СПОСОБ МОДУЛЯЦИИ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ И ДЕЗОРГАНИЗАЦИИ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК КАРЦИНОМЫ ГОРТАНИ Hep-2 Российский патент 2009 года по МПК C07K14/59 A61K38/24 A61P35/00 

Изобретение относится к клеточной биологии и экспериментальной онкологии и может использоваться для разработки новых методов подавления опухолевого процесса как in vitro, так и in vivo.

Хорионический гонадотропин человека (ХГч), как признают многие исследователи [4], обусловливает нормальную пролиферацию и дифференцировку клеток в период эмбриогенеза. В связи с этим было предложено стимулировать эти процессы во многих патологически измененных органах. Так, до сих пор гормон с успехом применяли при лечении фиброзов и циррозов, при этом возрастала митотическая активность гепатоцитов и происходила резорбция соединительной ткани. Считается, что митотический сигнал в данном случае опосредован лимфоцитами. Достоверно известно, что ХГч способен подавлять стимулированную митогеном реакцию бласттрансформации лимфоцитов [5]. Кроме того, гормон способен вызывать миграцию полипотентных стволовых клеток костного мозга в центральные органы иммуногенеза и Т- и В-лимфоцитов в кровоток, но тормозить при этом антителообразование [4]. Замечено, что ХГч обнаруживается не только в сыворотке крови больных с хорионэпителиомой и пузырным заносом, но и с другими опухолями не трофобластического происхождения.

Установлено, что на клетках гемопоэтического ряда (в том числе и при гемобластозах) имеются специфические рецепторы к ХГч [1,5]. После воздействия гормона на такие опухоли последние подвергаются регрессу. Аналогичным ХГч действием обладает и синтетический полипептидный фрагмент β-субъединицы хорионического гонадотропина, состоящий из 18 аминокислотных остатков. В связи с этим рядом авторов было предложено использовать гормон для влияния на лейкозы и саркому Капоши. В отличие от цитостатиков, которые обладают первично повреждающим действием на геном не только опухолевых клеток, но и нормальных, ХГч действует на геном опухолевых клеток только опосредованно, подавляя пролиферацию и дифференцировку этих клеток, тем самым приводит к дезорганизации и дегенерации карциномы.

Культура Нер-2 не является лимфоцитарной, к тому же нет никаких указаний на то, что у карциномы гортани и сходных с ней унифицированных раков длительных сроков культивирования могут быть специфические рецепторы к ХГч. Однако замечено, что даже у опухолей, изначально чувствительных к гормональным воздействиям по неизвестным причинам через несколько пассажей, последняя может резко снижаться. Так, спонтанный рак молочной железы крыс РМК-1, бывший в первых генерациях очень чувствительным к синестролу (95% торможения роста), овариэктомии (60% торможения) и тиофосфамиду (98% торможения), к 10-й генерации полностью утерял эти свойства (13% торможения роста при лечении синестролом и стимуляция роста под влиянием овариэктомии) [6]. Также в условиях монослойной культуры клетки простаты утрачивали способность реагировать на тестостерон. Более того, в культуре клеточные линии могут резко понижать степень дифференцировки. Есть данные о том, что лейкозы в культуре спонтанно приобретали фибробластоподобные черты, причем такое превращение сопровождалось значительным обеднением ультраструктуры клеток: уменьшалось число митохондрий, свободных рибосом, в таких клетках были гораздо слабее выражены гранулярный ретикулум и аппарат Гольджи. И тем не менее, при заражении животных такие клетки давали опухолевый процесс. Некоторые авторы называют эти процессы унификацией. Можно предположить, что Нер-2 в этом отношении является той культурой, которая через 60 лет от начала культивирования сохранила наименее специфические механизмы рецепции митотического сигнала. А это значит, что механизм рецепции митотического сигнала и подавление митотической активности у унифицированных опухолей, таких как Нер-2, будет являться наиболее общим, в связи с чем можно экстраполировать его и на другие раки. К тому же, в условиях культуры клеток исключается воздействие данного гормона на опухоль со стороны иммунологически активных лимфоцитов, что показано в экспериментах И.М. Солопаевой на лимфосаркоме Плисса in vivo [8]. До настоящего времени действие препарата ХГч на культуру Нер-2 неизвестно.

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала препаратов, способных подавлять пролиферативную активность и вызывать дезорганизацию и патологические изменения в опухолях типа Нер-2.

Эксперименты выполнены на культуре карциномы гортани Нер-2. Культивирование велось по общепринятым методам работы с монослойными культурами. Клетки поддерживались на пластиковых флаконах 25 см², 50 мл («Orange Scientific», Бельгия) в смеси из 95% питательной среды Игла MEM и 5% сыворотки эмбрионов коровы производства ООО «Биолот». В культуры добавляли пенициллин в дозе 50 ЕД/мл и стрептомицин в дозе 100 мкг/мл. Для контроля чистоты работ проводили периодические пассажи без антибиотиков. Все манипуляции с культурой и средами выполняли в строго стерильных условиях в операционной под защитой ламинарбокса с горизонтальным потоком воздуха; пересевы выполняли в утренние часы. Для посева новой генерации монослой обрабатывали версеном по щадящему методу, клетки легким встряхиванием переводили во взвесь в небольшое мерное количество свежей теплой (37°C) среды. После подсчета в камере Горяева суспензию разводили до концентрации 50000 клеток в миллилитре, и после добавления определенного количества сыворотки и антибиотиков засевали в новые флаконы, а для цитологического исследования - на половинки покровных стекол, помещенные в пенициллиновые флаконы. Для этого в каждый флакон с помещенной в него половинкой покровного стекла вносили 1 мл клеточной взвеси. В этот же момент ампулу с ХГч разводили оффицинальным физиологическим раствором. В опытные флаконы микропипеткой вносили 50 мкл гормона (50 МЕ/мл смеси), а в контрольные флаконы вносили такое же количество физиологического раствора, но без гормона.

Для цитологического исследования ровно через 24 и 48 часов контрольные и опытные препараты фиксировали в жидкости Карнуа 10 минут, а затем окрашивали железным гематоксилином Вейгарта и эозином с последующим заключением в глицерин-желатиновую смесь. Для достоверности изучались препараты из разных серий поставленного эксперимента. При этом участки монослоя изучались при помощи светового микроскопа «Микмед-2» (увеличение 15×40). Не мене чем на 6000 клеток подсчитывали число митозов с обязательным выделением патологических форм, а также количество поликариоциотов. Отмечались изменения клеточного пласта, формы клеток. В случае необходимости участок рассматривали более детально под увеличением 15×100 с использованием масляной иммерсии.

Примеры.

Пример 1.

20 октября 2006 года был произведен очередной пересев культуры на покровные стекла. Через 24 часа стекло с клетками фиксировали в жидкости Карнуа, а потом окрашивали железным гематоксилином Вейгарта и эозином. Препарат заключали в глицерин-желатиновую смесь. Исследовано 6280 клеток, причем митотически делящихся всего 160 (25,47‰), из них патологических форм 31 (4,9‰). Количество поликариоцитов составило 106 (16,87‰). Доля патологических митозов в препарате - 19,37%.

Пример 2.

15 октября 2006 г.был произведен пересев культуры на покровные стекла. В ряд тест-флаконов внесено по 50 ME гормона. Через 48 часов стекло с клетками фиксировали в жидкости Карнуа, а потом окрашивали железным гематоксилином Вейгарта и эозином. Препарат заключали в глицерин-желатиновую смесь. Исследована 6351 клетка, причем митотически делящихся было 253 (39,8‰), из них патологических форм 86 (13,5‰). Количество поликариоцитов составило 162 (25,5‰). Доля патологических митозов в препарате - 33,99%.

Результаты исследований приведены в таблицах 1 и 2. Как видно из таблиц, митотическая активность контрольных культур (фиг.1) с течением времени возрастает от 27,29±1,36‰ до 45,55±1,34‰. Число патологических митозов в них также держится в пределах среднестатистической для этой культуры нормы [2]. Такой показатель, как симпластообразование, для оценки жизнеспособности опухолевой культуры в литературе встречается редко. Похожие данные отмечены для цитопатического действия различных штаммов вируса полиомиелита [2]. Наличие таких постклеточных структур, существенно отличных по морфологии от исходной линии, в данном случае можно считать признаками дезорганизации клеточной культуры.

Культуры после воздействия хорионического гонадотропина имеют характерный вид: помимо возрастания количества поликариоцитов (фиг.2), которые ряд авторов расценивают как одну из патологических форм клеточного деления [2], изменения митотического индекса, распадаются клеточные комплексы - «островки роста», что является похожим на слабые радиационные поражения [3]. Клетки округляются, но одновременно с этим у них появляются тонкие псевдоподии. Это бывает, когда клетка совершает перемещение по поверхности.

Таблица 1
Показатели митотической активности клеток культуры через 24 часа после введения хорионического гонадотропина человекаПоказателиКонтроль, М±mОпыт, М±mПроцент отличийДостоверностьМитотический индекс27,29±1,36‰24,67±1,83‰9,6>0,05Нормальные митозы20,65±0,58‰16,1±0,93‰22,0≤0,003Патологические митозы6,54±1,02‰8,55±2,363‰23,5>0,05Процент патологических митозов23,6±5,317%34,27±4,509%45,2<0,01Поликариоциты16,2±0,315‰26,53±1,69‰63,8<0,001Таблица 2
Показатели митотической активности клеток культуры через 48 часов после введения хорионического гонадотропина человекаПоказателиКонтроль, М±mОпыт, М±mПроцент отличийДостоверностьМитотический индекс45,55±1,34‰37,72±1,08‰17,2<0,01Нормальные митозы35,91±1,12‰24,55±1,0‰31,6<0,01Патологические митозы9,63±0,36‰13,17±0,82‰36,7<0,05Процент патологических митозов21.01±0,84%34,92±1,93%65,9<0,05Поликариоциты14,19±1,61‰25,4±1,88‰79,0<0,01

Наряду с этим возрастает доля патологических митозов на 45 - 65% от исходного уровня. Митотический индекс при этом снижается в рамках от 9% до 17%.

Причины таких изменений еще не до конца определены. Будучи гормоном, определяющим нормальную пролиферацию и дифференцировку клеток в эмбриогенезе, ХГч ответственен за эти же процессы и во взрослом организме. Отсутствие у клеточной культуры Нер-2 специфических рецепторов, характерных только для гонадотропинов, еще не является преградой для проявления таких эффектов. Так, по данным Peter Petrusz, Madhabananda et al., [7], при помощи авторадиографических и гистохимических методов ХГч удалось обнаружить «...в желтом теле яичников, в интерстициальных клетках, в некоторых развивающихся фолликулах, а также в стенке (преимущественно в гладкомышечных клетках) мелких артериол стромы яичников...». Кроме того, по данным этих же авторов, гормон способен проникать через клеточную стенку не только в цитоплазму, но и в ядро.

Следовательно, помимо доказанного ранее лимфоцитарно-опосредованного действия на опухоль гормон способен оказывать действие на процессы экспрессии некоторых генов, определяющих в том числе дифференцировку и пролиферацию клеток. Такое воздействие возможно через активацию системы антионкогенов, которые способны привести клетку к апоптозу или же затормозить митотический процесс через его нарушение, создав различные летальные формы клеточного деления, что и показано в данном техническом решении.

Литература

1. Биологическое действие хорионического гонадотропина и его синтетического пептидного фрагмента на клеточную линию HL-60./ Валуйских А.Н., Ромашкова Ю.А., Данилкович А.В., Фрезе К.В., Макаров Е.В., Сухих Г.Т. // Бюл. эксп. Биол. и мед., - 1997, №4.

2. Блюмкин В.Н., Жданов В.М. Влияние вирусов на хромосомный аппарат и деление клеток. М.: Медицина, 1973 - 266 с.

3. Влияние γ-облучения в различных режимах на образование клеточных комплексов в популяции клеток культуры HeLa. / Г.А. Бажутова, Г.С. Календо, А. С. Ягубов и др. // Бюл. эксп. Биол. и мед., - 1997, №4.

4. Солопаева И.М. Хорионический гонадотропин в биологии и медицине. - Н.Новгород: Изд.-во ННГУ, 2000. - 191 с.

5. Синтетический пептид - фрагмент бета-субъединицы хорионического гонадотропина угнетает митогенстимулированную пролиферацию лимфоцитов человека in vitro. / Валуйских А.Н., Ромашкова Ю.А., Данилкович А.В., Фрезе К.В., Сухих Г.Т., Макаров Е.В. // Бюл. эксп. Биол. и мед., - 1997, №3.

6. Химиотерапия злокачественных опухолей. А.К.Белоусова, Н.Н.Блохин, В.И.Борисов и др. / Под ред. Н.Н.Блохина. М.:Медицина, 1977, с.320, ил.

7. Рецепторы клеточных мембран для лекарств и гормонов: междисциплинарный подход: Пер. с англ./ Под ред. Р.У. Штрауба, Л. Болисс.- М.: Медицина, 1983, - 368 с., ил.

8. Солопаева И.М. (RU); Новиков В.В. (RU); Иванова Н.Л. (RU); Аксенова Т.В. (RU) Средство для торможения митотической активности клеток лимфосаркомы Плисса.

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к области клеточной биологии и экспериментальной онкологии, и может использоваться для разработки новых методов подавления опухолевого процесса. Хорионический гонадотропин человека (ХГч) используют для стимуляции патологических процессов и дезорганизации культуры клеток карциномы гортани Нер-2. Изобретение позволяет воздействовать на опухолевые линии типа Нер-2, исключая лимфоцитарное опосредование, а также воздействия гормона через специфические рецепторы и при этом получать признаки дегенерации опухоли в условиях культуры клеток. 2 ил., 2 табл.

Способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в культуре клеток карциномы гортани Нер-2, предусматривающий использование хорионического гонадотропина человека.