ИНВЕРСИОННО-ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА В*002 Российский патент 1997 года по МПК G01N27/26 

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к инверсионному вольт-амперометрическому способу определения водорастворимого витамина B₂ (рибофлавин, 6,7-диметил-9-/D-1-рибитил/-изоаллоксазин), участвующего в окислительно-восстановительных реакциях в живом организме, выполняя функции переносчика водорода в процессах углеводного, белкового и жирового обмена, в синтезе гемоглобина и поддержаний зрительной функции глаза. Показаниями к применению витамина B₂ являются нарушения функции кишечника, спру, болезни Боткина и другие заболевания.

Определение микроколичеств рибофлавина очень важно для оценки качества пищевых продуктов и идентификации действующих веществ в лекарственных формах витаминов группы B. С каждым годом расширяется ассортимент и увеличивается производство поливитаминных (ПВ) препаратов и продуктов питания, совершенствуется рецептура детского питания. Это в свою очередь предъявляет повышенные требования к контролю за качеством выпускаемой продукции и совершенствованию методов определения витаминов в различных объектах.

Для анализа витамина B₂ в настоящее время применяют различные методы [1] Одними из старых являются химические методы, основанные на цветных реакциях, характерных для специфических группировок, входящих в витамин [2] Нередко для количественного определения водорастворимых витаминов использовали титриметрические методы в водных или неводных растворителях (диоксане, ацетоуксусном эфире) [3] Чувствительность таких методов невелика - 10^-1-10^-2 мг/мл и зачастую они используются для качественного обнаружения витаминов в различных веществах и биологических жидкостях.

Используемые в современных лабораториях методики количественного определения витамина B₂ в продуктах питания и ПВ-препаратах, рекомедуемые в настоящее время нормативно-техническими документами, включают множество вариантов оптических методов. Для определения витамина B₂ используют, как правило, флюорометрический метод [4, 5] в двух вариантах. Один из них вариант прямой флюориметрии основан на определении интенсивности флюоресценции до и после восстановления рибофлавина гидросульфатом натрия. Второй вариант люмифлавиновый, основанный на использовании свойства витамина B₂ при облучении в щелочной среде переходить в люмифлавин, интенсивность флюоресценции которого измеряют после извлечения его хлороформом [4, 5] Чувствительность определения (0,8-2,0)•10^-4 мг/мл. Анализ затрудняется наличием в ряде объектов веществ, обладающих флюоресценцией. Маскируя флюоресценцию витамина, эти вещества искажают результаты анализа и делают невозможным проведение определения без специальных обработок проб. Удаляют мешающие соединения, пропуская анализируемый раствор через колонки с ионнообменными смолами [4] В пищевых продуктах витамин B₂ может находиться в свободном состоянии и в виде фосфорных эфиров, связанных с белками, и поэтому не может быть определен этими методами без предварительного длительного (более 16 часов) расщепления с использованием дорогостоящих ферментов. При определении ПВ-препаратов эти методы также недостаточно селективны, трудоемки, требуют больших затрат времени, реактивов, что связано также с предварительным выделением компонентов.

Возможность полярографического определения витамина B₂ на уровне 0,04 мг/мл в присутствии витамина C и фолиевой кислоты показана в работе [6] В качестве фона использовали бурафосфатный буфер pH 6,8. Индикаторным электродом служил ртутно-капающий электрод (р. к.э.). Наиболее близким является метод переменно-токовой вольт-амперометрии с фазочувствительным детектором с использованием стационарного ртутного электрода (с.р.э.) [7] (прототип). Для определения витамина B₂ этим методом в чистых растворах использовали пики восстановления адсорбированных форм витамина в аммиачном буферном растворе pH 9-12 (E_1/2=-0,55 B) и 1 M HCl pH 6,20 (E_1/2=-1,3 B) относительно насыщенного каломельного электрода (нас. к.э.) при скорости развертки потенциала 50 Мв/сек. Предел обнаружения витамина B₂ 7•10^-8 мг/мл.

В данных условиях определение витамина B₂ на уровне 1•10^-8 мг/мл невозможно. Поэтому разработка экспрессных и высокочувствительных методов определения витамина B₂ продолжает представлять интерес.

Задачей заявляемого изобретения является повышение чувствительности определения витамина B₂, экспрессности и селективности методом дифференциальной инверсионной вольт-амперометрии (ДИВ).

Поставленная задача достигается тем, что витамин B₂ электрохимически концентрируется на стеклоуглеродном (СУ) или пирографитовом (ПГ) электроде с последующей регистрацией анодных пиков. Новым в способе является то, что электрохимическое концентрирование витамина B₂ ведут на стеклоуглеродном или пириграфитовом электроде при потенциалах (-0,5)-(-0,6) B в течение 60-120 сек в растворе калия фталевокислого кислого концентрацией 0,05 М или в растворе хлорида калия концентрацией 0,2 М в присутствии соляной кислоты или серной кислоты, или хлорной кислоты с pH 2-4, регистрацию анодных пиков ведут в режиме дробного дифференцирования при скорости развертки потенциала 10-20 мВ/сек и концентрацию витамина B₂ определяют по высоте анодного пика в интервале потенциалов (-0,18)-(-0,30) B относительно хлорсеребряного электрода.

В прототипе описано использование в качестве фонов аммиачного буфера pH 9-11,75 и 1 M KCl pH 6,20. Определение витамина B₂ в этих условиях затрудено из-за плохой воспроизводимости и искажения формы аналитического сигнала, связанных с регистрацией дополнительного пика при потенциале -(0,35-0,45) B, что делает невозможным проведение анализа на этих фонах. Предлагаемые в заявляемом изобретении фоны 0,05 M C₈H₅O₄K, смесь 0,2 M KCl с кислотами HCl или H₂SO₄, или HClO₄ (pH 2-4) позволяет определять витамин B₂ на уровне 10^-8 мг/мл с хорошей воспроизводимостью. Относительное стандартное отклонение (Sr) не превышает 0,05. Фоны 0,05 M C₈H₅O₄K; 0,2 M KCl в смеси с кислотами HCl или H₂SO₄, или HCIO₄ до pH 2-4 подобраны экспериментально. Абсолютной новизной являются экспериментально подобранный фон 0,05 M C₈H₅O₄K, установленный pH раствора и использование смесей 0,2 M KCl с кислотами, от чего зависит количественное определение витамина. Использование смесей KCl и кислот способствует хорошей растворимости определяемого вещества, приводит к стабилизации и денатурации следов белковых примесей, остаточное содержание которых возможно в анализируемых пробах пищевых продуктов и ПВ-препаратов и позволяет анализировать растворы на уровне нанограммовых количеств определяемого вещества. Оптимальный диапазон pH для всех фонов 2-4 определяется хорошей воспроизводимостью и фиксированием одного пика окисления витамина B₂. Более низкие значения pH (pH<2) и более высокие (pH>4) нежелательным, т.к. возможна регистрация плохо воспроизводимого аналитического сигнала, что снижает точность, чувствительность и экспрессность определения. Количественное определение витамина B₂ впервые стало возможным на указанных фонах на уровне 10^-8 мг/мл методом дифференциальной инверсионной вольт-амперометрии и характерно только для витамина B₂ (табл. 1). Зависимость аналитического сигнала от концентрации витамина B₂ в таких растворах прямо пропорциональна диапазону определяемых содержаний от 10^-8 до 10^-4 мг/мл.

Другим отличительным признаком являются установленные условия электрохимического накопления: E_э=-(0,5-0,6) B. При потенциалах -0,5<E_э<-0,6 B уменьшилась величина тока окисления органического вещества, кроме того, при E_э<-0,6 B возникал большой остаточный ток, связанный с выделением водорода в кислых растворах. Из табл. 2 видно, что областью оптимальных потенциалов накопления является потенциал -(0,5-0,6) B. Только при этих условиях возможно количественное определение витамина B₂ на уровне 10^-8-10^-7 мг/мл с регистрацией вольт-амперограмм с четко выраженным максимумом. Без предварительного электролиза невозможно количественное определение витамина на уровне нанограммовых содержаний. Электрохимическое концентрирование повышает чувствительность и разрешающую способность способа и позволяет экспрессно проводить анализ витамина B₂ содержанием менее 1•10^-7 мг/мл в мутных и окрашенных средах без предварительного отделения пищевых пигментов, сопутствующих компонентов в ПВ-препаратах.

В качестве индикаторных применяли три типа углеродных электродов - графитовый (Г), пропитанный полиэтиленом с парафином в вакууме или эпоксидной смолой, пирографитовый (ПГ) и стеклоуглеродный (СУ) (в прототипе применяли стационарный ртутный и ртутно-капающий электроды). Использование таких электродов обусловлено высокой химической и электрохимической устойчивостью графита, широкой областью рабочих потенциалов как в водных, так и в неводных средах, а также простотой механического обновления поверхности. Величина потенциала окисления витамина B₂ (в прототипе использованы волны и пики восстановления) определяется строением, структурой и степенью адсорбируемости на гексагонах графита, имеющих π-зонную структуру. По легкости окисления витамина электроды можно расположить в ряд:
Г (0,28-0,37) B
СУ (0,20-0,27) B
ПГ (0,18-0,25) B
Структурное подобие материала электрода и адсорбция плоскостью молекулы (стереоспецифическая адсорбция), по-видимому, благоприятствует переходу электронов при меньшем значении потенциала и способствует более обратимому окислению витамина B₂ на графите, чем на СУ и ПГ. Максимальное значение регистрируемого тока с использованием графитового электрода несколько выше (≈ на 20-30% ), однако из-за большого остаточного тока он оказался менее удобным в работе, чем СУ и ПГ, особенно при количественном определении витамина в пищевых продуктах и биосистемах (плазма крови). Для определения витамина B₂ впервые использовали "игольчатые" по форме графитовые индикаторные электроды. При использовании таких электродов диффузия деполяризатора протекает по-разному к цилиндрической и сферической частям его поверхности. Поэтому в выражение для тока добавляется дополнительное стационарное слагаемое [8]
.

В связи с этим использование "игольчатых" электродов в аналитической практике позволяет увеличить чувствительность способа определения витамина B₂. Ртутно-пленочные "игольчатые" электроды использовались ранее для определения металлов и некоторых органических веществ. Графитовые (СУ, ПГ) "игольчатые" электроды впервые использованы для определения водорастворимого витамина B₂.

Важным для определения витамина B₂ методом ДИВ является выбор скорости развертки потенциала. Оптимальной является скорость 10-20 мВ/сек. Увеличение скорости более 20 мВ/сек при линейно меняющемся потенциале увеличивает чувствительность, но при этом растет остаточный ток и уменьшается разрешающая способность способа. Использование скорости 50 мВ/сек, указанной в прототипе, ухудшает воспроизводимость, искажает форму поляризационных кривых, что усложняет обработку результатов анализа. При скорости менее 10 мВ/сек снижается величина анодного тока и понижается чувствительность определения витамина.

Время предварительного электролиза выбирают в зависимости от концентрации определяемого вещества. Максимальное значение величины тока окисления достигается при τ_э равном 60-120 сек.

При τ_э< 60 сек снижается чувствительность определения, а при τ_э> 120 сек снижается экспрессность и увеличивается ошибка определения при анализе поли- и мультивитаминных препаратов (Sr≥0,1).

Использование дифференциального режима записи вольт-амперограмм позволяет фиксировать четкие узкие пики, что повышает разрешающую способность способа и облегчает автоматизацию электродного процесса. Для определения витамина B₂ он ранее не применялся.

Установленные условия впервые позволили количественно определять витамин B₂ на уровне 1•10^-8 мг/мл в присутствии пигментов в мутных и окрашенных средах без предварительного отделения других водорастворимых витаминов группы B, PP, аскорбиновой, фолиевой, никотиновой, мочевой кислот, триптофана (и некоторых его матаболитов), мочевины, ряда фенольных и оксисоединений, ионов PO₄ ^3-, Cl^-, F^-, Br^-, Zn²⁺, Cu²⁺, Cd²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺ и др.

Пример 1. Определение витамина B₂ на уровне 10^-8-10^-7 мг/мл.

В кварцевый стаканчик емкостью 20 мл наливают 10 мл 0,05 М калия фталевокислого кислого. Раствор деаэрируют азотом с содержанием кислорода менее 0,001% в течение 3 минут, не прекращая перемешивания, проводят электролиз раствора при условии: E_э=-0,6 B; τ_э 120 сек. Отключают газ и фиксируют анодную дифференциальную вольт-амперограмму при скорости развертки потенциала 15 мВ/сек, начиная с потенциала E_нач=-0,5 B. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона. Затем добавляют несколько капель объемом 0,01 мл стандартного раствора витамина (1-2)•10^-5-10^-4 мг/мл, перемешивают раствор 10 сек, проводят электрохимическое концентрирование осадка при E_э=-0,6 B и τ_э= 120 сек. Съемку вольт-амперной кривой начинают с потенциала -0,5 B. Пик для указанной концентрации витамина регистрируют в диапазоне потенциалов от -0,28 до -0,03 B при чувствительности прибора (0,5-1)•10^-9 A/мм. Время единичного анализа не превышает 10 минут.

Пример 2. Определение витамина B₂ в поли- и мультивитаминных препаратах.

В кварцевый полярографически чистый стаканчик емкостью 15 мл наливают 0,1-0,2 мл раствора ПВ-препарата, предварительно растворенного при нагревании в соляной или серной кислоте pH 3-4, доводят раствором фона 0,2 M KCl до метки 10 мл и помещают в электролизер. В течение 3 минут удаляют из раствора кислород газообразным азотом с содержанием кислорода менее 0,001% Снимают дифференциальную вольт-амперограмму при условии E_э=-0,5 B, τ_э60 сек и линейной развертке потенциала 15 мВ/сек в анодную область, начиная с потенциала -0,5 B. Затем в стаканчик добавляют n капель объемом 0,04 мл 2•10^-2 мг/мл витамина B₂. Перемешивают раствор 10 сек, проводят электрохимическое концентрирование при E_э=-0,5 B и τ_э60 сек. Съемку вольт-амперограммы начинают с потенциала -(0,45-0,5) B. Пик для указанной концентрации регистрируют в диапазоне потенциалов -(0,22-0,28) B при скорости 15 мВ/сек, чувствительности прибора (1-4)•10^-9 A/мм. Время анализа одной пробы примерно 10 минут.

Пример 3. Определение витамина B₂ в водных вытяжках сапропелий.

Аликвоту водной вытяжки (в которую предварительно добавляют KCl до концентрации 0,2 M и HClO₄ до pH 4) объемом 1 мл вносят в кварцевый полярографически чистый стаканчик, который помещают в электролизер. В течение 5 минут удаляют из раствора кислород газообразным азотом с содержанием кислорода менее 0,001% Снимают дифференциальную вольт-амперограмму при условии E_э=-0,5 B и τ_э10 сек и линейной развертке потенциала 20 мВ/сек в анодную область, начиная с потенциала -0,45. Затем в стаканчик добавляют 1-2 капли объемом 0,01 мл 1•10^-2 мг/мл витамина. Перемешивают раствор 5 сек и проводят электрохимическое концентрирование при E_э=-0,5 B и τ_э100 сек и вновь снимают вольт-амперограмму в тех же условиях. Пик для указанной концентрации регистрируют в диапазоне потенциалов -(0,28-0,30) B при чувствительности прибора (1-2)•10^-9 A/мл. Время анализа одной пробы менее 10 минут.

Правильность методик с использованием предлагаемого способа определения витамина B₂ проверена несколькими способами контроля и доказана методами аттестованных растворов и "введено-найдено" и сравнением результатов с флюориметрическим способом определения витамина B₂.

Таким образом, ДИВ-способ позволил существенно улучшить метрологические характеристики анализа витамина B₂. Предел обнаружения 1•10^-8 мг/мл. По сравнению с прототипом чувствительность определения повышается примерно на порядок. По сравнению с методами, рекомендованными нормативными документами [4] время анализа витаминов B₂ с учетом пробоподготовки в пищевых продуктах и ПВ-препаратах может быть сокращено более чем в 100 раз.

Предложенный способ прост, экспрессен, не требует применения дефицитных ферментов и большого количества реактивов (по сравнению с методами ГОСТ 25999-85), может быть применен не только для контроля качества сырья пищевых продуктов и фармакопейных препаратов, но и для анализа витаминов в биологических жидкостях (крови, плазме, лимфе) и объектах окружающей среды (в водных вытяжках сапропелий, илов). ДИВ-способ может быть использован для создания диагностической системы витаминного метаболизма человека и животных.

Литература.

1. Ульянова С.В. Шавлинский А.М. Морев С.Н. Дмитриенко Т.С. Финкельштейн Е. И. Кирсанов А.Г. Использование физико-химических методов в анализе поливитаминных препаратов, содержащих водорастворимые витамины B₁, B₂, B₆, C и никотинамид//Фармация. 1993. т. 42, N 3. С. 60-62.

2. Кушманова О. Д. Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. М. Медицина, 1983, 272 с.

3. Денеш И. Титрование в неводных средах. М. Мир, 1991, 413 с.

4. ГОСТ 25999-83. Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения витаминов B₁ и B₂. М. Госкомитет по стандартам, 1984, 11 с.

5. Химический состав пищевых продуктов. М. Легкая промышленность, 1984, 320 с.

6. Крузе И.В. Полярографическое определение аскорбиновой, фолиевой кислот и рибофлавина//Фармация. 1969. N 4. С. 59-62.

7. Григорьев В. И. Миляев Ю.Ф. Белятинская Л.И. Адсорбционное концентрирование и определение количеств рибофлавина методом переменно-токовой вольт-амперометрии//Журн. аналит. химии. 1985. Т. 40, N 4. С. 736-739.

8. Назаров Б.Ф. Теоретические основы амальгамной полярографии с накоплением. Томск. ТПИ, 1976, 50 с.

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к инверсионному вольт-амперометрическому способу определения водорастворимого витамина B₂, участвующего в окислительно-восстановительных реакциях в живом организме. Поставленная задача достигается тем, что витамин B₂ электрохимически концентрируется на поверхности графитового электрода с последующей регистрацией анодных вольт-амперных кривых, а также тем, что витамин B₂ концентрируют на стеклоуглеродном (или пирографитовом) электроде в течение 60-120 сек при потенциалах электролиза (-0,5)-(-0,6) B на фонах 0,05 М калия фталевокислого кислого или в растворе 0,2 М KCl в присутствии соляной или серной кислоты, или HClO₄ pH 2-4 с последующей регистрацией анодных пиков в режиме дробного дифференцирования при скорости развертки потенциала 10-20 мВ/сек, а концентрацию витамина B₂ определяют по высоте анодного пика в интервале потенциалов от -0,18 до -0,30 B относительно хлорсеребряного электрода. 2 табл.

Инверсионно-вольтамперометрический способ определения витамина В₂, включающий электрохимическое концентрирование вещества на поверхности электрода с последующей регистрацией анодных пиков, отличающийся тем, что электрохимическое концентрирование витамина В₂ ведут на стеклоуглеродном или пирографитовом электроде при потенциалах -0,5 -0,6 В в течение 60 120 с в растворе калия фталевокислого кислого концентрацией 0,05 М или в растворе хлорида калия концентрацией 0,2 М в присутствии соляной кислоты, или серной кислоты, или хлорной кислоты с рН 2 4, регистрацию анодных пиков ведут в режиме дробного дифференцирования при скорости развертки потенциала 10 20 мВ/с и концентрацию витамина В₂ определяют по высоте анодного пика в интервале потенциалов -0,18 -0,30 В относительно хлорсеребряного электрода.