АТТЕНУИРОВАННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ОСПЫ КОЗ Российский патент 2008 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к аттенуированным штаммам вируса оспы коз (ВОК), и может быть использовано для разработки и изготовления вирусвакцины против оспы коз в научно-исследовательских учреждениях и на предприятиях биологической промышленности.

Согласно принятой классификации вирус оспы коз относится к семейству Poxviridae, род Capripoxvirus, вид Goatpox virus (Regenmortel M.H.V., Fauquet C.M., Bishop D.H.L. et al. Virus Taxonomy The Classification and Nomenclature of Viruses. The Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses // Academic Press, San Diego, 1167 pp.).

В настоящее время в различных регионах мира аттенуированные или убитые штаммы вируса оспы коз используют для изготовления живых и инактивированных вакцин.

Так, в Китае аттенуированный штамм GT₄-STV₄₂ используют для получения культуральной вирусвакцины против оспы коз (ОК). Аттенуированный штамм GT₄-STV₄₂ не передавался горизонтально, не восстанавливал вирулентность после 5 серийных пассажей на козах (Wan g S., Jiang H., Lin X. et al. The pathomorphological studies on immunological effect of attenuated goat pox cellular virus. Acta veter. zootechn. sinica. 1988, 19, 2, 111-116).

В Российской Федерации известен гомогенат вирулентный штамм вируса оспы коз, который использовался Т.Я.Ванновским для разработки инактивированной «Гидроокисьалюминиевой формолглицериновой вакцины против оспы коз» (Осидзе Д.Ф. Ветеринарные препараты. М.: Колос, 1981). Недостатком данного штамма является низкая эффективность изготовленного на его основе препарата. Инактивированный препарат, полученный на основе вирулентного штамма оспы коз, создает нестойкий и короткий иммунитет (6 мес.), необходимость ревакцинации, использование больших объемов для иммунизации, сильную местную реакцию в месте введения вакцины, длительные сроки наступления иммунитета (21 сутки), имеет высокую себестоимость.

Использование аттенуированного штамма при конструировании живых вирусвакцин устраняет недостатки описанного выше инактивированного вирулентного штамма вируса оспы коз.

Аттенуированный штамм, используемый для производства живых вирусвакцин, обладает рядом преимуществ перед инактивированными препаратами, главными из которых являются: высокая напряженность и длительность создаваемого ими иммунитета при небольшой дозе вируса, слабая кратковременная общая и местная реакция, простота применения (однократная вакцинация), короткие сроки наступления иммунитета, низкая себестоимость препарата (Сергеев В.А. Вирусные вакцины// Киев: Урожай, 1993, - 368 с.).

Целью изобретения является получение нового аттенуированного культурального штамма вируса ОК, пригодного для разработки и изготовления вирусвакцины против оспы коз, индуцирующего напряженный иммунитет у привитых животных.

Поставленная цель достигается созданием путем клонирования и адаптации к перевиваемой линии культур клеток почки овцы (ПО - ВНИИВВиМ) и Vero авирулентного изолята вируса оспы коз, выделенного в Республике Таджикистан.

Полученный аттенуированный штамм вируса оспы коз обозначен как штамм «ОК/А-04» и депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ под инв. №2588 от 15.05.06.

Новый аттенуированный штамм обладает следующими свойствами:

Морфологические свойства: При электронно-микроскопическом исследовании в вируссодержащем материале обнаруживают вирусные частицы кирпичеобразной формы, размером 300-270-200 нм, морфологически тождественные представителям рода Capripoxvirus, сем. Poxviridae.

Культуральные свойства: Штамм размножается в перевиваемых культурах клеток ПО-ВНИИВВиМ и Vero с характерными для вируса оспы коз цитоплазматическими изменениями с последующей деструкцией монослоя. Вирус в указанных культурах клеток накапливается в титрах 5,5-6,0 lg ТЦД₅₀/см³.

Способ выращивания: Штамм культивируют в монослое перевиваемых линий культур клеток ПО и Vero в стационарных и роллерных культурах. При оптимальных условиях максимальное накопление вируса достигается через 5-6 суток культивирования. В качестве поддерживающей среды используют среду Игла-МЭМ с 2% сыворотки КРС.

Антигенные свойства: При подкожном введении козам штамм вызывает образование вируснейтрализующих антител.

Патогенность для человека: Не патогенен.

Вирулентность для восприимчивых животных: Штамм безвреден для коз и овец при подкожном введении в дозе 10^4,5 (100 прививных доз) ТЦД₅₀.

Безвредность для лабораторных животных: Для лабораторных животных (кроликов, морских свинок, мышей) не является патогенным.

Контагиозность и реверсибельность: Штамм не передается при совместном содержании от привитых неиммунным козам. Не восстанавливает вирулентные свойства после трех последовательных пассажей на козах.

Реактогенность: Штамм слабореактогенен для коз при подкожном введении. У некоторых привитых коз в дозе 10^2,5-10^3,0 ТЦД₅₀ может вызывать в течение 2-4 суток повышение температуры тела до 40,5-40,9°С.

Иммуногенные свойства: Штамм ОК/А-04 при подкожном введении в дозе 10^2,5-10^3,0 ТЦД₅₀ создает у привитых коз иммунитет на 14 день после прививки.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами: Лиофилизированный штамм не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Стабильность генетических и иммунобиологических признаков: Основные биологические свойства штамма стабильно сохраняются на протяжении 20 пассажей культивирования в перевиваемой культуре клеток ПО - ВНИИВВиМ (срок наблюдения).

Способ и срок хранения, периодичность пассажей: Штамм хранят в лиофилизированном состоянии при температуре минус 40°С и «освежают» пассированием в культуре клеток ПО-ВНИИВВиМ один раз в пять лет.

Пример 1. Культивирование штамма «ОК/А-04» вируса оспы коз в перевиваемой культуре клеток ПО-ВНИИВВиМ роллерным методом.

Получение культурального штамма роллерным методом осуществляют при следующих режимах культивирования:

- множественность заражения 0,01-0,05 ТЦД₅₀/кл;

- содержание сыворотки КРС в поддерживающей среде Игла-МЭМ 2%;

- скорость вращения роллерных бутылей 12-16 об/час;

- рН среды 7,0-7,4;

- срок смены поддерживающей среды при культивировании 3 суток;

- длительность культивирования 5-7 суток;

- температурный режим 37,0±0,5°С;

- объем заполнения роллерных трехлитровых бутылей 0,3-0,5 литра.

Данные режимы культивирования позволяют получать вируссодержащий материал с активностью 5,5-6,0 lg ТЦД 50/см³.

Результаты наработки трех опытных серий вируссодержащего материала на основе штамма «ОК/А-04» вируса оспы коз в культуре клеток ПО-ВНИИВВиМ представлены в табл.1.

Таблица 1
Характеристика вируссодержащего сырья, полученного роллерным методомНомер серииКоличество роллеровЗаражающая доза (ТЦД₅₀/кл)Сроки культивир. (сутки)Объем серии (л)Активность серии (lg ТЦД₅₀/см³)180,0562,46,0280,0552,45,5380,0152,46,0

Как видно из таблицы, активность трех серий вирусного сырья составляла 5,5-6,0 lg ТЦД₅₀/см³.

Пример 2. Сохраняемость лиофилизированного штамма «ОК/А-04» ВОК при различных температурных режимах.

Сохраняемость вакцинного штамма «ОК/А-04» ВОК трех лиофилизированых образцов культурального вируса после высушивания составляет 5,0-5,5 lg ТЦД₅₀/см³.

Результаты инфекционной активности трех серий лиофилизированного штамма «ОК/А-04» вируса оспы коз в процессе хранения при различных температурах приведены в табл.2.

Таблица 2
Сохраняемость лиофилизированного штамма «ОК/А-04» ВОКСерия мат-лаАктивность лиофил. штамма (lg ТЦД 50/см³)Темпер. хранения (°С)Инфекционная активность при хранении (lg ТЦД₅₀/см³)3 мес.6 мес.12 мес.24 мес.15,02±25,05,04,755,0-40±15,05,05,05,025,02±25,05,05,05,0-40±15,05,05,05,035,52±25,55,55,55,5-40±15,55,755,55,518±1н/и5,04,253,25Примечание: н/и - не исследовали

Как видно из табл.2, лиофилизированный штамм «ОК/А-04» вируса ОК сохранял исходную активность в течение 24 месяцев хранения при температуре 2±2 и - 40±0,5°С.

Сохраняемость одной серии (№3) лиофилизированного штамма проверена при 18±1°С. В течение 12 месяцев хранения при этой температуре активность штамма снизилась на 1,25 lg ТЦД₅₀/см³, а через 24 месяца на 2,25 lg ТЦД₅₀/см³.

Эти данные указывают на хорошую сохраняемость данного штамма после лиофилизации, параметры которой сходны с таковыми у вируса оспы овец и другими вирусами оспы животных.

Пример 3. Проверка реверсибельности штамма «ОК/А-04» вируса оспы коз.

С этой целью проводят 3 пассажа штамма «ОК/А-04» на восприимчивых животных. При проведении первого пассажа культуральный вирус вводили козе 6-месячного возраста в дозе 3,5 lg ИД₅₀ (10 прививных доз) подкожно в подмышечную область. На 6 сутки козу убивали, у нее отбирали бронхиальные и предлопаточные лимфоузлы, из которых готовили 10% суспензию на физиологическом растворе. Полученный материал дважды промораживали при -70°С и после осветления (1500 об/мин в течение 15 минут) вводили следующему животному аналогичным образом в объеме 1,0 см³ (второй пассаж). Аналогично проводят третий пассаж.

У опытных животных отсутствует клиническая реакция на прививку, а также реакция на месте введения вируса. Коза 3-го пассажа не заболела оспой в течение 21 суток после введения материала (срок наблюдения). Это указывало на стабильность биологических свойств у штамма «ОК/А-04» в течение трех пассажей в опыте на естественно восприимчивых животных.

Реверсибельность проверена с вирусом, прошедшим 20 пассажей в перевиваемой культуре клеток ПО-ВНИИВВиМ. Культуральный штамм с активностью 4,5 lg ТЦД₅₀/см³ вводили подкожно 2 козам в объеме 1,0 см³. Клиническая реакция на введение вируса у животных отсутствует.

Это указывает на то, что штамм «ОК/А-04» вируса OK - нереверсибелен.

Пример 4. Проверка иммунобиологических свойств штамма «ОК/А-04» вируса ОК.

При проверке иммуногенности штамма в соответствии с рекомендациями МЭБ за одну прививную дозу принимали 10^2,5 ТЦД₅₀ вируса.

Безвредность штамма проверяют на козах и овцах 7-9-месячного возраста. Штамм вводят подкожно в бесшерстный участок подмышечной области. Двух коз и овцу прививали вирусом в дозе 10^4,5 ТЦД₅₀ (100 прививных доз), одну козу в дозе 10^3,5 ТЦД₅₀ (10 прививных доз). В течение 15 суток иммунизированные козы и овца оставались клинически здоровыми. У привитых коз на 7-9 сутки отмечали повышение температуры тела до 40,6-40,7°С в течение 2-3 суток. Вакцинированная овца оставалась клинически здоровой в течение всего срока наблюдения.

Иммуногенность штамма определяют по результатам контрольного заражения привитых коз вирулентным штаммом «Дангаринский» вируса оспы коз в дозе 1000 ИД₅₀. С этой целью двух коз вакцинируют вирусом в дозе 10^2,5 ТЦД₅₀ (1 прививная доза). У одной козы температурная реакция отсутствует, у второй на 7-8 сутки отмечают повышение температуры тела до 40,5°С.

Через 14 суток опытных животных и одну контрольную козу заражают штаммом «Дангаринский» в дозе 1000 ИД₅₀. Вирус вводят внутрикожно в подхвостовую складку в объеме 0,5 см³. Вместе с этими животными заражены козы и овца, используемые в опыте по определению безвредности штамма. Результаты этих опытов представлены в табл.3.

Иммунизированные животные не реагировали на заражение вирулентным вирусом (срок наблюдения 30 суток), в то время как контрольная коза переболела оспой с характерными клиническими признаками, длительность температурной реакции составляла 6 суток, температура тела достигала 41,7°С.

Таблица 3
Иммуногенные свойства штамма «ОК/А-04» ВОКПрививная доза (ТЦД₅₀)Номер и вид животныхРеакция на прививкуРезультаты контрольного зараженияТемпер. реакция (сут)Максим. темпер. (°С)Темпер. реакция (сут)Максим. темп. (°С)10^4,5№1 коза540,7-39,7№2 коза240,6-39,8№3 овца-39,7-39,610^3,5№4 коза340,6-39,410^2,5№5 коза240,5-39,1№6 коза-39,4-39,6контроль№7 коза--641,7

Эти данные показывают, что аттенуированный штамм «ОК/А-04» ВОК создает через 14 суток у привитых в дозе 10^2,5 ТЦД₅₀ коз иммунитет против вирулентного штамма «Дангаринский» вируса оспы коз и безвреден для коз и овец, привитых в дозе 10^4,5 ТЦД₅₀.

На основании этого штамма изготовлена экспериментальная серия вирусвакцины в количестве 82,5 тыс. доз, которая проверена во внутриинститутских комиссионных испытаниях.

Показано, что вирусвакцина безвредна для коз и овец при введении им 10 и 100 прививных доз препарата. На 14 сутки после иммунизации одной (10^2,5 ТЦД₅₀) и 0,1 (10^1,5 ТЦД₅₀) прививной дозы вакцина защищала коз от заражения вирулентным вирусом.

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к аттенуированным штаммам вируса оспы коз. Путем клонирования и адаптации к перевиваемой линии культур клеток почки овцы получен новый аттенуированный культуральный штамм вируса оспы коз. Изобретение может быть использовано для разработки и изготовления вакцины против оспы коз в научно-исследовательских учреждениях и на предприятиях биологической промышленности. 3 табл.

Аттенуированный штамм вируса оспы коз, семейство Variola coprina virus, коллекция штаммов микроорганизмов ВНИИВВиМ №2588 от 15.05.06, для разработки и изготовления вакцинных препаратов.