Способ определения устойчивости зерна кукурузы к фузариозу Советский патент 1992 года по МПК A01H1/04 

1

(21)4887345/13 (22) 08.08.90 (46)30.12.92. Бюл. № 48 (71) Днепропетровский государственный университет им. 300-летия воссоединения Украины с Россией

(72)Н.И.Штеменко,А.Н.Винниченко, Л.Ф.За- моруева, В.В.Глушко, А.А.Маршацкий и И.А.Лексикова

(56) Флоря М.В. Повысить невосприимчивость высоколизиновой кукурузы к фузари- озу.// Защита растений, 1983, № 10.

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ ЗЕРНА КУКУРУЗЫ К ФУЗАРИОЗУ (57) Использование: биотехнология, сельское хозяйство, фитопатология. Сущность изобретения: устойчивость зерна кукурузы к фузариозу определяют по величине поглощения свободных аминокислот, окрашенных нингидриновым красителем, при этом данный показатель устойчивых форм ниже такового у неустойчивых в 1,7-7,7 раза. 2 табл,

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к определению потенциальной устойчивости к неблагоприятным факторам растений кукурузы в селекционном процессе.

Известны способы определения устойчивости зерна к инфекционным заболеваниям, заключающиеся в заражении растений возбудителями болезней выдерживании их в оптимальном для развития патогенов режиме и дальнейшем определении повреждаемости растений, на основании чего судят об устойчивости Сорта к данному патогену. Выполнение этих способов требует проведения полевого эксперимента или работ с культурой ткани растения.

Известны биохимические способы определения устойчивости семян к вредным организмам, основанные, например, на измерении содержания хлорофила а и суммы каротиноидов в 9-дневных проростках семян сахарной свеклы; на оценке электро- форетического спектра компонента перок- сидаз в семенах вики, на исследовании аминокислотного состава семян. К недостаткам вышеупомянутых способов следует отнести их длительность и трудоемкость.

Наиболее близким по сущности и достигаемому эффекту является способ отбора устойчивых форм кукурузы в условиях искусственного заражения. Способ заключается в инъекции початков в период их массового цветения суспензией конидий патогенов. Через 20 дней проводится учет пораженных початков по степени развития заболевания, затем по разработанной шкале и по общепринятым в фитопатологии формулам опре- деляют устойчивые и неустойчивые к заболеваниям формы кукурузы.

Длительная и трудоемкая методика позволяет провести анализ в течение 20 сут, требует проведения полевого эксперимента, работы с токсичными средами, что затрудняет использование способа в селекционной практике.

Целью изобретения является упрощение и ускорение способа.

Поставленная цель достигается способом, который осуществляется следующим образом.

СО

С

VJ 00

ь

Ј о

Проводят экстракцию свободных аминокислот 70%-ным водным спиртом из неразмолотого зерна, к экстракту добавляют нингидриновый раствор, нагревают, охлаждают, измеряют поглощение раствора в об- ластях 400, 570 нм. Расчитывают оптическую плотность на 1 мл раствора на 1 г навески зерен. Полученные величины сравнивают с таковыми для форм кукурузы, контрастных по устойчивости, обычно различающихся в 2-10 раз. Устойчивые формы имеют значения более низкие, чем неустойчивые.

В качестве иллюстрации способа приведены данные по поглощению форм кукурузы устойчивых и неустойчивых к фузариозу (табл.1). 70% водный спирт используется для экстракции свободных аминокислот из растительных объектов. Нингидриновый раствор готовили по известной процедуре, при этом добавляется избыток этого реактива. Время экстракции и количество добавляемого экстрагента обосновано экспериментально (табл.2). Величина поглощения, рассчитанная для определенного образца в данных областях уф-спектра, является маркерным признаком для определенной формы кукурузы и обратно коррелирует с устойчивостью к фузариозу.

Неустойчивые к фузариозу формы имеют измененный жирнокислотный состав оболочки, что, как показано в зтом способе, обуславливает большую проницаемость свободных аминокислот из эндосперма.

Группа образцов кукурузы 1-6 и 15-20 относятся соответственно к обычным и переведенным на основу опейк-2 формам кукурузы, которые описаны как устойчивые и неустойчивые формы к фузариозу початков. Образцы 7-14, 21-28 получены в процессе селекционной работы во ВНИИ Кукурузы г.Днепропетровска. 7-14 характеризуются повышенной устойчивостью к данному патогену (заболеваемость 0-25%), а для образцов 21-28 характерна заболеваемость более 80%, что установлено экспериментальными данными трехгодичного полевого эксперимента.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что способ позволяет выявить формы кукурузы обладающие повышенной (пониженной) устойчивостью к фузариозу початков.

Пример. В стеклянные пробирки помещаем по 5 зерен, предварительно взвешенных, (одновременно тестировать можно 19 образцов + контроль) заливает 2 мл 70% этанола. Контрольный опыт проводим без зерна. Помещаем-пробирки в сосуд с кипящей водой на 10 мин, охлаждаем.

Сливаем экстракт в заранее приготовленные пробирки, смывает небольшим количеством 70% этанола зерна еще раз и доводим объем экстракта до 1 мл. Добавляем по 1 мл

нингидринового раствора и нагреваем на кипящей водяной бане в течение 6 мин (время проведения полной реакции нингидрина с аминокислотами в капиллярном реакторе аминокислотного анализатора. Измеряют

0 поглощение окрашенного раствора в 0,1 см кювете при 400 и 570 нм на спектрофотометре Спекорд М-40 (возможно применение фо- тометров). Рассчитывают величину оптической плотности на 1 г навески зерна,

5 1 см кюветы, 1 мл экстракта. Результаты представлены в табл.1. Данные статистически достоверны. Ошибка измерения не более 5%.

Данные, приведенные в табл.2, свиде0 тельствуют о том, что уменьшение времени экстракции приводит к слабой различаемо- сти данных по устойчивой и неустойчивой форме вследствие недостаточной экстракции свободных аминокислот опыт 1). Уве5 личеиие времени нецелесообразно, т.к. соотношение величин сохраняется (опыты 2 и 3) по сравниваемым формам. Уменьшение количества растворителя (опыт 4) приводит к тому, что часть семян оказывается непок0 рытыми растворителем и не обеспечивает полной экстракции. Увеличение количества растворителя не приводит к значительным изменениям, поэтому не является целесообразным. Таким образом, время экстракции

5 10 мин, и количество растворителя - 2 мл являются оптимальными для достижения ожидаемого эффекта.

Отличительными особенностями способа являются анализ величин оптических

0 плотностей экстракта свободных аминокислот из целого зерна кукурузы и выявление устойчивых и неустойчивых форм кукурузы по этим величинам в областях поглощения окрашенных производных аминокислот.

5 По указанным отличительным признакам был проведен патентный поиск. Аналогичных решений не обнаружено, поэтому указанные признаки являются существенными.

0 Использование предлагаемого способа в сравнении с прототипом позволит упростить и ускорить проведение отбора путем исключения длительных и трудоемких операций, уменьшить количество анализируе5 мого селекционного материала.

Способ прост в техническом исполнении и позволит существенно повысить интенсивность селекционной диагностики для выявления устойчивых и неустойчивых образцов кукурузы к фузариозу початков.

Формула изобретения Способ определения устойчивости зерна кукурузы к фузариозу, включающий исследование показателя влияния патогена на оцениваемые растения и сравнение его с показателем контрольных растений, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения определения, в качестве

10Таблица1

Величины оптических плотностей экстрактов из зерна различных форм кукурузы

Таблица 2

Величины оптических плотностей водно-спиртовых экстрактов из 5 зерен устойчивой и неустойчивой формы кукурузы при различных условиях экстракции

исследуемого показателя измеряют величину поглощения окрашенных нингидриновых растворов свободных аминокислот, извлеченных из целого зерна, и к устойчивым относят формы, величина поглощения которых в 1,7-7,7 раз ниже, чем значение данного показателя у контрольных неустойчивых форм.