СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ РЕГЕНЕРАЦИИ ПЕЧЕНОЧНОЙ ТКАНИ Российский патент 2002 года по МПК A61K35/55 A61P1/16 

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине, гепатологии и может быть применено для стимуляции регенерации патологически измененной печени.

Известно большое количество биологически активных веществ, способных стимулировать пролиферацию гепатоцитов: аминокислоты, гидролизаты, пуриновые и пиримидиновые производные, витамины, гормоны [1]. Реализация стимулирующего эффекта различных биологически активных веществ может осуществляться за счет метаболитов, образующихся при изменении или нарушении обменных процессов в печени под влиянием тех иди иных веществ или за счет усиления активности генов, ответственных за белковый обмен, что, наряду со стимуляцией белкового синтеза, способствует усилению пролиферации клеток печени.

За прототип предлагаемого изобретения выбран способ стимуляции регенерации печеночной ткани, включающий воздействие на нее гормонсодержащего вещества - экстракта вытяжки коры надпочечников (свиных или фетальных) [8]. Способ по прототипу осуществляют следующим образом. Четырем белым беспородным крысам вводили после резекции 30% ткани печени экстракт вытяжки коры свиных надпочечников в дозе 0,5 мл в количестве двух инъекций: первую инъекцию проводили в день операции - резекции 30% ткани печени, вторую - через 24 часа после резекции 30% ткани печени.

Поскольку известный способ стимуляции регенерации печеночной ткани производили на практически здоровой печени, испытавшей стресс после осуществления резекции 30% ткани печени, применение его для лечения патологически измененной печени оказалось недостаточно эффективным. Учитывая актуальность проблем, связанных с поиском эффективных лечебных средств воздействия на различные формы патологии печени, обладающих минимальным побочном действием, авторы продолжили исследования в этом направлении. Одной из серьезных патологий печени является гепатит. Использование широкого арсенала медикаментозных средств для коррекции широкого спектра имеющихся нарушений при хроническом гепатите часто приводит к полипрагмазии и токсическому действию на гепатоциты [3]. Экспериментально разработан и обоснован способ стимуляции регенерации патологически измененной печени с использованием хорионического гонадотропина человека [6]. Однако медикаментозное лечение хронических заболеваний печени синтетическими глюкокортикостероидами не всегда эффективно, дает только временный эффект и может быть ограничено в связи с возможностью побочных действий. Так применение хорионического гонадотропина противопоказано при воспалительных заболеваниях и опухолях половой сферы, преждевременном подовом развитии у детей, возможны аллергические реакции [2]. Все это значительно снижает эффективность их использования как стимуляторов регенерации печени. При длительном применении синтетических глюкокортикостероидов следует учитывать возможность угнетения коры надпочечников с подавлением биосинтеза гормонов, не исключена атрофия надпочечников.

Поэтому задачей предлагаемого изобретения является расширение арсенала средств лечебного воздействия на патологически измененную печень, в частности при гепатите.

Поставленная задача решается способом стимуляции регенерации печеночной ткани путем введения экспериментальным животным подкожно экстракта вытяжки коры свиных или фетальных надпочечников человека, в котором при коррекции смоделированного состояния токсического гепатита к экстракту вытяжки коры надпочечников добавляют витаминный комплекс, приготовленный на основе витаминов B₆, В₁₂ и РР, и вводят его ежедневно по 0,8 мл курсом 10 инъекций. При этом витаминный комплекс содержит 0,5 мг пиридоксина гидрохлорида, 2 мкг цианокобаламина, 5 мг РР на 1 мл экстракта вытяжки коры надпочечников. Объем инъекций и их количество устанавливались по результатам экспериментов с различными дозами вводимых лечебных препаратов. Оптимальными оказались дозы, приведенные выше. При объеме вводимых веществ меньше 0,5 мл и общем числе инъекций меньше 10 процесс регенерации протекает вяло, не эффективно. Более высокие концентрации не оказывают заметного влияния на скорость регенерации печеночной ткани, и потому применять их нецелесообразно.

В источниках информации подобного способа стимуляции регенерации печеночной ткани, патологически измененной воздействием тетрахлорметана, не обнаружено. Поэтому авторы полагают, что техническое решение является новым и соответствует критерию "изобретательский уровень".

Способ стимуляции регенерации пеленочной ткани, патологически измененной воздействием тетрахлорметана, осуществляли в эксперименте на 70 белых беспородных крысах.

Модель токсического гепатита создавали подкожным введением белым беспородным крысам масляного раствора тетрахлорметана в дозе 0,2 мл через день, всего 20 инъекций. В печени крыс, получавших тетрахлорметан, развиваются выраженные изменения паренхимы деструктивного характера: нарушение балочного строения, белковая дистрофия гепатоцитов, очаговые некрозы. Наряду с дистрофическими изменениями в паренхиме печени наблюдаются воспалительные процессы в строме органа в виде диффузной круглоклеточной инфильтрации. После прекращения инъекций тетрахлорметана, т.е. на высоте развития патологического процесса (токсического гепатита), все экспериментальные животные были разделены на 10 групп:
1 группа - животные с токсическим гепатитом, получавшие экстракт вытяжки коры свиных надпочечников в количестве 10 инъекций ежедневно по 0,5 мл каждая;
2 группа - животные с токсическим гепатитом, получавшие ежедневно гормоновитаминный комплекс, состоящий из экстракта вытяжки коры надпочечников и витаминного комплекса, приготовленного на основе качественного и количественного состава витаминов, входящих в препарат эссенциале - витаминов В₆, В₁₂ и РР по 0,5 мл в количестве 10 инъекций;
3 группа - животные с токсическим гепатитом, получавшие эссенциале по 0,5 мл в количества 10 инъекций;
4 группа - животные с токсическим гепатитом, получавшие экстракт вытяжки коры фетальных надпочечников по 0,5 мл в количестве 10 инъекций;
5 группа - животные с токсическим гепатитом, получавшие преднизолон в дозе 0,5 мл в количестве 10 инъекций;
6 группа - гепатитный контроль - животные с токсическим гепатитом, получившее 20 инъекций тетрахлорметана;
7 группа - гепатитный оперированный контроль - животные с токсическим гепатитом, подвергавшиеся резекции 30% ткани печени;
8 группа - животные с токсическим гепатитом, получавшие после резекции 30% ткани печени экстракт вытяжки коры свиных надпочечников в дозе 0,5 мл в количестве 10 инъекций;
9 группа - животные с токсическим гепатитом, получившие только две инъекции экстракта вытяжки коры свиных надпочечников в дозе 0,5 мл;
10 группа - интактный контроль - животные, не подвергавшиеся никаким воздействиям.

Средство для стимуляции регенерации печеночной ткани получали из замороженных в жидком азоте надпочечников свиней и новорожденных умерших детей. Отделяли корковую часть, измельчали при помощи волчка и подвергали экстрагированию эфиром. Полученный экстракт переводили в спирт, а затем в физиологический раствор. Из 3 г ткани коры надпочечников получали 1 мл экстракта. Технологическая схема производства экстракта вытяжки коры надпочечников описана в литературных источниках [4].

Животных всех экспериментальных групп забивали на 14 сутки после прекращения введения тетрахлорметана и последующего лечения. Кусочки печени, взятые при забое животных, фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, заливали в парафин. На гистологических срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, подсчитывали митотический индекс гепатоцитов (МИ), являющийся показателем пролиферативной активности клеток печени, количество двуядерных гепатоцитов. Результаты выражали в промиллях (%о). Для объективной оценки эффекта стимуляции регенерации патологически измененной печени при применении различных методов лечения (оперативного и консервативного), а также для более полного представления об эффективности биологического действия вводимых веществ на нормализацию структуры печени, кроме указанных выше параметров, наряду с визуальным описанием гистопрепаратов, в паренхиме печени определяли количественные показатели репаративных процессов. С этой целью подсчитывали количество нормальных и дистрофических гепатоцитов (НГ и ДГ) с последующим вычислением коэффициента нормализации паренхимы КИП=НГ/ДГ. Результаты выражали в условных единицах (у.е.) на тест-площадь гистопрепарата. Измерения проводили с помощью морфометрических сеток С.Б.Стефанова с использованием рекомендаций до количественной морфологии биоптатов органов пищеварения [5] . К дистрофическим гепатоцитам относили безъядерные клетки с разорванной плазмалеммой, а также клетки с ядрами в состоянии кариопикноза, кариорексиса и кариолизиса. Доверительный интервал колебания средней арифметической величины при р=0,05 определяли по формуле и таблицам Р.П.Стрелкова [7]. Цифровой материал обработан статистически по методу Стъюдента.

Анализ клеточного состава паренхимы патологически измененной печени у животных с токсическим гепатитом разных экспериментальных групп показал наиболее выраженную степень нормализации структуры печени у животных с токсическим гепатитом, получавших комплексную терапии, состоящую из экстрактов вытяжки коры свиных надпочечников с добавлением витаминного комплекса в количестве 10 инъекций ежедневно в утренние часы (2 группа) по сравнению со всеми другими экспериментальными группами животных (Р<0,01). Коэффициент нормализации паренхимы печени составлял у них 4,08±0,17 у.е. (у интактных - 4,11±0,06 у. е. ). Количество двуядерных гепатоцитов у животных данной экспериментальной группы составляло 57,33±5,32%о, т.е. почти в 3 раза превышало число двуядерных гепатоцитов у интактных животных - 20,33±0,34%о (Р<0,001). Также достаточно высоким было количество двуядерных гепатоцитов у животных, получавших экстракт вытяжки коры фетальных надпочечников - 29,83±8,16%о, однако такой эффект наблюдался не у всех животных данной экспериментальной группы. Следует отметить, что у животных этих двух групп - 2-ой и 4-ой в печени встречались митотически делящиеся гепатоциты, правда в незначительном количестве - МИ составлял соответственно 1,0±0,11%о и 0,75±0,23%о. Наибольшее число митозов наблюдалось у животных, получавших эссенциале (3-я группа), у них МИ=3,62±0,59%о (Р<0,05). В меньшей степени процесс нормализации паренхимы патологически измененной печени виражей у животных, получавших экстракты вытяжек коры свиных и фетальных надпочечников (1-я и 4-я группы), а также - эссенциале (3-я группа) - см. таблицу.

Гистологическое изучение препаратов печени выявило у животных вышеуказанных экспериментальных групп (1-я, 3-я, 4-я) нормальное балочное строение печени, лишь местами отмечалось расширение синусоидов, незначительная круглоклеточная инфильтрация. У животных с токсическим гепатитом, получавших преднизолон (5-я группа) а также подвергавшихся резекции 30% ткани печени (7-я группа), структуры органа в данный срок исследования практически не наблюдалось, правда, у оперированных животных отмечалось большое количество двуядерных гепатоцитов - 28,50±0,25%о, что говорит о некотором стимулирующем эффекте резекции ткани печени на репаративные процессы, в то время как у животных, получавших преднизолон (5-я группа), число дистрофических гепатоцитов даже несколько возросло по сравнению с гепатитным контролем - с 4,90±0,09 до 6,97±0,29 у. е., митозов нет, а число двуядерных гепатоцитов всего лишь 6,50±0,54%о, что говорит о низкой пролиферативной активности клеток печени в условиях патологии. Резко нарушена архитектоника печени, белковая дистрофия гепатоцитов разной степени выраженности: от эозинофильной дегенерации до гидропического перерождения отдельных гепатоцитов: много безъядерных, с разрушенной плазмалеммой, КНП= 1,38±0,05. Незначительная нормализация структуры печени у животных с токсическим гепатитом, получивших 2 инъекции экстракта вытяжки коры свиных надпочечников (9-я группа) - КНП= 1,52±0,02 у.е., что обусловлено недостаточным сроком лечения.

Таким образом, сравнительное изучение биологического действия различных веществ на модели регенерирующей патологически измененной печени выявило наибольший стимулирующий эффект на нормализацию структуры печени при введении животным с экспериментальным токсическим гепатитом экстрактов вытяжки коры свиных надпочечников с витаминным комплексом, что позволяет предложить данный способ для регенерационной терапии хронических заболеваний печени.

Источники информации
1. Влияние производных пурина на регенерацию и иммунологическую реактивность у животных (печень). Рябинина З.А., Кирпичников М.М., Суздальцев А. А. Дакина Н.Н. Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1978. - 10. - С. 465-467.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства // М.: Медицина, 1997. - Т. 2. - С. 28-30.

3. Подымова С.Д. Болезни печени. - М.: Медицина, 1998. - 544 с.

4. Розенцвейг П.Э., Сандер Ю.К. Технология лекарств и галеновых препаратов. Руководство для фармацевтов. - Медицина, Ленинградское отделение, 1967. - С. 695-696.

5. Солопаева И.М., Стефанов С.Б., Жданова Т.Ф. Количественная морфология биоптатов органов пищеварения. Метод. рекомендации. - Горький, 1992. - 16 с.

6. Солопаева И.М. Хорионический гонадотропин как стимулятор регенерации печени и перспектива его использования. Регенерация. Адаптация. Гомеостаз: Сб. научн. тр. Горьк. мед. ин-т им. С.М. Кирова. - Горький, 1990. - С. 14-21.

7. Способ стимуляции регенераций печеночной ткани. Патент РФ на изобретение 2134582. - Опубл. 20.08.99.

8. Стрелков Р. Б. Метод вычисления стандартной ошибки и доверительный интервал средних арифметических величин с помощью таблиц. - Сухуми: Алашара, 1966. - 12 с.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной гепатологии, и касается регенерационной терапии при патологии печени. При токсическом гепатите, вызванном в эксперименте, вводят комплекс препаратов, содержащих 0,5 мл пиридоксина гидрохлорида, 2 мкг цианкобаламина, 0,5 мг витамина РР на 1 мл экстракта вытяжки коры свиных или фетальных надпочечников человека. Вводят этот комплекс ежедневно подкожно по 0,5 мл курсом 10 инъекций. Способ повышает темпы регенерации, приводит к нормализации паренхимы печеночной ткани. 1 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Способ стимуляции регенерации печеночной ткани путем введения экспериментальным животным подкожно экстракта вытяжки коры свиных или фетальных надпочечников человека, отличающийся тем, что при коррекции смоделированного состояния токсического гепатита к экстракту вытяжки коры надпочечников добавляют витаминный комплекс, приготовленный на основе витаминов В₆, В₁₂ и РР, и вводят его ежедневно по 0,5 мл курсом 10 инъекций. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для приготовления витаминного комплекса используют 0,5 мг пиридоксина гидрохлорида, 2 мкг цианокобаламина, 0,5 мг витамина РР на 1 мл экстракта вытяжки коры надпочечников.