Штамм дрожжей Ogataea parapolymorpha ВКПМ Y-5081 - продуцент белковой биомассы Российский патент 2023 года по МПК C12N1/16 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения белковой биомассы, которая используется как источник белка в белково-витаминных комплексах, предназначенных для балансирования кормов для аквакультуры, сельскохозяйственных и домашних животных.

Различные виды микроорганизмов используются в качестве продуцентов полноценного белка и витаминов.

В настоящее время разрабатываются методы получения высокобелковых кормов путем их промышленного биосинтеза с помощью низших автотрофных организмов - дрожжей и бактерий. Микроорганизмы превращают простые, сложные и синтетические вещества (целлюлозу, простые сахара, соли аммония, спирт, уксусную кислоту, ацетальдегит, углерод, парафин, нефть, природные газы и т.д.) в ценные кормовые белки. Дрожжи выращивают на различном сырье - соломе, стержнях кукурузных початков, подсолнечной лузге, хлопковой шелухе, сульфитном щелке, гидролизатах древесины, отходах крахмальных заводов, камыше, древесных отходах и т.д.

Известен штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-3585, обладающий амилазной активностью, который депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) и может быть использован при производстве кормового белка [патент РФ RU 2478701, МПК: C12N1/16; опубл. 10.04.2013 г.]. Способ микробиологического производства кормовых дрожжей ведется на отходах зернового сырья.

Известен штамм дрожжей Hansenula sp. ВСБ-943 - продуцент кормовой биомассы, характеризующийся высокой продуктивностью при культивировании на мелассе и гидролизате [заявка RU 93039024 A, МПК: C12N1/16; опубл. 10.01.1997 г.]. Способ микробиологического производства кормовых дрожжей ведется на отходах зернового сырья.

Известен штамм дрожжей Endomycopsis fibuligera ВСБ-12 - продуцент белковой биомассы, деструктор сельхозотходов, характеризующийся высокой производительностью при культивировании на углеводном и углеводородном субстрате [патент РФ RU2092549, МПК: C12N1/16, А63К 1/00, С12Р 21/00, С12R 1/645; опубл. 10.10.1997 г.].

Известны штаммы дрожжей рода Candida, используемые в качестве культур-продуцентов для производства кормовой биомассы. Штамм дрожжей Candida scottii ВКПМ У-546 продуцент кормового белка [авторское свидетельство SU1378373, МПК: C12N1/22, С12R 1/72; опубл. 10.10.1995 г.]. Штамм дрожжей Candida tropicalis ВКПМ V-1987 - продуцент биомассы, обогащенной белком [патент РФ RU2031115, МПК: C12N1/16, С12R 1/74; опубл. 20.03.1995 г.]. Штамм дрожжей Metschnikowia pulcherrima ВКПМ - Y-3147 - продуцент кормового белка [патент РФ RU2370529, МПК: C12N1/16, опубл. 20.10.2009 г.]. Штамм дрожжей Metschnikowia pulcherrima ВКПМ - Y-3152 - продуцент кормового белка [патент РФ RU2370530, МПК: C12N1/16, опубл. 20.10.2009 г.]. Штамм дрожжей Candida ethanolica BKM У-2752 продуцент биомассы [патент РФ RU2061751, МПК: C12N1/16, С12R 1/72, опубл. 10.06.1996 г.].

Штамм дрожжей Candida utilis ВКМП У-263-продуцент белковой биомассы. При культивировании на этаноле накопление биомассы на уровне 10,2-13,2 г/л, выход биомассы от заданного эталона 71,8-77 % при содержании протеина 58,1-63,9 % [патент РФ RU1817471, МПК: C12N1/16, опубл. 12.12.1990 г.].

Недостаток перечисленных штаммов заключается в том, что по систематическому положению они относятся к несовершенным дрожжеподобным условно патогенным микроорганизмам, что снижает их потребительскую ценность.

Известен штамм дрожжей Metschnikowia pulcherrima ВКПМ - Y-3146 - продуцент кормового белка. Штамм выращивается на питательной среде из зеленой массы горца сахалинского [патент РФ RU2370531, МПК: C12N1/16, опубл. 20.10.2009 г.].

Известен штамм дрожжей Hansenula sp. ВКПМ У-2133 продуцент кормовой биомассы, характеризующийся высокой продуктивностью при культивировании на мелассе и гидролизате древесины [патент РФ RU2077573, МПК: C12N1/16, С12R 1/78, опубл. 27.07.1993 г.].

Недостатком всех вышеперечисленных штаммов является ограничение применяемых питательных сред для получения белковой биомассы. Ни один их указанных штаммов не использует в качестве источников углеводородов метанол.

Метанол является опасным органическим отходом, его утилизация без ущерба для окружающей среды является одной из проблем промышленности. Техническая проблема, решение которой обеспечивается при осуществлении изобретения, состоит в создании нового высокопродуктивного штамма метанолокисляющих дрожжей для производства кормовой биомассы.

Технический результат заключается в расширении арсенала средств для производства микробной белковой массы, создании нового высокопродуктивного штамма метанолокисляющих дрожжей для получения микробной белковой массы с утилизацией в процессе культивирования метанола. Технический результат заключается также в повышении устойчивости штамма к изменению условий культивирования без снижения продуктивности при изменении температурного режима от 37°С до 42°С и значений рН от 3,0 до 5,8.

Для достижения указанного технического результата предложено использование штамма метилотрофных дрожжей Ogataea parapolymorpha BF20-17Y, депонированного в Биоресурсном Центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ Y-5081, в качестве продуцента белковой биомассы.

Штамм Ogataea parapolymorpha BF20-17Y был выделен из дерново-подзолистой почвы (Московская область, Россия). Образец дерново-подзолистой почвы был использован для получения накопительной культуры метанолокисляющих дрожжей. После инкубирования в жидкой минеральной среде с метанолом в качестве единственного источника углерода культуру пересевали, используя метод серийных разведений. После нескольких пассажей культуру высевали на агаризованную минеральную среду для получения изолированных колоний чистой культуры метилотрофных дрожжей. Полученный таким образом штамм Ogataea parapolymorpha BF20-17Y был селекционирован в процессе длительного (более полугода) пассирования на жидких и агаризованных средах с метанолом.

Штамм бактерии Ogataea parapolymorpha ВКПМ Y-5081 идентифицирован по культурально-морфологическим, физиолого-биохимическим свойствам и генетическим характеристикам и имеет следующие признаки.

Систематическое положение подтверждено результатами анализа ITS региона гена рРНК, а также расшифровкой генома. Работы проводились компанией SciBear OU (Tartu mnt 67/1-13b, Kesklinna linnaosa, Tallinn, 10115 Harju maakond, Reg. No. 16221849). Полученные последовательности были депонированы в NCBI под номером OM992321.

Генетические особенности штамма:

а) мутации, делеции, инверсии нет;

б) фагоустойчив;

в) плазмиды не обнаружены;

г) профаги не обнаружены.

Сведения о безопасности использования штамма:

а) штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов; перенесенных генов резистентности; генетических изменений, связанных с использованием генно-технических методик;

б) штамм не является зоопатогенным и фитопатогенным; не представляет опасность по каким-либо другим причинам.

Форма и размер клеток в односуточной культуре на синтетической среде с метанолом: дрожжевые клетки овальной формы, отдельные, характерно множественное почкование. Размер клеток 1,5-4,6×1,9-5,3 мкм. На синтетической агаризованной среде с метанолом образует круглые с ровным краем, блестящие, кремового цвета колонии, которые формируются на 5-7 сутки, достигая 1-2 мм. На Сабуро агаре образуют кремовые, блестящие, круглые, с ровным краем колонии, достигая 1-5 мм

Кроме метанола ассимилируют

1) спирты: этанол, маннит;

2) сахара: глюкозу, сахарозу, мальтоза, инулин, ксилозу;

Не усваивает азотнокислый калий, усваивает сернокислый аммоний.

Дрожжи также нуждаются в фосфоре и сере.

Металлы: магний, железо, кальций и цинк, также необходимы для хорошего роста дрожжей

Нуждается для роста в автолизате или витаминах: биотин и тиамин.

В качестве источника азота использует соли аммония, хуже нитраты.

Культура факультативно анаэробна.

Способна расти при температуре 37-42°С (оптимум 38°С) и рН 3,0-5,8 (оптимум 4,0-5,5).

Активность (продуктивность) штамма составляет до 6,0 кг×м³/час. Способ определения активности штамма с указанием метода: на жидкой минеральной среде с метанолом (1 % об.) и значениях рН (4,0) при температуре 40°С с добавлением дрожжевого автолизата в количестве 0,3 %.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма: в лиофилизированном состоянии; криоконсервация при -80°С в качестве криопротектора применяется 30%-ный раствор глицерина.

Для заявляемого штамма характерны:

- устойчивый продуктивный рост на средах различного состава, в широких пределах рН и температуры;

- способность длительно сохранять активность в лиофилизированном состоянии;

- отсутствие вирулентности, токсигенности, токсичности и безвредность.

Выращивание осуществляют преимущественно непрерывным способом.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма:

Вариант 1

Состав минеральной среды для выращивания культуры на колбах (г/л): (NH4)₂SO₄ - 3,3; MgSO₄×7H₂O - 0,7; NaCl - 0,5; K₂HPO₄ -1,0; KH₂PO₄ - 0,13; дрожжевой автолизат - 3,0. Микроэлементы (мг/л): MnSO₄×5H₂O - 0,2; FeSO₄×7H₂O - 1; H₃BO₃ - 0,2; Na₂MoO₄×2H₂O - 0,2; KI - 0,2. Метанол 10 мл/л, рН 5 (доводится 70%-ным раствором Н₃PO₄), температура культивирования 38-40°С.

Вариант 2

Оптимальные условия и состав среды для ферментации (10 г/л метанола):

H₃PO₄ (70%) 15,86 мл K₂SO₄ 9,53 г MgSO₄×7H₂O 7,8 г CaCl₂×2H₂O 0,6 г КОН (85%) 2,6 г Биотин 20 мкг Тиамин 200 мкг FeSO₄×7H₂O 650 мг CuSO₄×5 H₂O 60 мг MnSO₄×2 H₂O 30 мг ZnSO₄×7 H₂O 200 мг.

Пример 1

Культивирование штамма Ogataea parapolymorpha BF20-17Y проводят в периодическом режиме в колбах из термостойкого стекла, объемом 0,7 л при коэффициенте заполнения 0,1-0,2 в термостатируемом шейкере-инкубаторе при 38°С. Культивирование осуществляют в течение 24 ч. По окончании культивирования концентрация сухих веществ 1,2 г/л. Полученную культуру используют в качестве посевного материала для последующего выращивания дрожжей в автоматизированном ферментационном комплексе объемом 30 л (рабочий объем 20 л).

Пример 2

Осуществляли выращивание культуры Ogataea parapolymorpha BF20-17Y в непрерывном режиме в ферментере с магнитной мешалкой объемом 5 л (рабочий объем - 3,5 л) с постоянной подачей минеральной среды, содержащей следующие компоненты (10 г/л метанола):

H₃PO₄ (70%) 15,86 мл K₂SO₄ 9,53 г MgSO₄×7H₂O 7,8 г CaCl₂×2H₂O 0,6 г КОН (85 %) 2,6 г Биотин 20 мкг Тиамин 200 мкг FeSO₄×7H₂O 650 мг CuSO₄×5H₂O 60 мг MnSO₄×2H₂O 30 мг ZnSO₄×7H₂O 200 мг.

Процесс выращивания осуществляли в нестерильных условиях, при варьировании условий культивирования: изменение температурного режима от 38°С до 42°С и рН от 4,0 до 5,5. Скорость подачи метанола составляла 100 мл/ч. При коэффициенте скорости протока 0,25 ч^-1. Значение рН регулировали 1,5% раствором аммиачной воды или раствором 70% ортофосфорной кислоты. Регулирование температуры процесса осуществляли подачей охлаждающей воды в теплообменник аппарата. Расход воздуха на 1 л культуральной среды составляли 60 л/час.

В результате применения такого режима культивирования в течение длительного времени, с использованием воды из разных источников, продуктивность культуры оставалась стабильной, концентрация биомассы в ферментере составляла 13-16 г/л с содержанием сырого протеина в биомассе 42-45 %.

Пример 3

Осуществляли выращивание культуры Ogataea parapolymorpha BF20-17Y в непрерывном режиме в ферментере с магнитной мешалкой объемом 30 л (рабочий объем - 20 л) с непрерывной подачей растворов минеральных солей (как в предыдущем примере). Процесс выращивания осуществляли при температуре 38°С и рН среды 4,0. Значение рН поддерживали 10%-ным раствором аммиачной воды. В ферментер подавали воздух в количестве 360 л/ч. Коэффициент скорости протока составлял 0,25 ч^-1. Культуральную жидкость на выходе из ферментера отделяли от клеток в нестерильном режиме и возвращали в ферментационный процесс вместо воды. Доля сопутствующей микрофлоры при таком способе культивирования была неизменной и не превышала 20 % от общего количества клеток. Концентрация биомассы на выходе из ферментера составляла 15-19 г/л. Содержание сырого протеина в биомассе - 42-46 %. Полученные данные свидетельствуют о том, что культивирование штамма Ogataea parapolymorpha BF20-17Y в минеральной среде указанного состава при непрерывном протоке и в широком диапазоне условий культивирования (температура, рН) позволяет получать стабильный выход биомассы, сопоставимый с прототипом.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к штамму метилотрофных дрожжей Ogataea parapolymorpha BF20-17Y, депонированному в Биоресурсном Центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ Y-5081, в качестве продуцента белковой биомассы. Изобретение позволяет расширить арсенал средств для производства микробной белковой массы. Создан новый высокопродуктивный штамм метанолокисляющих дрожжей для получения микробной белковой массы с утилизацией в процессе культивирования метанола. Активность (продуктивность) штамма составляет до 6,0 кг×м³/час. 3 пр.

Штамм метилотрофных дрожжей Ogataea parapolymorpha ВКПМ Y-5081 – продуцент белковой биомассы.