СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280 Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способам получения штаммов - продуцентов изомальтулозосинтазы. Фермент может найти применение в пищевой промышленности в производстве продуктов диетического и диабетического назначения и в медицине.

Техническая задача изобретения - разработка способа культивирования бактерий Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280, обладающих изомальтулозосинтазной активностью.

Способ культивирования бактерий Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280, предусматривает приготовление питательной среды, содержащей в своем составе (г/л): дрожжевой экстракт - 20; MgSO₄·7H₂O - 0,1; NaCl - 0,01; CaCl₂ - 0,02; KH₃PO₄ - 20; MnSO₄ - 0,01; FeSO₄ - 0,01; сахарозу - 175, воду - остальное, засев ее бактериями Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280 в количестве 8% от объема питательной среды, культивирование бактерий без аэрации в течение 12 часов при температуре 27°С и рН 7,0.

Технический результат заключается в повышении изомальтулозосинтазной активности бактерий Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280, интенсификации процесса получения фермента, увеличении выхода биомассы бактериальных клеток.

Способ осуществляется следующим образом.

Готовят питательную среду следующего состава (г/л): дрожжевой экстракт - 20; MgSO₄·7H₂O - 0,1; NaCl - 0,01; CaCl₂ - 0,02; KH₂PO₄ - 20; MnSO₄ - 0,01; FeSO₄ - 0,01; сахароза - 175, вода - остальное, значение рН среды 7,0, засевают бактериями Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280 в количестве 8% от объема питательной среды, культивирование бактерий ведут без аэрации в течение 12 часов при температуре 27°С. Культивирование проводят в колбах емкостью 750 мл с объемом питательной среды 200 мл. Культуральную жидкость отделяют центрифугированием от клеток, отбирают 0,1 мл культуральной жидкости и используют для определения активности изомальтулозосинтазы, бактериальные клетки взвешивают для определения выхода биомассы.

С целью определения ферментативной активности используют следующий состав реакционной смеси: 0,2 мл 4% сахарозы, 0,1 мл культуральной жидкости. Реакция протекает при температуре 35°С, время реакции составляет 30 минут. Определение концентрации изомальтулозы, образовавшейся в процессе изомеризации сахарозы, осуществляют по методу Сомоджи-Нельсона с учетом коэффициента пересчета, полученного при построении калибровочного графика. Об активности изомальтулозосинтазы судят по изменению концентрации изомальтулозы, полученной в результате изомеризации сахарозы. Активность изомальтулозосинтазы рассчитывают по формуле

где С_им - концентрация изомальтулозы, мкг/мл;

Mr_им - молекулярная масса изомальтулозы,

τ - время гидролиза, мин;

n - разведение.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Культивирование бактерий Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280 на среде с содержанием сахарозы в среде 125 г/л.

Готовят питательную среду следующего состава (г/л): дрожжевой экстракт - 20; MgSO₄·7H₂O - 0,1; NaCl - 0,01; CaCl₂ - 0,02; KH₃PO₄ - 20; MnSO₄ - 0,01; FeSO₄ - 0,01; сахароза - 125, вода - остальное, значение рН среды 7,0, засевают бактериями Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280 в количестве 8% от объема питательной среды, культивирование бактерий ведут без аэрации в течение 12 часов при температуре 27°С. Культивирование проводят в колбах емкостью 750 мл с объемом питательной среды 200 мл. Культуральную жидкость отделяют центрифугированием от клеток, отбирают 0,1 мл культуральной жидкости и используют для определения активности изомальтулозосинтазы. Бактериальные клетки взвешивают для определения выхода биомассы. Данные анализа представлены в таблице.

Пример 2.

Продуцент выращивают на питательной среде, аналогичной примеру 1, но сахарозу добавляют в количестве 175 г/л. Культивирование бактерий проводят аналогично примеру 1. Данные анализа представлены в таблице.

Пример 3.

Продуцент выращивают на питательной среде, аналогичной примеру 1, но сахарозу добавляют в количестве 220 г/л. Культивирование бактерий проводят аналогично примеру 1. Данные анализа представлены в таблице.

ТаблицаПоказателиДанные по примерам123Концентрация сахарозы в среде, г/л125175220Активность изомальтулозосинтазы, % от максимальной величины58,710084,8Выход биомассы клеток, мг/мл0,00750,0150,012

Как видно из таблицы, способ культивирования бактерий Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280 на питательной среде следующего состава (г/л): дрожжевой экстракт - 20; MgSO₄·7H₂O - 0,1; NaCl - 0,01; CaCl₂ - 0,02; KH₂PO₄ - 20; MnSO₄ - 0,01; FeSO₄ - 0,01, вода - остальное с содержанием сахарозы 125-220, количеством посевного материала бактерий 8%, температурой культивирования 27°С в течение 12 часов наиболее эффективен для максимального биосинтеза изомальтулозосинтазы.

Предложенный способ культивирования бактерий Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280 позволяет:

- повысить активность изомальтулозосинтазы Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280;

- интенсифицировать процесс получения фермента;

- повысить выход биомассы бактериальных клеток.

Аналоги не обнаружены.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано в пищевой промышленности в производстве продуктов диетического и диабетического назначения и в медицине. Способ предусматривает приготовление питательной среды, содержащей в своем составе (г/л): дрожжевой экстракт - 20; MgSO₄·7H₂O - 0,1; NaCl - 0,01; CaCl₂ - 0,02; KH₃PO₄ - 20; MnSO₄ - 0,01; FeSO₄ - 0,01; сахарозу - 175. Затем приготовленную питательную среду засевают бактериями Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280 в количестве 8% от объема питательной среды, и культивируют без аэрации в течение 12 часов при температуре 27°С и рН среды 7,0. Изобретение позволяет увеличить выход биомассы бактериальных клеток. 1 табл.

Способ культивирования бактерий Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280, предусматривающий приготовление питательной среды, содержащей в своем составе, г/л: дрожжевой экстракт - 20; MgSO₄·7H₂O - 0,1; NaCl - 0,01; CaCl₂ - 0,02; KH₃PO₄ - 20; MnSO₄ - 0,01; FeSO₄ - 0,01; сахарозу - 175, засев ее бактериями Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-9280 в количестве 8% от объема питательной среды и культивирование без аэрации в течение 12 ч при температуре 27°С и рН среды 7,0.