СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВЫХ К КОККОМИКОЗУ ФОРМ ВИШНИ И ЧЕРЕШНИ Российский патент 2009 года по МПК A01H1/04 G01N27/447 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к плодоводству, и может быть использовано для определения иммунных и высокоустойчивых к коккомикозу форм черешни, вишни и подвоев для этих культур.

За последние два десятилетия в нашей стране значительно уменьшились площади выращивания вишни и черешни (род Вишня (Cerasus Juss.)). Одной из причин этого является сильное поражение сортов и подвоев коккомикозом (возбудитель - Coccomuces 'hiemalis Higg. sun. Blumeriella jaapii Rehm.v.Arx. - сумчатая стадия, Cylindosporium hiemalle Higg-конидиальная стадия), поэтому создание и внедрение устойчивых к данной инфекции форм является одним из главных направлений в плодоводстве.

Известен способ отбора иммунных сортов на естественном инфекционном фоне, требующий не менее 3-5 лет наблюдений, причем хотя бы 1 год должен быть эпифитотийным [Жданов В.В., Огольцова Т.П. Селекция на устойчивость к болезням и вредителям // Программа и методика селекции плодовых ягодных и орехоплодных культур. - Орел: Изд-во Всероссийского научно-исследовательского института селекции плодовых культур, 1995. - С.58-67].

Известен также способ отбора иммунных сортов на искусственном инфекционном фоне, рекомендующий использовать сборный инокулюм, состоящий из большого количества моноспоровых клонов или биотипов гриба с различных сортов и из разных географических зон. Учет поражения в камерах проводят через 8-11 дней [Изучение устойчивости черешни и вишни к коккомикозу: Методические указания/ Сост.: М.С.Чеботарева. - Л., Изд-во ВНИИР им. Н.И.Вавилова, 1985, - 29 с.].

Наиболее близким к заявленному является способ определения иммунных и высоко устойчивых к коккомикозу форм черешни и вишни в полевых условиях при изучении одного и того же набора сортов в течение не менее 3 лет, причем хотя бы 1 год должен быть эпифитотийным. Сначала проводят листовую диагностику путем отбора у каждого сорта 3-4 одновозрастных деревьев нормального развития. Листья просматривают по 100 шт. на приростах текущего года с разных сторон деревьев на высоте - 1,5-2 м в течение вегетации растения, начиная с мая, подсчитывают число листьев пораженных болезнью, а затем по шести балльной шкале учета поражения дают оценку устойчивости (Жуков О.С., Харитонова Е.Н. Селекция вишни, - М.: Изд-во ВО «Агропромиздат», 1988. - С.142).

Недостатками вышеперечисленных способов являются: значительная продолжительность и трудоемкость процесса, а также неточность определения степени устойчивости форм из-за того, что развитие болезни и поражаемость изученных образцов во многом зависит от складывающихся погодных условий, субъективных факторов, например, от степени подготовки специалиста фитопатолога.

Техническим результатом при использовании предлагаемого способа является значительное сокращение продолжительности процесса определения устойчивых форм, а также существенное увеличение его достоверности за счет учета объективных данных о физиологическом состоянии исследуемого образца.

Технический результат достигают за счет того, что в способе определения устойчивых к коккомикозу форм вишни и черешни, предусматривающем листовую диагностику изучаемого образца с последующим определением устойчивости форм к инфекции, листовую диагностику проводят в период активного роста листьев путем получения из листьев СВЧ-экстракта фенольных соединений, после чего его разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:4-1:5, дозируют пробу в амперометрический анализатор и об устойчивости форм к инфекции судят по наличию сигнала детектора при потенциале 0,4 В на стеклоуглеродном электроде.

Одним из способов извлечения содержащихся в биологическом (растительном) материале веществ, как известно из литературы, является экстракция под воздействием СВЧ-полей, который имеет ряд определенных преимуществ перед другими способами экстракции [Пробоподготовка в микроволновых печах. Теория и практика. Под ред. Г.М.Кингстон, Л.-Б. Джесси. - М.: Мир, 1991. - с.210-221]. СВЧ-экстракт получают с помощью СВЧ-минерализаторов или экстракторов. На базе ГНУ СКЗНИИСиВ Россельхозакадемии была разработана методика получения СВЧ-экстракта из растительного сырья с помощью СВЧ-минерализатора «Минотавр-1», где в качестве экстрагента использован раствор этилового спирта [Якуба Ю.Ф. Применение СВЧ-экстракции и высокоэффективного капиллярного электрофореза для анализа вегетативных органов растений // II Международная конференция «Современное приборное обеспечение и методы анализа почв, кормов, растений и сельскохозяйственного сырья. Материалы конференции. - М., 2004. - С.71-74]. Предлагаемым способом были исследованы более десятка высокоустойчивых иммунных и поражаемых коккомикозом форм рода Вишня (Cerasus Juss.). При этом было обнаружено, что у форм, которые в дальнейшем не поражались коккомикозом, в экстракте фенольных соединений, полученном в период активного роста из листового материала, присутствует определенное фенолкарбоновое соединение, сопровождающееся выходом на амперограмме характерного сигнала на стеклоуглеродном электроде детектора при потенциале 0,4 В.

Исследования проводили на производственной базе СКЗНИИСиВ путем листовой диагностики различных форм рода Вишни (Cerasus Juss.), выращенных в различных зонах Северного Кавказа, которую осуществляли в различные периоды вегетации растений. Анализ амперограмм, полученных в разные периоды вегетации, показал их значительное различие. Причем достоверность оценки устойчивости повышается при анализе листового материала, отобранного в период активного роста листа, т.е. до момента, когда признаки поражения коккомикозом еще не проявляются.

В графическом материале на Фиг.1 и Фиг.2 отражены наиболее характерные амперограммы, полученные в результате осуществления предлагаемого способа, которые состоят из 2-х последовательных вводов проб. На фиг.1 представлена амперограмма фенольных соединений экстракта, полученного из листьев устойчивых к инфекции форм, а на Фиг.2 - неустойчивых.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Листовую диагностику проводили путем отбора листьев на приростах текущего года с разных сторон деревьев на высоте - 1,5-2 м в мае. Готовили высечку листьев форм с заранее известными устойчивыми (иммунными) к коккомикозу свойствами: C.lannesiana №2, С.serrulata Halle Tolivetto, ВСЛ-2, от 1 года до 10 лет, (род Вишня (Cerasus Juss.)), которую в количестве 1 грамм вносили в контейнер СВЧ-минерализатора «Минотавр-1», заливали 25 см³ 10% водно-спиртовым раствором и проводили экстракцию в режиме «разложение без давления» в течение 10 минут. После охлаждения полученного экстракта в естественных условиях и разбавления в соотношении 1:4 дистиллированной водой с помощью медицинского шприца объемом 5 см³, вводили пробу в дозирующее устройство амперометрического анализатора «ЦветЯуза-01-АА» и регистрировали сигнал детектора при потенциале 0,4 В на стандартном стеклоуглеродном электроде. В основе работы прибора Цвет Яуза-01-АА лежит способность к окислению фенольных веществ и измерении величиной окисляемости этих соединений на рабочем электроде амперометрического детектора. Сигнал регистрировали в виде дифференциальных выходных кривых, подобных хроматографическим пикам (Фиг.1). Время определения амперометрического сигнала составляет 2 минуты и не требует вспомогательных реактивов.

Пример 2. Способ осуществляли аналогично примеру 1, кроме того, что разбавление экстракта дистиллированной водой производили в соотношении 1:5.

Пример 3. Способ осуществляли аналогично примера 1, кроме того, что исследовали экстракт листьев с заранее известными неустойчивыми к коккомикозу свойствами: вишни Любская, вишни Краснодарская сладкая, черешни Франц Иосиф (род Вишня (Cerasus Juss.)). Образцы брались с разных участков Краснодарского края. На амперограмме сигнал не зарегистрирован (Фиг.2).

Пример 4. Способ осуществляли аналогично примера 1, кроме того, что проводили исследование экстракта листьев новых форм вишни и черешни, проходящими (в течение 2003, 2004 - эпитофийный, 2005, 2006 гг.) или завершенными на данный момент полевыми испытаниями. Например, изучение гибрида И89 в течение 4-х лет полевым методом не дал однозначного ответа на предмет об их устойчивости к инфекции. Исследование листового материала этого же гибрида предлагаемым способом, в результате, которого сигнал амперометрического не зарегистрирован, дало однозначный ответ - гибрид не устойчив к коккомикозу. На примере исследования гибридов АИ1 и АИ3 в течение 4-х лет, который к 2006 г. завершен с характеристикой - «устойчив к коккомикозу», в том же 2006 г. (в мае) в результате реализации предлагаемого способа, получил ту же характеристику, но только в течение нескольких минут.

Таким образом, предлагаемый способ позволил достоверно и воспроизводимо в течение мая (анализ длится 2 мин) определить устойчивые к коккомикозу формы вишни и черешни, вне зависимости от возраста растений, погодных условий, текущего года наблюдений и наличия года с эпифитотийным развитием коккомикоза.

Изобретение может быть использовано для определения иммунных и высокоустойчивых к коккомикозу форм черешни, вишни и подвоев для этих культур. В период активного роста листьев проводят листовую диагностику путем получения из них СВЧ-экстракта фенольных соединений. Полученный экстракт разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:4-1:5, и дозируют пробу в амперометрический анализатор. Об устойчивости форм к инфекции судят по наличию сигнала детектора при потенциале 0,4 В на стеклоуглеродном электроде. За счет учета объективных данных о физиологическом состоянии исследуемого образца значительно сокращается продолжительность процесса определения устойчивых к инфекции форм, а также существенно увеличивается его достоверность. 2 ил.

Способ определения устойчивых к коккомикозу форм вишни и черешни, предусматривающий листовую диагностику изучаемого образца с последующим определением устойчивых к инфекции форм, отличающийся тем, что листовую диагностику проводят в период активного роста листьев путем получения из них СВЧ-экстракта фенольных соединений, который затем разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:4-1:5, дозируют пробу в амперометрический анализатор и об устойчивости форм к инфекции судят по наличию сигнала детектора при потенциале 0,4 В на стеклоуглеродном электроде.