АТТЕНУИРОВАННЫЙ ШТАММ ВИРУСА БОЛЕЗНИ НАЙРОБИ (NAIROBI SHEEP DISEASE VIRUS) Российский патент 2009 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к аттенуированным штаммам вируса болезни Найроби (ВБН), и может быть использовано для разработки и изготовления вакцинных препаратов против болезни Найроби в научно-исследовательских учреждениях и на предприятиях биологической промышленности.

Согласно принятой классификации вирус болезни Найроби относится к семейству Bunyaviridae, роду Nairovirus, вид Nairobi sheep disease virus (Regenmortel M.H.V., Fauquet CM., Bishop D.H.L. et al./ Virus Taxonomy The Classification and Nomenclature of Viruses. The Seven Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses // Academic Press, San Diego, 613 p.).

В настоящее время в неблагополучных районах Африканского континента для профилактики болезни Найроби (БН) используют вирус-вакцины, изготовленные на основе аттенуированных штаммов вируса болезни Найроби, полученных из мозга новорожденных белых мышей.

Р. Монтгомери пытался иммунизировать овец, вводя им различные объемы вирусного материала вслед за введением сыворотки от переболевших животных в различные интервалы времени, но ни одна из этих попыток не дала удовлетворительных результатов. Также он пытался получить инактивированную теплом вакцину, но попытки не увенчались успехом. Этот же автор предлагал проводить аттенуацию вируса на козах. (Montgomery, R.E. On a tick-borne gastroenteritis of sheep and goats occurring in British East Africa. // J. Сотр. Path.,. №30 1917, pp.28-57.)

Weinbren M.P. (1956) показал возможность активной иммунизации овец и коз, аттенуированным на мышах мозговым штаммом вируса БН. Для вакцинации использовали штамм Энтеббе (ПО мозговых пассажей) (Weinbren M.P. The developvent of a strain Nairobi sheep disease viruses non pathogenic for sheep a possible vaccine // Ann. Rep.E.A. Viruses Res. Inst, 1958, №8, p.12). Этот же штамм (140-150 мозговых пассажей) является наиболее апатогенным и безопасным для животных. (Weinbren M.P., Gourlay R.N., Lumsden W.H., Weinbrein B.M. An epizootic of Nairobi sheep disease in Uganda // J. Comp PathoL, 1958, №68, pp.174-187.)

Ansell (1957) сообщал о том, что штамм Мугуга-Тислон (22 мозговых пассажа), был авирулентным и защищал овец при контрольном заражении. (Ansell R.H. Attenuation of Nairobi sheep disease virus in the mouse brain // Veter. Rec. №69,1957, p.410-412.)

Попытки приготовления инактивированной формол-вакцины (Walker, 1932) на основе вирулентных штаммов и вакцины из вирулентной крови, обработанной кристалл-виолетом по методу Danbney (1944), были безуспешными. (Terpstra, С. Nairobi sheep disease-studies on virus properties, epizootiology and vaccination in Uganda // Diss., Univ. Utrecht. 1969.)

Имеются сообщения о культивировании штаммов вируса БН в культурах клеток. Полученный в культуре клеток ВНК- 21 культуральный вирус БН преципитировали метанолом, смешивали с адъювантом и использовали для иммунизации животных. Двухкратная иммунизация предохраняла овец при контрольном заражении. (Davies F.G., Otieno S. & Jessett D.M. The antibody response in sheep vaccinated with experimental Nairobi sheep disease vaccines // Trop. Anim. Health Prod., 1977, №9, pp.181-183).

В 1980 г. во ВНИИВВиМ Сафоновым Г.А. и Чистовым Ю.В. был получен вакцинный штамм ММ вируса БН путем серийного пассирования (134 пассажа) вирулентного вируса на белых мышах, активность которого составляла 6,5-7,0 lg MicLD₅₀/мл. Штамм MM в дозе 3,25 lg MicLD₅₀/мл защищал овец на 70-80% от контрольного заражения вирулентным вирусом до шести месяцев и был рекомендован для разработки живой вирус-вакцины.

Живые вирус-вакцины, полученные на основе культуральных вирусных штаммов, имеют ряд преимуществ перед применением вирус-вакцин, полученных из мозга новорожденных мышей: во-первых, можно гарантировать отсутствие в вакцине чужеродного вируса, во-вторых, концентрация вируса в таких вакцинах возрастает от серии к серии, что приводит к уменьшению дозировки и значительному снижению количества вводимого неспецифического антигенного материала, в-третьих, разработаны методы получения серий вакцин в больших объемах, что является более экономичным, к тому же риск контаминации в данном случае меньше, чем при получении вирус-вакцин из мозга мышей. Полученная таким путем вакцина дешевле из-за большого масштаба производства, так как для проверки значительного объема достаточно одного испытания на иммуногенность и отсутствие токсичности.

Целью изобретения является получение нового культурального аттенуированного штамма вируса БН, пригодного для разработки и изготовления вакцинных препаратов против этого заболевания.

Поставленная цель достигается путем клонирования и адаптации аттенуированного мозгового штамма ММ вируса БН к первично-трипсинизированной культуре клеток почки ягненка (ПЯ) и перевиваемой линии культур клеток почки сайги (ПС).

Полученный аттенуированный культуральный штамм вируса БН обозначен как штамм «ММ/К-05» и депонирован в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ под №2589 от 16.06.06 г.

Новый культуральный штамм обладает следующими свойствами.

Морфологические свойства: при электронно-микроскопическом исследовании в вируссодержащем материале обнаруживают вирусные частицы округлые или немного овальной формы, в ультратонких срезах иногда плеоморфные, диаметром 80-120 нм. Вирионы состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки толщиной 10-12 нм, на поверхности которой имеются выступы длиной 5-10 нм.

Культуральные свойства: штамма «ММ/К-05» вируса БН размножается в перевиваемых культурах клеток почки сайги (ПС) и почки овцы (ПО-ВНИИВВиМ) и в первично-трипсинизированной культуре клеток почки ягненка (ПЯ) с характерными для вируса БН цитоплазматическими изменениями с последующей деструкцией монослоя.

Способ выращивания: Штамм «ММ/К-05» культивируют в монослое перевиваемой культуре клеток ПС в стационарным и роллерным методом. При оптимальных условиях максимальное накопление вируса в перевиваемых культурах клеток составляет 6,5-7,0 lg ТЦД₅₀см³ достигается через 2-3 суток культивирования. Титр вируса в первично-трипсинизированной культуре клеток ПЯ 4,5-5,0 lg ТЦД₅₀/см³. В качестве поддерживающей среды используют среду Игла MEM с 2% сыворотки КРС.

Инфекционная активность: инфекционную активность определяют титрованием в культурах клеток ПС и ПО-ВНИИВВиМ, а также путем интрацеребрального заражения мышей-сосунов.

Антигенные свойства: при подкожном введении овцам и козам штамм «ММ/К-05» вызывает образование вируснейтрализующих, преципитирующих и комплементсвязывающих антител.

Специфичность вируса: специфичность вируса определяют методом прямой иммунофлуоресценции с помощью диагностического ФИТЦ-глобулина.

Патогенностъ для человека: вирус не патогенен для человека.

Вирулентность для восприимчивых животных: штамм «ММ/К-05» безвреден для коз и овец при подкожном и внутримышечном введении.

Безвредность для лабораторных животных; для лабораторных животных (кроликов, морских свинок) не является патогенным, у белых мышей при интрацеребральном заражении вызывает гибель.

Контагиозностъ: штамм «ММ/К-05» не передается от привитых не иммунным овцам и козам при их совместном содержании.

Реактогенностъ: штамм слабореактогенен для овец и коз при подкожном введении в дозе 3,0-5,0 lg ТЦД₅₀/см³. У некоторых привитых животных отмечали повышение температуры тела до 40,1-40,5°С в течение 2-3 суток.

Иммуногенные свойства: штамм «ММ/К-05» при подкожном введении в дозе 3,0 lg ТЦД₅₀/см³. У привитых овец и коз создает иммунитет на 21 день после прививки.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами: лиофилизированный штамм «ММ/К-05» 9 пассажа в культуре клеток ПС от 16.12.05 г. не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Стабильность генетических и иммунобиологических признаков: Основные биологические свойства штамма стабильно сохраняются на протяжении 15 пассажей (срок наблюдения) культивирования в перевиваемой культуре клеток ПС и ПО.

Способ и срок хранения, периодичность пассажей: штамм «ММ/К-05» хранят в лиофилизированном состоянии при температуре минус 40°С и «освежают» пассированием в культуре клеток ПС один раз в пять лет.

Пример 1. Культивирование штамма «ММ/К-05» ВБН в монослое перевиваемых культур клеток ПС и ПО-ВНИИВВиМ, выращенных в матрасах.

В результате выполненных исследований были отработаны оптимальные параметры культивирования штамма, которыми являлись:

- множественность заражения - 0,01-0,05 ТЦД₃₀/кл',

- содержание сыворотки КРС в поддерживающей среде Игла MEM-2%;

- рН среды - 7,2-7,4;

- длительность культивирования 3-4 суток;

- температурный режим 37,0±0,5°С;

- объем заполнения 1,5 л матрасов 0,2-0,25 литра.

Данные режимы культивирования позволяли получать вируссодержащий материал с активностью 6,5-7,0 lg ТЦД₅₀/см³ · Результаты наработки вирусного сырья 3 опытных серий на основе штамма «ММ/К-05» вируса БН представлены в таблице 1.

Таблица 1Характеристика вируссодержащего культурального сырья (штамм «ММ/К -05»), полученного в монослое культур клеток ПО и ПС.Номер серииКультура клетокКол-во матрасовЗаражающая доза,ТЦД₅₀/клДлит. культивир., суткиОбъем серииАктивность серии, lg ТЦД₅₀/см³1ПС50,0521,07,02ПС50,0131,06,753ПО50,0531,07,0

Как видно из таблицы, активность 3-х серий вирусного сырья, полученного стационарным методом в культурах клеток ПС и ПО-ВНИИВВиМ, составляла 6,75-7,0 lg ТЦД₃₀/см³.

Пример 2. Сохраняемость лиофилизированного штамма «ММ/К-05» ВБН при различных температурных режимах.

Вируссодержащий материал культурального штамма «ММ/К-05» ВБН 9 пассажа в культуре клеток ПС был лиофилизирован с пептоно-лактозным стабилизатором.

Активность опытного образца после высушивания при интрацеребральном заражении мышей-сосунов составляла 6,2 lg MicLD₅₀/см³, в культуре клеток ПС 6,5 lg ТЦД₅₀/см³.

Результаты исследований биологической активности штамма «ММ/К-05», хранящегося при различных температурах, представлены в табл.2.

Таблица 2Изучение сохраняемости культурального штамма «ММ/К-05» вируса болезни Найроби.Температурный режим (°С)Титр вируса при хранении (lg MicLD₅₀/см³)Исх.1 мес.3 мес.6 мес.9 мес.12 мес.Минус 40,0±0,56,26,26,26,26,26,22,0±2,06,26,25,95,65,34,918,0±2,06,25,55,04,23,63,037,0±0,56,2-н/ин/ин/ин/иПримечание: н/и - не исследовали
- - вирус не обнаружен

Как видно из табл.2, лиофилизированный штамм «ММ/К -05» ВБН сохранял исходную активность в течение 12 месяцев хранения при температуре минус 40±0,5°С. При температуре хранения 2,0±2,0°С инфекционная активность вируса снижалась на 1,3 lg MicLD₅₀/см³. При температуре (37,0±0,5)°С вирус не обнаруживали уже через 1 месяц.

Полученные результаты подтверждают литературные данные о нестабильности ВБН во внешней среде при хранении выше 0°С. Оптимальными условиями хранения лиофилизированного штамма «ММ/К-05» вируса БН является температура минус 40°С.

Пример 3. Проверка реверсибельности штамма «ММ/К-05» вируса БН.

С этой целью проводят 5 пассажей штамма «ММ/К-05» на восприимчивых животных. При проведении первого пассажа культуральный вирус вводили овце 8-месячного возраста в дозе 5,0 lg ТЦД₅₀/см³(100 ПВД) подкожно в подмышечную область. На 7 сутки отбирали пробу крови и вводили следующему животному аналогичным образом в объеме 1,0 см (второй пассаж). Аналогично проводили третий, четвертый и пятый пассаж.

У опытных животных отсутствовала клиническая реакция на прививку, они не заболевали болезнью Найроби в течение 21 суток наблюдения после введения материала. Это указывает на то, что штамм «ММ/К-05» вируса БН не реверсибелен.

Пример 4. Проверка иммунобиологических свойств штамма.

При изучении иммунобиологических свойств за 1 прививную дозу принимали 3,0 lg ТЦД₅₀/см³.

Безвредность штамма изучали на четырех овцах и двух козах 6-12 месячного возраста. Штамм «ММ/К-05» ВБН вводили подкожно в бесшерстный участок подмышечной области. Две овцы и две козы прививали вирусом в дозе 5,0 lg ТЦД₅₀/см³ (100 ПВД), остальных животных (две овцы) в дозе 4,0 lg ТЦД₅₀/см³ (100 ПВД).

В течение 21 суток иммунизированные животные оставались клинически здоровыми. У трех привитых животных в дозе 5,0 lg ТЦД₅₀/см на 4-9 сутки отмечали повышение температуры тела до 40,1-40,5°С в течение 2-4 суток (табл.3).

Иммуногенность штамма определяли по результатам контрольного заражения привитых животных вирулентным штаммом вируса БН в дозе 1000 LD₅₀.

С этой целью двух овец и одну козу 7-9 месячного возраста прививали вирусом БН в дозе 3,0 lg ТЦД_50/см³ _{(1 ПВД). У одной овцы после прививки отмечали повышение температуры тела до 40,4°С.}

Через 21 сутки после вакцинации всех привитых животных и одного контрольного заражали вирулентным штаммом. Вместе с этими животными заражали овец и коз, используемых в опыте по определению безвредности. Перед заражением у животных в сыворотках определяли уровень ВН-антител, накопление которых составляло 1:8-1:32.

Результаты опыта представлены в табл.3.

Контрольная овца погибла на 17-е сутки после заражения с клиническими признаками БН (температура тела 42°С, диарея, угнетение), тогда как привитые животные оставались клинически здоровыми в течение всего периода наблюдения.

Таблица 3Иммунобиологические свойства культурального штамма «ММ/К-05» вируса болезни Найроби, адаптированного к культуре клеток ПС.Прививная доза (ТЦД₅₀)Вид животногоРеакция на прививкуРезультаты контрольного зараженияДлит. темпер. реакции, (сут) Максим. температураДлит. темпер. реакции, (сут) Максим. температура10^5,0№1 овца340,5-40,0№2 овца440,3-39,9№3 коза240,2-39,7№4 коза340,1-39,810^4,0№5 овца240,2140,1№6 овца240,1-40,010^3,0№7 овца240,4-40,0№8 овца239,9140,4№9 коза239,8140,3КонтрольОвца -942,0

Полученные данные показывают, что адаптированный к перевиваемой культуре клеток ПС штамм «ММ/К-05» создает через 21 сутки у животных, привитых в дозе 3,0 lg ТЦД₅₀/см³ иммунитет против вирулентного вируса болезни Найроби. Штамм слабореактогенен и безвреден для овец, привитых в дозах 4,0 и 5,0 lg ТЦД₅₀/см³, не реверсибелен и индуцирует образование ВН-антител.

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к аттенуированным штаммам вируса болезни Найроби (ВБН). Аттенуированный культуральный штамм вируса болезни Найроби (Nairobi sheep disease virus), депонированный в коллекции штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ, инв. №2589. Изобретение может быть использовано для разработки и изготовления вакцинных препаратов против болезни Найроби в научно-исследовательских учреждениях и на предприятиях биологической промышленности. 3 табл.

Аттенуированный культуральный штамм вируса болезни Найроби (Nairobi sheep disease virus), депонированный в коллекции штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ, инв. №2589 от 16.06.06 г., пригодный для разработки и изготовления вакцинных препаратов.