ШТАММ MUCOR CIRCINELLOIDES VAR. LUSITANICUS - ПРОДУЦЕНТ ВИТАМИНА F И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИТАМИНА F Российский патент 1998 года по МПК C12P7/64 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/785 

Описание патента на изобретение RU2115732C1

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству физиологически активных веществ микроорганизмами, и может быть использовано в медицине, косметологии, диетпитании.

Витамин F - это эссенциальные полиненасыщенные жирные кислоты: линолевая, линоленовая, арахидоновая, которые являются предшественниками в синтезе простагландинов. Витамин F необходим для нормального роста и развития организма. Он способствует нормализации липидного обмена в организме, предупреждает развитие атеросклероза, обладает гепатопротекторным, ранозаживляющим, противоожоговым, противоаллергическим действием [1 - 3].

Источником витамина F являются растительные масла, содержащие линолевую и альфа-линоленовую кислоты, такие как кукурузное, подсолнечное, соевое, облепиховое, хлопковое [4].

Однако эти масла малоэффективны по сравнению с маслами, содержащими гамма-изомер линоленовой кислоты, являющейся непосредственным предшественником в синтезе арахидоновой кислоты в организме людей и животных [5 и 6].


Известен штамм гриба Mucor lusitanicus как продуцент липидов, содержащих гамма-линоленовую кислоту, путем выращивания его в течение 72 ч при 28oC, pH 4,5 - 6,5, при аэрации 1,8 O2 /л/ч на среде следующего состава, г/л: глюкоза 30; мочевина 1; K2HPO4 1; NaCl 0,5; MgSO4 7H2O 0,5; FeSO4 7H2O 0,01; ZnSO4 7H2O 0,001; CaCl2 0,02; дрожжевой экстракт 0,5; витамин B6 0,002; биотин 0,02 мг. Получают 26 г липидов на 100 г сухой биомассы, содержащих 29% гамма-линоленовой кислоты в сумме жирных кислот [7].

Однако известный штамм требует длительного ферментационного процесса и не обеспечивает достаточно высокого выхода целевого продукта.

Известен способ получения липидов, содержащих гамма-линоленовую кислоту с использованием гриба Mucor circinelloides [8]. Культуру гриба выращивают в течение 96 ч на среде, содержащей, г/л: глюкоза 250; сульфат аммония 19,8; K2HPO4 9,0; MgSO4 7H2O 1,0; дрожжевой экстракт 0,6; FeSO4 7H2O 40 мг/л; CaCl2 2H2O 4,8 мг/л; CuSO4 5H2O 0,8 мг/л; ZnSO4 7H2O 4,0 мг/л; MnCl 4H2O 4,0 мг/л. На 100 г биомассы получают 25 г липидов, содержащих 34% гамма-линоленовой кислоты сумме жирных кислот.

Однако известный способ предусматривает использование многокомпонентной питательной среды и длительный процесс ферментации.

Цель изобретения - усовершенствование существующих микробиологических способов получения витамина F путем использования штамма M. circinelloides var. lusitanicus F-723 и экстракта солянки холмовой.

Технический результат, получаемый от использования нового штамма и предлагаемого способа, выражается в ускорении биосинтеза и повышении производительности процесса получения витамина F.

Используемый в изобретении штамм получен из штамма Mucor circinelloides var. lusitanicus 1233 путем его облучения УФ с последующим отбором вариантов по способности к росту при пониженной температуре, депонирован в ВКПМ под номером Mucor circinelloides var. lusitanicus F-723 и характеризуется следующими признаками, типичными для грибов семейства Mucoraceae.

Культурально-морфологические признаки.

На сусло-агаре образует колонии белого цвета с хорошо развитым мицелием, гифы без поперечных перегородок. Спорообразование хорошее.

На среде Чапека колонии белого цвета, мицелий развит слабее, чем на сусло-агаре. Спорообразование хорошее.

На мясопептонном агаре колонии мелкие, белого цвета. Мицелий развит слабо.

На картофельном агаре рост мицелия слабее, чем на сусло-агаре.

В погруженной культуре рост дисперсный или нитчатый.

Физиолого-биохимические признаки.

В качестве источника углерода использует глюкозу, ксилозу, рибозу, мальтозу, сахарозу. Плохо растет на лактозе, не растет на этаноле.

В качестве источника азота использует соли аммония, мочевину, органические источники азота.

Строгий аэроб. Маркерным признаком является рост при 5 - 30oC, оптимальный диапазон 18 - 26oC. Область pH роста 4 - 8; оптимальный диапазон 5,5 - 6,8.

Культура продуцирует витамин F, содержащий гамма-линоленовую кислоту 32 - 35% от суммы жирных кислот.

Штамм хранят при 5 - 10oC на сусло-агаре. Для сохранения культуры в активном состоянии ее пересевают через 25 - 30 дней.

Предлагаемый способ получения витамина F заключается в том, что гриб Mucor circinelloides var. lusitanicus F-723 выращивают на среде следующего состава, г/л: глюкоза 50 - 100; мочевина 1,5 - 3; (NH4)2SO4 1,0 ± 0,1; K2HPO4 0,5 - 1,0; NaCl 0,5 - 1,0; MgSO4 7H2O 0,5 - 1,0; дрожжевой автолизат 2 - 3; экстракт солянки холмовой 1,0 ± 0,1; при 20 - 28oC, интенсивности аэрации 1,6 - 1,8 O2 /л/ч. Экстракт солянки холмовой (Solsola collina) добавляют дробно: при посеве 50%, через 24 ч - остальные 50%. Выращивание проводят в течение 48 - 60 ч. Мицелий отделяют от культуральной жидкости фильтрованием, лиофилизируют. Липиды экстрагируют из лиофилизированной биомассы смесью метанол : хлороформ (2 : 1). Жирнокислотный состав липидов определяют методом газо-жидкостной хроматографии метиловых эфиров жирных кислот, которые получают кислотным метанолизом [9]. В результате получают липиды, содержащие 30 - 35% гамма-линоленовой кислоты в сумме жирных кислот.

Пример 1. В качестве инокулята используют суспензию спор штамма с титром 10. Культуру выращивают в течение 60 ч в колбах объемом 2 л с содержанием среды 300 мл, при 26oC на качалке (200 об./мин). Состав среды, г/л воды:
Глюкоза - 70
Мочевина - 2,0
K2HPO4 - 1
NaCl - 0,5
MgSO4 7H2O - 0,5
FeSO4 7H2O - 0,01
CaCl2 - 0,02
ZnSO4 7H2O - 0,001
Дрожжевой автолизат - 2
Витамин B6, мг - 2
Биотин, мг - 0,2
Мицелий отделяют от культуральной жидкости фильтрованием, лиофилизируют. Липиды экстрагируют из лиофилизированной биомассы смесью метанол : хлороформ (2 : 1). Жирнокислотный состав липидов определяют методом газо-жидкостной хроматографии метиловых эфиров жирных кислот, которые получают кислотным метанолизом. Выход витамина F на 100 г биомассы 27,0 г, при этом содержание гамма-линоленовой кислоты 30% в сумме жирных кислот, линолевой 17%.

Пример 2. В качестве инокулята используют 10% односуточного мицелия. Культуру выращивают в 10-литровом ферментере при 26oC, аэрации 1,8 O2 /л/ч, pH среды 6,8 на среде оптимального состава, г/л воды:
Глюкоза - 100
Мочевина - 2
(NH4)2SO4 - 1
K2HPO4 - 1
NaCl - 1
MgSO4 7H2O - 1
Дрожжевой автолизат - 3
Экстракт солянки холмовой - 1
Выращивание проводили 48 ч. Обработку биомассы и выделение витамина F проводили как в примере 1. Выход витамина F на 100 г биомассы составил 27,5 г, при этом содержание гамма-линоленовой кислоты в сумме жирных кислот составляет 32%, линолевой 17,5%.

Пример 3. В качестве инокулята используют 10% односуточного мицелия. Культуру выращивают 48 ч в 10-литровом ферментере при 26oC, аэрации 1,8 O2 /л/ч, pH среды 6,8 на среде оптимального состава, г/л воды:
Глюкоза - 100
Мочевина - 2
(NH4)2SO4 - 1
K2HPO4 - 1
NaCl - 1
MgSO4 7H2O - 1
Дрожжевой автолизат - 3
Экстракт солянки холмовой - 1
Экстракт солянки холмовой добавляют дробно: при посеве 50%, через 24 ч - оставшиеся 50%. Обработку биомассы и выделение витамина F проводили, как в примере 1. Выход витамина F на 100 г биомассы составил 29 г, при этом содержание гамма-линоленовой кислоты в сумме жирных кислот составляет 35%, линолевой 18%.

При проведении исследований полученного витамина F показана его высокая ранозаживляющая и антиаллергическая активность. Результаты исследований представлены в табл. 1, 2 и 3.

В табл. 1 показано, что витамин F более эффективен для заживления ожогов и ран, чем облепиховое масло или мазь метилурациловая 10%, 0,5 г.

Как видно из результатов, представленных в табл. 2 и 3, полученный витамин F высокоэффективен при лечении экспериментально полученного дерматоза морских свинок, а также при лечении атопического дерматита у детей.

Литература
1. Колотилова А.И., Глушанков Е.П. Витамины - химия, биохимия и физиологическая роль. - Л.: ЛГУ 1976.

2. Левачев М.М. Роль липидов в обеспечении процессов жизнедеятельности организма. - Вопросы питания, М., 1980, N 2.

3. Патент Японии JP 60-273100, кл. C 12 P 7/64.

4. Бремнер С.М. Витамины. - М.: Медицина, 1984.

5. Ratledge C. Lipid Biothechnology: A Wonderland for the Microbial Physiologist. 1987, J. Amer. Oil. Chem. Soc., v. 64, 2, 1647 - 1656.

6. Алимова Е.К., Аствацатурьян А.Т., Жаров Л.В. Липиды и жирные кислоты в норме и при ряде патологических состояний. - М.: Медицина, 1975.

7. Патент Российской Федерации N 1585331, кл. C 12 P 7/64, 1993.

8. Патент Японии JP 63-283589, кл. C 12 P 7/64, 1989.

9. Кейтс М. Техника липидологии. - М.: Мир, 1975.

Похожие патенты RU2115732C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ЛИПИДОВ 1991
  • Фунтикова Н.С.
  • Торланова Б.О.
  • Конова И.В.
  • Бабанова Н.К.
RU2022019C1
Штамм гриба MUcoR LUSIтаNIсUS - продуцент липидов с повышенным содержанием @ -линоленовой кислоты 1988
  • Фунтикова Надежда Степановна
  • Катомина Анна Александровна
  • Марченко Инна Васильевна
SU1585331A1
ШТАММ МИКРОМИЦЕТА CERSOSPORA SP.- ПРОДУЦЕНТ ФИТОГОРМОНА АБСЦИЗОВОЙ КИСЛОТЫ 1992
  • Муромцев Г.С.
  • Краснопольская Л.М.
  • Макеева А.П.
  • Нагубнова Л.А.
RU2085078C1
Способ получения липидов, содержащих @ -линоленовую кислоту 1990
  • Фунтикова Надежда Степановна
  • Катомина Анна Александровна
  • Мысякина Ирина Сергеевна
SU1751212A1
ШТАММ БАКТЕРИЙ STREPTOCOCCUS FAECIUM, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ БОРЬБЫ С ДИСБАКТЕРИОЗАМИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ 1993
  • Исакова Д.М.
  • Букачева И.Б.
RU2152433C1
БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЭТАНОЛА ИЗ ПЕНТОЗ 2008
  • Ефременко Елена Николаевна
  • Сенько Ольга Витальевна
  • Степанов Николай Алексеевич
  • Варфоломеев Сергей Дмитриевич
RU2391402C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКТА ТРАВЫ СОЛЯНКИ ХОЛМОВОЙ 1997
  • Луняк Н.К.
  • Луняк Ю.С.
  • Тихонова И.В.
  • Малышев Р.М.
  • Бомштеин В.Е.
  • Золотников А.Н.
RU2118167C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АБСЦИЗОВОЙ КИСЛОТЫ 1992
  • Муромцев Г.С.
  • Краснопольская Л.М.
  • Макеева А.П.
RU2085077C1
ШТАММ ГРИБА MORTIERELLA ALPINA PEYRONEL БС-2 ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫХ ВЫСШИХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ 1998
  • Суханов В.А.(Ru)
  • Ариповский А.В.(Ru)
  • Желифонова В.П.(Ru)
  • Кульнев А.И.(Ru)
  • Петров Петр Тимофеевич
  • Скрипко Анна Дмитриевна
  • Гриневич Людмила Николаевна
  • Царенков Валерий Минович
RU2140980C1
ШТАММ STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS 7 - ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА ГИГРОЛИТИНА 1998
  • Полатовская О.Г.
  • Пронина М.И.
  • Малков М.А.
  • Фадеева И.П.
RU2152432C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 115 732 C1

Реферат патента 1998 года ШТАММ MUCOR CIRCINELLOIDES VAR. LUSITANICUS - ПРОДУЦЕНТ ВИТАМИНА F И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИТАМИНА F

Штамм Mucor circinelloides var. lusitanicus ВКПМ F723 выращивают в питательной среде, содержащей источник углерода, азота, минеральные соли и добавку-экстракт солянки холмовой в качестве стимулятора роста и биосинтеза. За 48 ч получают 29 г витамина F на 100 г биомассы. Технический результат - усовершенствование существующих микробиологических способов получения витамина F путем использования штамма Mucor circinelloides var. lusitanicus ВКПМ F723 и экстракта солянки холмовой. 2 с. и 2 з.п. ф-лы, 3 табл.

Формула изобретения RU 2 115 732 C1

1. Штамм Mucor circinelloides var. lusitanicus ВКПМ F-723 - продуцент витамина F. 2. Способ получения витамина F, включающий выращивание штамма - продуцента Mucor circinelloides var. lusitanicus ВКПМ F-723 в погруженной культуре, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, стимулятор роста и биосинтеза, в условиях аэрации и перемешивания с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм по п.1, а в качестве стимулятора роста и биосинтеза используют водный или спиртовый экстракт солянки холмовой 0,5 - 3 г/л. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что выращивание осуществляют на питательной среде, содержащей, г/л воды:
Глюкоза - 50 - 100
Мочевина - 1,5 - 3,0
(NaH4)2SO4 - 1 ± 0,1
K2HPO4 - 0,5 - 1,0
NaCl - 0,5 - 1,0
MgSO47H2O - 0,5 - 1,0
Дрожжевой автолизат - 2 - 3
Экстракт солянки холмовой - 1 ± 0,1
4. Способ по п.2, отличающийся тем, что экстракт солянки холмовой добавляют дробно при посеве 50%, через 24 ч - остальные 50%.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1998 года RU2115732C1

Колотилова А.И., Глушанков Е.П
Витамины - химия, биохимия, и физиологическая роль
- Л.: ЛГУ, 1976
Левачев М.М
Роль липидов в обеспечении процессов жизнедеятельности организма
- Вопросы питания, 1980, N 2
JP, патент, 60-273100, C 12 P 7/64, 1985
Бремнер С.М
Витамины
- М.: Медицина, 1984
Алимова Е.К., Аствацатурьян А.Т., Жаров Л.В
Липиды и жирные кислоты в норме и при ряде патологических состояний
- М.: Медицина, 1975
SU, авторское свидетельство, 1585331, C 12 P 7/64, 1990
JP, патент, 63-283589, C 12 P 7/64, 1989
Кейтс М
Техника липидологии
- М.: Мир, 1975.

RU 2 115 732 C1

Авторы

Луняк Н.К.

Луняк Ю.С.

Фунтикова Н.С.

Даты

1998-07-20Публикация

1997-02-18Подача