Изобретение относится к клеточной биологии и экспериментальной онкологии и может использоваться для разработки новых методов подавления опухолевого процесса как in vitro, так и in vivo.
Хорионический гонадотропин человека (ХГч), как признают многие исследователи [4], обусловливает нормальную пролиферацию и дифференцировку клеток в период эмбриогенеза. В связи с этим было предложено стимулировать эти процессы во многих патологически измененных органах. Так, до сих пор гормон с успехом применяли при лечении фиброзов и циррозов, при этом возрастала митотическая активность гепатоцитов и происходила резорбция соединительной ткани. Считается, что митотический сигнал в данном случае опосредован лимфоцитами. Достоверно известно, что ХГч способен подавлять стимулированную митогеном реакцию бласттрансформации лимфоцитов [5]. Кроме того, гормон способен вызывать миграцию полипотентных стволовых клеток костного мозга в центральные органы иммуногенеза и Т- и В-лимфоцитов в кровоток, но тормозить при этом антителообразование [4]. Замечено, что ХГч обнаруживается не только в сыворотке крови больных с хорионэпителиомой и пузырным заносом, но и с другими опухолями не трофобластического происхождения.
Установлено, что на клетках гемопоэтического ряда (в том числе и при гемобластозах) имеются специфические рецепторы к ХГч [1,5]. После воздействия гормона на такие опухоли последние подвергаются регрессу. Аналогичным ХГч действием обладает и синтетический полипептидный фрагмент β-субъединицы хорионического гонадотропина, состоящий из 18 аминокислотных остатков. В связи с этим рядом авторов было предложено использовать гормон для влияния на лейкозы и саркому Капоши. В отличие от цитостатиков, которые обладают первично повреждающим действием на геном не только опухолевых клеток, но и нормальных, ХГч действует на геном опухолевых клеток только опосредованно, подавляя пролиферацию и дифференцировку этих клеток, тем самым приводит к дезорганизации и дегенерации карциномы.
Культура Нер-2 не является лимфоцитарной, к тому же нет никаких указаний на то, что у карциномы гортани и сходных с ней унифицированных раков длительных сроков культивирования могут быть специфические рецепторы к ХГч. Однако замечено, что даже у опухолей, изначально чувствительных к гормональным воздействиям по неизвестным причинам через несколько пассажей, последняя может резко снижаться. Так, спонтанный рак молочной железы крыс РМК-1, бывший в первых генерациях очень чувствительным к синестролу (95% торможения роста), овариэктомии (60% торможения) и тиофосфамиду (98% торможения), к 10-й генерации полностью утерял эти свойства (13% торможения роста при лечении синестролом и стимуляция роста под влиянием овариэктомии) [6]. Также в условиях монослойной культуры клетки простаты утрачивали способность реагировать на тестостерон. Более того, в культуре клеточные линии могут резко понижать степень дифференцировки. Есть данные о том, что лейкозы в культуре спонтанно приобретали фибробластоподобные черты, причем такое превращение сопровождалось значительным обеднением ультраструктуры клеток: уменьшалось число митохондрий, свободных рибосом, в таких клетках были гораздо слабее выражены гранулярный ретикулум и аппарат Гольджи. И тем не менее, при заражении животных такие клетки давали опухолевый процесс. Некоторые авторы называют эти процессы унификацией. Можно предположить, что Нер-2 в этом отношении является той культурой, которая через 60 лет от начала культивирования сохранила наименее специфические механизмы рецепции митотического сигнала. А это значит, что механизм рецепции митотического сигнала и подавление митотической активности у унифицированных опухолей, таких как Нер-2, будет являться наиболее общим, в связи с чем можно экстраполировать его и на другие раки. К тому же, в условиях культуры клеток исключается воздействие данного гормона на опухоль со стороны иммунологически активных лимфоцитов, что показано в экспериментах И.М. Солопаевой на лимфосаркоме Плисса in vivo [8]. До настоящего времени действие препарата ХГч на культуру Нер-2 неизвестно.
Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала препаратов, способных подавлять пролиферативную активность и вызывать дезорганизацию и патологические изменения в опухолях типа Нер-2.
Эксперименты выполнены на культуре карциномы гортани Нер-2. Культивирование велось по общепринятым методам работы с монослойными культурами. Клетки поддерживались на пластиковых флаконах 25 см2, 50 мл («Orange Scientific», Бельгия) в смеси из 95% питательной среды Игла MEM и 5% сыворотки эмбрионов коровы производства ООО «Биолот». В культуры добавляли пенициллин в дозе 50 ЕД/мл и стрептомицин в дозе 100 мкг/мл. Для контроля чистоты работ проводили периодические пассажи без антибиотиков. Все манипуляции с культурой и средами выполняли в строго стерильных условиях в операционной под защитой ламинарбокса с горизонтальным потоком воздуха; пересевы выполняли в утренние часы. Для посева новой генерации монослой обрабатывали версеном по щадящему методу, клетки легким встряхиванием переводили во взвесь в небольшое мерное количество свежей теплой (37°C) среды. После подсчета в камере Горяева суспензию разводили до концентрации 50000 клеток в миллилитре, и после добавления определенного количества сыворотки и антибиотиков засевали в новые флаконы, а для цитологического исследования - на половинки покровных стекол, помещенные в пенициллиновые флаконы. Для этого в каждый флакон с помещенной в него половинкой покровного стекла вносили 1 мл клеточной взвеси. В этот же момент ампулу с ХГч разводили оффицинальным физиологическим раствором. В опытные флаконы микропипеткой вносили 50 мкл гормона (50 МЕ/мл смеси), а в контрольные флаконы вносили такое же количество физиологического раствора, но без гормона.
Для цитологического исследования ровно через 24 и 48 часов контрольные и опытные препараты фиксировали в жидкости Карнуа 10 минут, а затем окрашивали железным гематоксилином Вейгарта и эозином с последующим заключением в глицерин-желатиновую смесь. Для достоверности изучались препараты из разных серий поставленного эксперимента. При этом участки монослоя изучались при помощи светового микроскопа «Микмед-2» (увеличение 15×40). Не мене чем на 6000 клеток подсчитывали число митозов с обязательным выделением патологических форм, а также количество поликариоциотов. Отмечались изменения клеточного пласта, формы клеток. В случае необходимости участок рассматривали более детально под увеличением 15×100 с использованием масляной иммерсии.
Примеры.
Пример 1.
20 октября 2006 года был произведен очередной пересев культуры на покровные стекла. Через 24 часа стекло с клетками фиксировали в жидкости Карнуа, а потом окрашивали железным гематоксилином Вейгарта и эозином. Препарат заключали в глицерин-желатиновую смесь. Исследовано 6280 клеток, причем митотически делящихся всего 160 (25,47‰), из них патологических форм 31 (4,9‰). Количество поликариоцитов составило 106 (16,87‰). Доля патологических митозов в препарате - 19,37%.
Пример 2.
15 октября 2006 г.был произведен пересев культуры на покровные стекла. В ряд тест-флаконов внесено по 50 ME гормона. Через 48 часов стекло с клетками фиксировали в жидкости Карнуа, а потом окрашивали железным гематоксилином Вейгарта и эозином. Препарат заключали в глицерин-желатиновую смесь. Исследована 6351 клетка, причем митотически делящихся было 253 (39,8‰), из них патологических форм 86 (13,5‰). Количество поликариоцитов составило 162 (25,5‰). Доля патологических митозов в препарате - 33,99%.
Результаты исследований приведены в таблицах 1 и 2. Как видно из таблиц, митотическая активность контрольных культур (фиг.1) с течением времени возрастает от 27,29±1,36‰ до 45,55±1,34‰. Число патологических митозов в них также держится в пределах среднестатистической для этой культуры нормы [2]. Такой показатель, как симпластообразование, для оценки жизнеспособности опухолевой культуры в литературе встречается редко. Похожие данные отмечены для цитопатического действия различных штаммов вируса полиомиелита [2]. Наличие таких постклеточных структур, существенно отличных по морфологии от исходной линии, в данном случае можно считать признаками дезорганизации клеточной культуры.
Культуры после воздействия хорионического гонадотропина имеют характерный вид: помимо возрастания количества поликариоцитов (фиг.2), которые ряд авторов расценивают как одну из патологических форм клеточного деления [2], изменения митотического индекса, распадаются клеточные комплексы - «островки роста», что является похожим на слабые радиационные поражения [3]. Клетки округляются, но одновременно с этим у них появляются тонкие псевдоподии. Это бывает, когда клетка совершает перемещение по поверхности.
Показатели митотической активности клеток культуры через 24 часа после введения хорионического гонадотропина человека
Показатели митотической активности клеток культуры через 48 часов после введения хорионического гонадотропина человека
Наряду с этим возрастает доля патологических митозов на 45 - 65% от исходного уровня. Митотический индекс при этом снижается в рамках от 9% до 17%.
Причины таких изменений еще не до конца определены. Будучи гормоном, определяющим нормальную пролиферацию и дифференцировку клеток в эмбриогенезе, ХГч ответственен за эти же процессы и во взрослом организме. Отсутствие у клеточной культуры Нер-2 специфических рецепторов, характерных только для гонадотропинов, еще не является преградой для проявления таких эффектов. Так, по данным Peter Petrusz, Madhabananda et al., [7], при помощи авторадиографических и гистохимических методов ХГч удалось обнаружить «...в желтом теле яичников, в интерстициальных клетках, в некоторых развивающихся фолликулах, а также в стенке (преимущественно в гладкомышечных клетках) мелких артериол стромы яичников...». Кроме того, по данным этих же авторов, гормон способен проникать через клеточную стенку не только в цитоплазму, но и в ядро.
Следовательно, помимо доказанного ранее лимфоцитарно-опосредованного действия на опухоль гормон способен оказывать действие на процессы экспрессии некоторых генов, определяющих в том числе дифференцировку и пролиферацию клеток. Такое воздействие возможно через активацию системы антионкогенов, которые способны привести клетку к апоптозу или же затормозить митотический процесс через его нарушение, создав различные летальные формы клеточного деления, что и показано в данном техническом решении.
Литература
1. Биологическое действие хорионического гонадотропина и его синтетического пептидного фрагмента на клеточную линию HL-60./ Валуйских А.Н., Ромашкова Ю.А., Данилкович А.В., Фрезе К.В., Макаров Е.В., Сухих Г.Т. // Бюл. эксп. Биол. и мед., - 1997, №4.
2. Блюмкин В.Н., Жданов В.М. Влияние вирусов на хромосомный аппарат и деление клеток. М.: Медицина, 1973 - 266 с.
3. Влияние γ-облучения в различных режимах на образование клеточных комплексов в популяции клеток культуры HeLa. / Г.А. Бажутова, Г.С. Календо, А. С. Ягубов и др. // Бюл. эксп. Биол. и мед., - 1997, №4.
4. Солопаева И.М. Хорионический гонадотропин в биологии и медицине. - Н.Новгород: Изд.-во ННГУ, 2000. - 191 с.
5. Синтетический пептид - фрагмент бета-субъединицы хорионического гонадотропина угнетает митогенстимулированную пролиферацию лимфоцитов человека in vitro. / Валуйских А.Н., Ромашкова Ю.А., Данилкович А.В., Фрезе К.В., Сухих Г.Т., Макаров Е.В. // Бюл. эксп. Биол. и мед., - 1997, №3.
6. Химиотерапия злокачественных опухолей. А.К.Белоусова, Н.Н.Блохин, В.И.Борисов и др. / Под ред. Н.Н.Блохина. М.:Медицина, 1977, с.320, ил.
7. Рецепторы клеточных мембран для лекарств и гормонов: междисциплинарный подход: Пер. с англ./ Под ред. Р.У. Штрауба, Л. Болисс.- М.: Медицина, 1983, - 368 с., ил.
8. Солопаева И.М. (RU); Новиков В.В. (RU); Иванова Н.Л. (RU); Аксенова Т.В. (RU) Средство для торможения митотической активности клеток лимфосаркомы Плисса.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
СРЕДСТВО ДЛЯ ТОРМОЖЕНИЯ МИТОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК ЛИМФОСАРКОМЫ ПЛИССА | 2004 |
|
RU2263514C1 |
Способ получения аутологичных регуляторных Т-лимфоцитов путем культивирования ex vivo в присутствии хорионического гонадотропина | 2022 |
|
RU2791738C1 |
СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ РЕГЕНЕРАЦИИ ПЕЧЕНОЧНОЙ ТКАНИ | 1999 |
|
RU2185835C2 |
Средство, снижающее относительное содержание низкодифференцированных и повышающее относительное содержание высокодифференцированных клеток в инвазивной карциноме молочной железы неспецифического типа | 2019 |
|
RU2743710C1 |
СПОСОБ КОРРЕКЦИИ ПРОЦЕССОВ РЕГЕНЕРАЦИИ | 2007 |
|
RU2350340C1 |
СРЕДСТВО ДЛЯ НОРМАЛИЗАЦИИ КОЛИЧЕСТВА CD4 Т-ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ЛИМФОСАРКОМЕ ПЛИССА | 2006 |
|
RU2316338C1 |
СРЕДСТВО ТОРМОЖЕНИЯ РОСТА ЛИМФОСАРКОМЫ ПЛИССА | 2004 |
|
RU2263513C1 |
Композиция для повышения содержания высокодифференцированных клеток в аденокарциноме молочной железы | 2018 |
|
RU2697199C1 |
СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ РЕГЕНЕРАЦИИ ПЕЧЕНОЧНОЙ ТКАНИ | 1997 |
|
RU2134582C1 |
Композиция для предотвращения химиорезистентности к антимитотическим препаратам | 2022 |
|
RU2807691C1 |
Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к области клеточной биологии и экспериментальной онкологии, и может использоваться для разработки новых методов подавления опухолевого процесса. Хорионический гонадотропин человека (ХГч) используют для стимуляции патологических процессов и дезорганизации культуры клеток карциномы гортани Нер-2. Изобретение позволяет воздействовать на опухолевые линии типа Нер-2, исключая лимфоцитарное опосредование, а также воздействия гормона через специфические рецепторы и при этом получать признаки дегенерации опухоли в условиях культуры клеток. 2 ил., 2 табл.
Способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в культуре клеток карциномы гортани Нер-2, предусматривающий использование хорионического гонадотропина человека.
СРЕДСТВО ДЛЯ ТОРМОЖЕНИЯ МИТОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК ЛИМФОСАРКОМЫ ПЛИССА | 2004 |
|
RU2263514C1 |
ВИННИЦКИЙ В | |||
И др | |||
Антиметастатический эффект иммунизации хорионическим гонадотропином и плацентарными факторами в эксперименте: Тез | |||
Докл | |||
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов | 1917 |
|
SU2A1 |
- Киев, 23-26 мая 2000, Эксперим | |||
Онкол., 2000, п.22, Suppl., c.65 | |||
RUSSO I | |||
et al | |||
Hormonal approach to breast cancer prevention, J | |||
Cell | |||
Biochem., 2000, Suppl.34, c.l-6. |
Авторы
Даты
2009-03-20—Публикация
2007-05-17—Подача