ШТАММ MUCOR CIRCINELLOIDES VAR. LUSITANICUS - ПРОДУЦЕНТ ВИТАМИНА F И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИТАМИНА F Российский патент 1998 года по МПК C12P7/64 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/785 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству физиологически активных веществ микроорганизмами, и может быть использовано в медицине, косметологии, диетпитании.

Витамин F - это эссенциальные полиненасыщенные жирные кислоты: линолевая, линоленовая, арахидоновая, которые являются предшественниками в синтезе простагландинов. Витамин F необходим для нормального роста и развития организма. Он способствует нормализации липидного обмена в организме, предупреждает развитие атеросклероза, обладает гепатопротекторным, ранозаживляющим, противоожоговым, противоаллергическим действием [1 - 3].

Источником витамина F являются растительные масла, содержащие линолевую и альфа-линоленовую кислоты, такие как кукурузное, подсолнечное, соевое, облепиховое, хлопковое [4].

Однако эти масла малоэффективны по сравнению с маслами, содержащими гамма-изомер линоленовой кислоты, являющейся непосредственным предшественником в синтезе арахидоновой кислоты в организме людей и животных [5 и 6].

Известен штамм гриба Mucor lusitanicus как продуцент липидов, содержащих гамма-линоленовую кислоту, путем выращивания его в течение 72 ч при 28^oC, pH 4,5 - 6,5, при аэрации 1,8 O₂ /л/ч на среде следующего состава, г/л: глюкоза 30; мочевина 1; K₂HPO₄ 1; NaCl 0,5; MgSO₄ 7H₂O 0,5; FeSO₄ 7H₂O 0,01; ZnSO₄ 7H₂O 0,001; CaCl₂ 0,02; дрожжевой экстракт 0,5; витамин B₆ 0,002; биотин 0,02 мг. Получают 26 г липидов на 100 г сухой биомассы, содержащих 29% гамма-линоленовой кислоты в сумме жирных кислот [7].

Однако известный штамм требует длительного ферментационного процесса и не обеспечивает достаточно высокого выхода целевого продукта.

Известен способ получения липидов, содержащих гамма-линоленовую кислоту с использованием гриба Mucor circinelloides [8]. Культуру гриба выращивают в течение 96 ч на среде, содержащей, г/л: глюкоза 250; сульфат аммония 19,8; K₂HPO₄ 9,0; MgSO₄ 7H₂O 1,0; дрожжевой экстракт 0,6; FeSO₄ 7H₂O 40 мг/л; CaCl₂ 2H₂O 4,8 мг/л; CuSO₄ 5H₂O 0,8 мг/л; ZnSO₄ 7H₂O 4,0 мг/л; MnCl 4H₂O 4,0 мг/л. На 100 г биомассы получают 25 г липидов, содержащих 34% гамма-линоленовой кислоты сумме жирных кислот.

Однако известный способ предусматривает использование многокомпонентной питательной среды и длительный процесс ферментации.

Цель изобретения - усовершенствование существующих микробиологических способов получения витамина F путем использования штамма M. circinelloides var. lusitanicus F-723 и экстракта солянки холмовой.

Технический результат, получаемый от использования нового штамма и предлагаемого способа, выражается в ускорении биосинтеза и повышении производительности процесса получения витамина F.

Используемый в изобретении штамм получен из штамма Mucor circinelloides var. lusitanicus 1233 путем его облучения УФ с последующим отбором вариантов по способности к росту при пониженной температуре, депонирован в ВКПМ под номером Mucor circinelloides var. lusitanicus F-723 и характеризуется следующими признаками, типичными для грибов семейства Mucoraceae.

Культурально-морфологические признаки.

На сусло-агаре образует колонии белого цвета с хорошо развитым мицелием, гифы без поперечных перегородок. Спорообразование хорошее.

На среде Чапека колонии белого цвета, мицелий развит слабее, чем на сусло-агаре. Спорообразование хорошее.

На мясопептонном агаре колонии мелкие, белого цвета. Мицелий развит слабо.

На картофельном агаре рост мицелия слабее, чем на сусло-агаре.

В погруженной культуре рост дисперсный или нитчатый.

Физиолого-биохимические признаки.

В качестве источника углерода использует глюкозу, ксилозу, рибозу, мальтозу, сахарозу. Плохо растет на лактозе, не растет на этаноле.

В качестве источника азота использует соли аммония, мочевину, органические источники азота.

Строгий аэроб. Маркерным признаком является рост при 5 - 30^oC, оптимальный диапазон 18 - 26^oC. Область pH роста 4 - 8; оптимальный диапазон 5,5 - 6,8.

Культура продуцирует витамин F, содержащий гамма-линоленовую кислоту 32 - 35% от суммы жирных кислот.

Штамм хранят при 5 - 10^oC на сусло-агаре. Для сохранения культуры в активном состоянии ее пересевают через 25 - 30 дней.

Предлагаемый способ получения витамина F заключается в том, что гриб Mucor circinelloides var. lusitanicus F-723 выращивают на среде следующего состава, г/л: глюкоза 50 - 100; мочевина 1,5 - 3; (NH₄)₂SO₄ 1,0 ± 0,1; K₂HPO₄ 0,5 - 1,0; NaCl 0,5 - 1,0; MgSO₄ 7H₂O 0,5 - 1,0; дрожжевой автолизат 2 - 3; экстракт солянки холмовой 1,0 ± 0,1; при 20 - 28^oC, интенсивности аэрации 1,6 - 1,8 O₂ /л/ч. Экстракт солянки холмовой (Solsola collina) добавляют дробно: при посеве 50%, через 24 ч - остальные 50%. Выращивание проводят в течение 48 - 60 ч. Мицелий отделяют от культуральной жидкости фильтрованием, лиофилизируют. Липиды экстрагируют из лиофилизированной биомассы смесью метанол : хлороформ (2 : 1). Жирнокислотный состав липидов определяют методом газо-жидкостной хроматографии метиловых эфиров жирных кислот, которые получают кислотным метанолизом [9]. В результате получают липиды, содержащие 30 - 35% гамма-линоленовой кислоты в сумме жирных кислот.

Пример 1. В качестве инокулята используют суспензию спор штамма с титром 10. Культуру выращивают в течение 60 ч в колбах объемом 2 л с содержанием среды 300 мл, при 26^oC на качалке (200 об./мин). Состав среды, г/л воды:
Глюкоза - 70
Мочевина - 2,0
K₂HPO₄ - 1
NaCl - 0,5
MgSO₄ 7H₂O - 0,5
FeSO₄ 7H₂O - 0,01
CaCl₂ - 0,02
ZnSO₄ 7H₂O - 0,001
Дрожжевой автолизат - 2
Витамин B₆, мг - 2
Биотин, мг - 0,2
Мицелий отделяют от культуральной жидкости фильтрованием, лиофилизируют. Липиды экстрагируют из лиофилизированной биомассы смесью метанол : хлороформ (2 : 1). Жирнокислотный состав липидов определяют методом газо-жидкостной хроматографии метиловых эфиров жирных кислот, которые получают кислотным метанолизом. Выход витамина F на 100 г биомассы 27,0 г, при этом содержание гамма-линоленовой кислоты 30% в сумме жирных кислот, линолевой 17%.

Пример 2. В качестве инокулята используют 10% односуточного мицелия. Культуру выращивают в 10-литровом ферментере при 26^oC, аэрации 1,8 O₂ /л/ч, pH среды 6,8 на среде оптимального состава, г/л воды:
Глюкоза - 100
Мочевина - 2
(NH₄)₂SO₄ - 1
K₂HPO₄ - 1
NaCl - 1
MgSO₄ 7H₂O - 1
Дрожжевой автолизат - 3
Экстракт солянки холмовой - 1
Выращивание проводили 48 ч. Обработку биомассы и выделение витамина F проводили как в примере 1. Выход витамина F на 100 г биомассы составил 27,5 г, при этом содержание гамма-линоленовой кислоты в сумме жирных кислот составляет 32%, линолевой 17,5%.

Пример 3. В качестве инокулята используют 10% односуточного мицелия. Культуру выращивают 48 ч в 10-литровом ферментере при 26^oC, аэрации 1,8 O₂ /л/ч, pH среды 6,8 на среде оптимального состава, г/л воды:
Глюкоза - 100
Мочевина - 2
(NH₄)₂SO₄ - 1
K₂HPO₄ - 1
NaCl - 1
MgSO₄ 7H₂O - 1
Дрожжевой автолизат - 3
Экстракт солянки холмовой - 1
Экстракт солянки холмовой добавляют дробно: при посеве 50%, через 24 ч - оставшиеся 50%. Обработку биомассы и выделение витамина F проводили, как в примере 1. Выход витамина F на 100 г биомассы составил 29 г, при этом содержание гамма-линоленовой кислоты в сумме жирных кислот составляет 35%, линолевой 18%.

При проведении исследований полученного витамина F показана его высокая ранозаживляющая и антиаллергическая активность. Результаты исследований представлены в табл. 1, 2 и 3.

В табл. 1 показано, что витамин F более эффективен для заживления ожогов и ран, чем облепиховое масло или мазь метилурациловая 10%, 0,5 г.

Как видно из результатов, представленных в табл. 2 и 3, полученный витамин F высокоэффективен при лечении экспериментально полученного дерматоза морских свинок, а также при лечении атопического дерматита у детей.

Литература
1. Колотилова А.И., Глушанков Е.П. Витамины - химия, биохимия и физиологическая роль. - Л.: ЛГУ 1976.

2. Левачев М.М. Роль липидов в обеспечении процессов жизнедеятельности организма. - Вопросы питания, М., 1980, N 2.

3. Патент Японии JP 60-273100, кл. C 12 P 7/64.

4. Бремнер С.М. Витамины. - М.: Медицина, 1984.

5. Ratledge C. Lipid Biothechnology: A Wonderland for the Microbial Physiologist. 1987, J. Amer. Oil. Chem. Soc., v. 64, 2, 1647 - 1656.

6. Алимова Е.К., Аствацатурьян А.Т., Жаров Л.В. Липиды и жирные кислоты в норме и при ряде патологических состояний. - М.: Медицина, 1975.

7. Патент Российской Федерации N 1585331, кл. C 12 P 7/64, 1993.

8. Патент Японии JP 63-283589, кл. C 12 P 7/64, 1989.

9. Кейтс М. Техника липидологии. - М.: Мир, 1975.

Штамм Mucor circinelloides var. lusitanicus ВКПМ F723 выращивают в питательной среде, содержащей источник углерода, азота, минеральные соли и добавку-экстракт солянки холмовой в качестве стимулятора роста и биосинтеза. За 48 ч получают 29 г витамина F на 100 г биомассы. Технический результат - усовершенствование существующих микробиологических способов получения витамина F путем использования штамма Mucor circinelloides var. lusitanicus ВКПМ F723 и экстракта солянки холмовой. 2 с. и 2 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Штамм Mucor circinelloides var. lusitanicus ВКПМ F-723 - продуцент витамина F. 2. Способ получения витамина F, включающий выращивание штамма - продуцента Mucor circinelloides var. lusitanicus ВКПМ F-723 в погруженной культуре, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, стимулятор роста и биосинтеза, в условиях аэрации и перемешивания с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм по п.1, а в качестве стимулятора роста и биосинтеза используют водный или спиртовый экстракт солянки холмовой 0,5 - 3 г/л. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что выращивание осуществляют на питательной среде, содержащей, г/л воды:
Глюкоза - 50 - 100
Мочевина - 1,5 - 3,0
(NaH₄)₂SO₄ - 1 ± 0,1
K₂HPO₄ - 0,5 - 1,0
NaCl - 0,5 - 1,0
MgSO₄7H₂O - 0,5 - 1,0
Дрожжевой автолизат - 2 - 3
Экстракт солянки холмовой - 1 ± 0,1
4. Способ по п.2, отличающийся тем, что экстракт солянки холмовой добавляют дробно при посеве 50%, через 24 ч - остальные 50%.