Соответствующий контроль и статистический анализ использованы во всех экспериментах данного изобретения. Следующие примеры приведены для иллюстрации, а не ограничения данного изобретения. Данные примеры иллюстрируют методы и технологии, использованные для скринирования и определения терапевтического применения некоторых каурановых соединений из соединений Форм 1. Терапевтическое применение других соединений Форм. 1 может быть определено таким же способом.

Материалы

Животные: крысы Sprague Dawley или мыши обоих полов. Химикаты: соединение А (энт-17-норкаурен-16-оксо-18-овая кислота, молекулярная формула C₂₀H₄₀O₃, молекулярная масса 318,5) получено из стевиозида путем кислотного гидролиза, кристаллизации и очистки. Структура соединения А подтверждена методом ядерного магнитного резонанса, которая соответствует ранее опубликованным данным. Чистота соединения А выше 99%, что было определенно методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Соединение Б (энт-13-гидпроксикаур-16-ен-18-овая кислота) получено из стевиозида путем последовательного окисления, гидролиза, ацидификации, экстракции, очистки и кристаллизации. Структура соединения Б подтверждена методом ядерного магнитного резонанса, которая соответствует ранее опубликованным данным (Mosettig Е. et al., 1963). Чистота соединения Б выше 99%, что было определенно методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Назначение экспериментальных соединений: внутривенная или интраперитониальная инъекции или оральный прием. Дозировка: соединение А - от 0,5 мг/кг до 4 мг/кг; соединение Б - от 2 мг/кг до 8 мг/кг.

Методы

1. Измерение кардиодинамических параметров.

Крысы были анастезированы, трахеотомированы, а интубационная канюля была соединена с аппаратом искусственного дыхания. Артериальное кровяное давление измерялось при помощи монитора давления, расположенного на бедренной артерии. Для измерения вентрикулярного давления датчик Миллера был введен в левый желудочек через каротидную артерию. Датчики давления были подсоединены к «Power-lab» - записывающей системе реального времени. ЭКГ наблюдалась и записывалась с помощью подкожных игольчатых электродов, расположенных на передних конечностях крыс. Записываемые параметры включали: среднее артериальное кровяное давление (САД), левое вентрикулярное систолическое давление (ЛВСД), первую производную от левого вентрикулярного давления (±dp/dt_Max), левое вентрикулярное диастолическое давление (ЛВДД), левое вентрикулярное конечное диастолическое давление (ЛВКДД) и частоту сокращений сердца (ЧСС).

2. Разработка экспериментальной модели ишемии-реперфузии у животных.

Грудная клетка была вскрыта левосторонней торакотомией в четвертом межреберном пространстве. Перикард был вскрыт для открытия доступа к сердцу. Петля из хирургического шелка была сформирована вокруг левой коронарной артерии (ЛКА). По окончании операции животное восстанавливалось в течение 10 минут, а затем блокировку ЛКА вызывали при помощи затягивания ранее сформированной петли. Успех блокировки был ассоциирован с формированием области перкардиоцианоза, повышенная Т волна или СТ сегмент на ЭКГ. Ишемический период блокировки поддерживался на протяжении 20 или 30 минут. Кардиореперфузия достигалась путем расслабления петли и подтверждалась гиперемическим порозовением ранее ишемической области цианоза и постепенной нормализацией ЭКГ. Реперфузия поддерживалась в течение 50 или 80 минут. ЭКГ, САД и другие кардиодинамические данные записывались до (контроль) и во время периодов ишемии и реперфузии.

Вышеописанная экспериментальная модель была хорошо охарактеризована и использовалась в течение долгого времени в соответствующих исследованиях (Liu, Y and J. Downey, 1992).

Период ишемии: блокировка ЛКА приводит к локальной ишемии миокарда у крыс, которая аналогична симптомам и патологии острого инфаркта миокарда в клинике.

Период реперфузии: после расслабления петли и открытия коронарной артерии сердца кровоток к сердечной мышце был восстановлен, что соответствует ишемии-реперфузии, наблюдаемой в клинике, такой как открытие блокированной коронарной артерии при помощи катетера, медикаментозной интервенции или спонтанного тромболизиса, устранение коронарного спазма, использование аппарата искусственного кровообращения или коронарного шунтирования. Вышеописанные клинические ситуации могут возникнуть в результате быстрой реперфузии, и они могут привести к травме миокарда и аритмии.

3. Протокол эксперимента и разбиение животных по группам.

Группы животных: крысы были случайно распределены в следующие группы, содержащие от 6 до 8 животных с равным количеством животных разного пола.

Контрольная группа: блокировка ЛКА/ишемия-реперфузия. Экспериментальная группа: блокировка ЛКА/ишемия-реперфузия плюс прием соединений А или Б. SHAM-операция: блокировка ЛКА/ишемия-реперфузия отсутствует, животные подвергались только левосторонней торакотомии и открытию перикарда.

Протокол:

Контрольная группа--10 мин-----20 мин---------50 мин-----------(физиологический раствор) в.в. блокировка ЛКАоткрытие блокировки, реперфузияЭкспериментальная группа--10 мин-----20-----------50--------------(экспериментальное соединение в.в.) блокировка ЛКАоткрытие блокировки, репефузия

Для усиления результатов ишемии-реперфузии в части экспериментов период коронарной блокировки и открытия были установлены на 30 мин и 80 мин соответственно.

4. Статистический анализ.

Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Т-тест или парный Т-тест использовались для сравнения двух групп. Для сравнения количественных данных использовался 2×2 зависимый тест.

Пример 1.

Данный пример иллюстрирует эффекты соединения А в защите и улучшении функции ишемического сердца и его влияние на кардиодинамические данные.

В табл. 1 показаны значительные изменения в контрольной группе, до и после коронарной блокировки, в ЧСС, -dp/dt_Max, тенденция повышения САД и понижения ЛВКДД были незначительны (Р>0,05). Однако параметры ЛВСД и +dp/dt_Max, которые отражают контрактильную функцию сердца, были значительно снижены после ишемии, вызванной коронарной блокировкой (Р<0,01). Данные результаты показывают, что контрактильная функция сердца у животных контрольной группы была значительно снижена во время ишемии.

Таблица 1.
Кардиодинамические изменения до и после ишемии, вызванной коронарной блокировкой и реперфузией (контрольная группа, N=8) ЧСС удары/минСАД (мм Hg)ЛВСД (мм Hg)+dp/dt_Мах. ЛВСД (мм Hg/с)До ишемии372±1771±3118±68704±326Ишемия388±1567±498±2**6472±219**Реперфузия389±1162±6107±4*6437±395***значитильное различие по сравнению с данными, полученными до ишемии *Р<0.05**Р<0.01.+dp/dt_Мах. LVSP: Максимальная скорость изменения ЛВСД (левого вентрикулярного систолического давления), САД: среднее артериальное давление, ЧСС: частота сердечных сокращений.

Результаты в экспериментальной группе отличаются от результатов в контрольной группе. В табл. 2 показано, что после ишемии, вызванной коронарной блокировкой, все кардиодинамические показатели, включая ЛВСД и +dp/dt_Мах.ЛВСД, не изменились по сравнению с доишемическими показателями. Сравнивая результаты контрольной и экспериментальной групп, можно заключить, что соединение А обладает значительным защитным эффектом на контрактильную функцию в ишемическом сердце.

Таблица 2.
Кардиодинамические изменения до и после ишемии, вызванной коронарной блокировкой и реперфузией (экпериментальная группа соединения А, N=8) ЧСС удары/минСАД (мм Hg)ЛВСД (мм Hg)+dp/dt_Мах. ЛВСД (мм Hg/с)До ишемии367±1373±3111±48543±486Ишемия375±1070±5103±37468±558Реперфузия394±776±3114±58431±340+dp/dt_Мах. LVSP: Максимальная скорость изменения ЛВСД (левого вентрикулярного систолического давления), САД: среднее артериальное давление, ЧСС: частота сердечных сокращений.

Пример 2.

Данный пример иллюстрирует терапевтические эффекты соединения А в лечении аритмии.

Аритмия, вентрикулярная тахикардия (ВТ) и вентрикулярная фибрилляция (ВФ) являются основными причинами смерти в клинике. Во время ишемии в контрольной группе ВТ наблюдалась у всех 11 животных, ВФ наблюдалась в 10 из 11 животных, а 3 из 11 животных умерли в результате продолжения ВФ. В то же время в экспериментальной группе, получившей соединение А, все животные выжили после сердечной ишемии. Результаты, полученные из обоих контрольной и экспериментальной групп, включая частоту возникновения, время возникновения и продолжительность ВТ и ВФ, представлены в табл. 3. Эти результаты показывают, что во время ишемии в экспериментальной группе, получившей соединение А (1 мг/кг), по сравнению с контрольной, частота возникновения и продолжительность ВТ и ВФ были значительно снижены (Р<0,01), а возникновение ВТ и ВФ было значительно задержано (Р<0,01), что показывает способность соединения А защитить функцию сердца и эффективно снизить риск и серьезность летальной аритмии, включая ВТ и ВФ.

Таблица 3.
Терапевтические эффекты соединений А и Б на лечение аритмии (20-минутная коронарная блокировка) ВТ Частота (%)Продолжительность (с)ВФ Частота (%)Продолжительность (с)ВТ или ВФ
Время наступления (с)ВТ+ВФ
счетКонтроль (n=8)8/8 (100)34+107/8 (91)37+11370 +41107+31Соединение А *(n=7) (1 мг/кг)3/7 (43)12+61/7 (14)1730+16614+7Соединение Б*(n=7) (2 мг/кг)2/5 (40)21+121/5 (20)1660+ 17822+13* значительное различие по сравнению с контрольной группой (Р<0.01).Счет ВТ+ВФ = (продолжительность ВТ х 1) + (продолжительность ВФ × 2). ВТ - вентрикулярная тахикардия; ВФ - вентрикулярная фибрилляция.

Пример 3.

Данный пример иллюстрирует кардиозащитный эффект соединения А во время реперфузии после ишемии и изменение кардиодинамики.

В контрольной группе, за 50 мин постишемической реперфузии, кардиодинамические параметры функции сердца остаются пониженными, так же как и во время ишемии. По сравнению с предишемией ЛВСД и +dp/dt_Мах.ЛВСД, которые отражают контрактильную функцию сердца, значительно снижены (Р<0.05 и Р<0.01 соответственно), хотя ЧСС, ЛВКДД и -dp/dt_Max.ЛВСД не изменились. САД было незначительно снижено (Р>0.05). Эти результаты показывают, что в контрольной группе реперфузия приводит к снижению сердечной контрактильности, так же как и во время ишемии (см. табл.1). Однако во время реперфузии в контрольной группе, получившей соединение А (1 мг/кг), ЛВСД, +dp/dt_Мах.ЛВСД и другие кардиодинамические параметры оставались в пределах нормы. По сравнению с ишемическим периодом САД, ЛВСД, +dp/dt_Мах.ЛВСД незначительно повышались (Р>0.05, см. табл.2). Вышеупомянутые результаты, полученные из обеих групп, показывают, что соединение А обладает значительным защитным эффектом на контрактильную функцию сердца против реперфузии.

Пример 4.

Этот пример иллюстрирует эффект соединения А на сокращение размера инфаркта во время ишемии.

Определение размера инфаркта миокарда: в обеих контрольной и экспериментальной группах после реперфузии, ЛКА была заблокирована и синий краситель Эванса был введен, чтобы определить ишемическую и неишемическую области миокарда. Затем сердце было удалено, заморожено, гистологические срезы были приготовлены и промыты трис-буфером. Срезы были изучены под микроскопом. Области инфаркта и ишемии (зона риска) были отличены в соответствии с интенсивностью окраски. После взвешивания соответствующих тканевых образцов, размер инфаркта миокарда был рассчитан и представлен в соответствии со следующей формулой: размер инфаркта = вес инфарктной ткани / (вес инфарктной ткани + вес ишемической ткани) × 100%.

Результаты: Размер постишемического инфаркта составил в контрольной группе 58,6±4,7% и в экспериментальной группе, получившей соединение А (1 мг/кг), - 45,8±2,9%, что значительно отличается друг от друга (Р<0,01). Эти данные показывают, что соединение А способно сократить размер инфаркта миокарда.

Пример 5.

Этот пример иллюстрирует защитный эффект соединения А на морфологию ишемического миокарда.

В конце эксперимента ишемический и неишемический миокард были выделены из обеих контрольной и экспериментальной (соединение А 1 мг/кг) групп, а также из соответствующего региона сердца SHAM-оперированных животных. Ткани были зафиксированы параформальдегидом, залиты в парафин, нарезаны в ультратонкие срезы, покрашены и изучены под световым или электронным микроскопами.

Под световым микроскопом срезы были изучены, используя 100-кратное увеличение. В неишемическом кардиомиоците стриата миокарда ярко выражена; узкое интермиоцитарное пространство, признаки эдемы или воспаления отсутствуют. В ишемических миоцитах нормальная стриата отсутствует, очевидно присутствие вакуолярной деградации. Было обнаружено большое интермиоцитарное пространство с явными признаками эдемы и инфильтрации воспалительных клеток. Разрушение миоцитов было также очевидно. В экспериментальной группе, получившей соединение А, стриаты были видны. Вакуолярная деградация не обнаружена. Интермиоцитарное пространство нормального размера без признаков эдемы и редкими воспалительными клетками. Разрушение миоцитов неочевидно.

Сверхтонкие срезы были изучены при 1200-кратном увеличении с использованием трансмиссионного электронного микроскопа. В неишемическом миоците мембраны миоцита и митохондрий сохранили свою целостность. Внутри митохондрий кристы были высокой плотности, распределение матрикс гранул нормальное. В ишемической контрольной группе клеточные мембраны были разрушены, митохондрий были вздуты, митохондриальные мембраны разрушены. Потеря матрикса и большие вакуоли были очевидны. Количество митохондриальных кристов было снижено, они были нерегулярные и разрушенные. Митохондриальные повреждения, по сравнению с нормальным контролем, были очевидны. В экспериментальной группе, обработанной соединением А, мембраны миоцитов и митохондрий сохранили свою целостность. Плотность кристов и матрикса и распределение гранул были нормальными. Повреждений миоцитов и митохондрий, по сравнению с нормальным контролем, замечено не было.

Гистологические данные показали значительный защитный эффект соединения А на миокард, данный эффект был достигнут благодаря снижению ишемического повреждения миоцитов и митохондрий.

Примеры с 6 по 8 иллюстрируют фармацевтическое и терапевтическое применение соединения Б.

Пример 6.

Данный пример иллюстрирует защитный эффект соединения Б на морфологию ишемического миокарда, вызванную коронарной блокировкой.

Соединение Б является изомером соединения А. Этот пример иллюстрирует защитный эффект соединения Б на ишемического миокарда.

Аналогично примеру 5 за исключением того, что экспериментальная группа была обработана соединением Б. Ткани миокарда были выделены и приготовлены, как описано выше. Миоциты и их ультраструктура были изучены под световым и трансмиссионным электронным микроскопами. Результаты показали, что в экспериментальной группе, обработанной соединением Б, миоцитарные митохондрильные мембраны сохранили свою целостность. Плотность кристов и матрикса выглядит нормальной. Распределение гранул внутри митохондрий нормальное. Повреждения миоцитов и митохондрий, по сравнению с нормальным контролем, отсутствовали. Гистологические результаты были сходны с таковыми, полученными при обработке животных соединением А (1 мг/кг), и указывают на значительный защитный эффект соединения Б на миокард, достигаемый благодаря снижению ишемического повреждения миоцитов и митохондрий.

Пример 7.

Этот пример иллюстрирует терапевтическое применение соединения Б для лечения аритмии во время ишемии сердца.

Аналогично примеру 2 было изучено терапевтическое применение соединения Б для лечения аритмии. Были получены следующие результаты: (также см. табл.2 в примере 2). В контрольной группе вентрикулярная тахикардия возникла у всех 11 животных, 3 из 11 животных умерли в результате продолжения вентрикулярной фибрилляции. Однако в контрольной группе (n=5), обработанной соединением Б (2 мг/кг), все животные пережили ишемию сердца. По сравнению с контролем, частота возникновения и продолжительность вентрикулярной тахикардии и фибрилляции, вызванных кардиоишемией, значительно (Р<0,01) снижены, время их возникновения значительно (Р<0,01) задержано. В дополнение, терапевтический эффект соединения Б при дозе в 2 мг/кг сходен с таковым эффектом соединения А при дозе 1 мг/кг (см. табл.3 в примере 2), что указывает на более высокую активность соединения А по сравнению с соединением Б.

Пример 8.

Данный пример иллюстрирует терапевтическое применение соединения Б для усиления контрактильной функции сердца во время ишемии.

Аналогично примеру 1, было изучено терапевтическое применение соединения Б. Были получены следующие результаты. В контрольной (ишемической) группе левое вентрикулярное систолическое давление (ЛВСД) и его максимальная скорость изменения (+dp/dt_Мах.ЛВСД) до возникновения ишемии составили 118±6 мм ртутного столба (мм Hg) и 8704±326 мм Hg/с соответственно; во время ишемии они составили 98±2 ммHg и 6472±219 мм Hg/с. Во время реперфузии ЛВСД и +dp/dt _Мах.ЛВСД составили 107±4 мм Hg и 6437±395 мм Hg/с соответственно. ЛВСД во время ишемии и реперфузии были значительно (Р<0,01) снижены. Эти данные указывают на то, что ишемия и реперфузия, в контрольной (ишемической) группе, значительно снижает контрактильную фунцию сердца.

С другой стороны в экспериментальной группе животных, обработанных соединением Б (2 мг/кг), ЛВСД и +dp/dt_Мах.ЛВСД до возникновения ишемии составили 112±5 мм Hg и 8704±326 мм Hg/с; во время ишемии они составили 104±4 мм Hg и 7592±433 мм Hg/с; во время реперфузии они составили 110±4 мм Hg и 8362±498 мм Hg/с соответственно. ЛВСД во время ишемии и реперфузии незначительно (Р>0,05) отличались от нормальных показателей. Эти результаты указывают на то, что контрактильная функция сердца во время ишемии и реперфузии у животных, обработанных соединением Б, не изменяется.

Вышепредставленные данные показывают, что соединение Б может значительно защитить сердце от ишемии и улучшить его контрактильную функцию.

Очевидно, что эффекты соединения Б схожи с эффектами соединения А в аспектах улучшения контрактильной функции ишемического сердца, защиты или предотвращения ишемического и реперфузионного повреждений, понижения аритмии, вызванной ишемией и реперфузией. В общем, соединение А сильнее соединения Б.

Пример 9.

Этот пример иллюстрирует то, что природный стевиозид не обладает терапевтическими свойствами, описанными в данном изобретении.

Аналогично примеру 1 терапевтические эффекты стевиозида были изучены на крысах. В контрольной группе, обработанной стевизидом (от 10 до 15 мг/кг) заметное терапевтическое влияние на контрактильную функцию сердца или аритмию отсутствует. Результаты показывают, что стевиозид, как таковой, не обладает терапевтическими свойствами, присущими соединениям А или Б.

Пример 10.

Данный пример иллюстрирует терапевтический эффект соединений А или Б при лечении церебральной ишемии.

Экспериментальная модель ишемии головного мозга и экспериментальные методы.

Модель с использованием декапитированной мыши. В данной модели мышь обезглавливается, а дыхательные движения регистрируются по движению рта животного. Частота и продолжительность открытия рта использовалась в качестве показателя церебральной функции после декапитации. Животные были случайно распределены между тремя группами (n=8, равное количество животных разного пола): контрольная группа - получили только физиологический раствор; экспериментальная группа - соединение А (4 мг/кг) или Б (8 мг/кг), растворенные в физиологическом растворе; положительная контрольная группа - Эдаравон (8 мг/кг), растворенный в физиологическом растворе. Эдаравон является антиоксидантом и обладает свойствами, защищающими от нейротравмы (Grani A. et а1., 1996).

Носитель или лекарственные препараты были введены интраперитониально за 30 минут до декапитации.

Результаты. В обеих экспериментальных группах соединений А или Б и в группе Эндаравона, частота и продолжительность открытия рта были значительно увеличены, по сравнению с контрольной группой, что указывает на то, что соединения А и Б обладают терапевтическим эффектом в защите от ишемического повреждения головного мозга и центральной нервной системы.

Терапевтические эффекты соединения А (4 мг/кг) или Б (8 мг/кг) были сходны с эффектом Эндаравона (8 мг/кг); эти результаты представлены в табл.4.

Таблица 4.
Терапевтические эффекты соединений А и Б на лечение церебральной ишемии Частота открытия ртаПродолжительность (с)Контроль9.7±1.610.5±2.9Соединение А, 4 мг/кг14.0±3.2*22.9±5*Соединение Б, 8 мг/кг12.8±2.7*20.1±4.1*Эндаравон, 8 мг/кг13.1±2.4*17.1±4.3** значительное различие по сравнению с контрольной группой (Р<0,05).

Пример 11.

Этот пример иллюстрирует способ приготовления фармацевтически приемлемой соли соединений А или Б и их жидких инъекционных форм.

Приготовление жидких инъекционных форм. Соединения А и Б нерастворимы в воде, следовательно, приготовление растворимой соли данных соединений совершенно необходимо. Соль может быть натриевая, калиевая или другая неорганическая соль. Использование натрия предпочтительно. Раствор натриевой соли соединения А или Б приготовляется путем добавления этих соединений к 10 мл 0,01 молярного раствора NaOH и доведения рН раствора до нейтрального. Этот раствор натриевой соли может быть разведен далее в стерильной воде или смешан с фармацевтическим носителем при концентрации, необходимой для парентерального введения. Раствор может храниться при комнатой температуре.

Пример 12.

Данный пример иллюстрирует приготовление фармацевтических препаратов, содержащих соединение А, для терапевтического использования.

В целом, соединение А может быть использовано в качестве активного ингредиента и смешано с различными приемлемыми фармацевтическими носителями. Каурановые соединения, включая соединения А и Б, могут быть абсорбированы через кишечник, следовательно, они также могут быть использованы в твердых фармацевтических препаратах для орального употребления.

Приготовление фармацевтических препаратов в твердой форме. Каурановые соединения, в частности соединения А или Б, были смешаны с фармацевтическими носителями, такими как крахмал, лактоза, натриевый карбоксил метилцеллюлозы и т. д. Эти смеси могут быть использованы для приготовления таблеток, капсул, гранул и т.д. для орального употребления.

Таблетки. Соединение А смешивается в различных пропорциях (1-99%) с подходящим носителем (крахмал, лактоза, сахароза, декстрин, микрокристаллическая целлюлоза); дезинтеграторами (сухой крахмал, натриевый карбоксил крахмала, кросповидон, низкозамещенная карбоксипропилцеллюлоза и т.д.); связывающими агентами (крахмалы, этанол, натриевый карбоксил метилцеллюлозы, карбоксил пропилцеллюлозы, метил-целлюлоза, карбоксил пропилметилцеллюлозы); любрикантами (т.е. стеарат магния). Один из предпочтительных составов это - соединение А 2 г; крахмал 40 г; лактоза 45 г; натриевый карбоксил крахмала 10 г; 8% крахмальной пасты и 1% стеарата магния в соответствующих количествах. Данные сухие материалы смешиваются, гранулируются, окрашиваются и просеиваются, а затем полученная масса прессуется в 1000 таблеток. Каждая таблетка содержит 2 мг соединения А.

Капсулы. Соединение А смешивается в нужных количествах (1-99%) с соответствующими вышеописанными носителями и любрикантами, после чего оно заполняется в капсулы. Один из таких составов это - соединение А 2 г, крахмал 200 г, смешаны и заполнены в 1000 капсул. Каждая капсула содержит 2 мг соединения А. Для производства мягких капсул соединение А может быть смешано с различными растворителями.

Таблетки или капсулы с контролируемым или продленным высвобождением. В соответствии с вышеописанными методами приготовления таблеток и капсул продленная доставка дозы соединения А может быть достигнута при помощи добавления к таблеткам и капсулам фармацевтических реципиентов (макрополимеров) в качестве матрицы, или путем покрытия таблеток ингибиторами доставки или полупроницаемыми мембранами, формируя таким образом осмотический насос, путем использования микрокапсул, сделанных из полупроницаемых мембран, или путем формирования липосом. Эти препараты могут быть доставлены орально для продления высвобождения и времени активности соединения А.

Парентеральные жидкие препараты. Парентеральный жидкий препарат содержит соединение А (порцию 1-99%) в стерильном водном и фармацевтически приемлемом основании. Раствор приведен к соответствующему рН, стабилизирован, профильтрован, стерилизован и разлит по бутылкам для парентерального введения. Один из таких препаратов содержит: 2 г соединения А, 2 г NaHCO₃, растворенных в 1000 мл стерильной воды. Раствор приведен к соответствующему рН, профильтрован, стерилизован и разлит по 2 или 5 мл бутылкам, таким образом каждая бутылка содержит 4 мг или 10 мг соединения А соответственно. Жидкие формы соединения А используются для парентеральных инъекций или инфузий.

Другие фармацевтические препараты. Соединение А может быть приготовлено в виде других фармацевтических препаратов например свечей, мазей, трансдермальных аппликаторов и т.д.

Вышеописанные примеры являются предпочтительными способами внедрения данного изобретения, они никак не ограничивают данное изобретение. Очевидно, что все модификации или изменения этих примеров могут быть сделаны любым специалистом в соответствии с тем, как было описано в данном изобретении. Такие модификации и изменения должны бать включены в область данного изобретения.

Промышленная применимость

Изобретение относится к применению каурановых соединений в производстве фармацевтических препаратов для лечения и профилактики коронарных заболеваний, аритмии и т.д., как было показано в экспериментах на животных, изобретение также относится к применению данных соединений в производстве фармацевтических препаратов для защиты и сохранения функции головного мозга во время церебральной ишемии или инсульта.

Изобретение относится к медицине, а именно описывает фармацевтическое применение каурановых соединений. Для лечения ишемической болезни тканей и органов применяют каурановые соединения в производстве фармацевтических препаратов для назначения нуждающимся пациентам, при этом каурановыми соединениями являются соединение А, представленное в Формуле 2, и соединение Б, представленное в формуле 3

Соединения, представленные в изобретении, более эффективны и безопасны по сравнению со способами и медикаментами, используемыми при лечении тканевой ишемии и ишемии органов в настоящее время. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Способ лечения ишемической болезни тканей и органов, включающий применение каурановых соединений в производстве фармацевтических препаратов для назначения нуждающимся пациентам, при этом каурановыми соединениями являются соединение А, представленное в формуле 2 и соединение Б, представленное в формуле 3