СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ РЕГЕНЕРАЦИИ ПЕЧЕНОЧНОЙ ТКАНИ Российский патент 1999 года по МПК A61K35/55 A61K31/56 

Предлагаемое изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине, гепатологии и может быть применено для стимуляции регенерации печени.

Известно большое количество биологически активных веществ, способных стимулировать пролиферацию гепатоцитов: аминокислоты, гидролизаты, пуриновые и пиримидиновые производные, витамины, гормоны /1, 2, 4,8/. Реализация стимулирующего эффекта различных биологически активных веществ может осуществляться за счет метаболитов, образующихся при изменении или нарушении обменных процессов в печени под влиянием тех или иных веществ или за счет усиления активности генов, ответственных за белковый обмен, что, наряду со стимуляцией белкового синтеза, способствует усилению пролиферации клеток печени.

За прототип предлагаемого изобретения выбран способ стимуляции регенерации печеночной ткани, включающий воздействие на нее синтетического аналога гормона коры надпочечников - гидрокортизона /3/. Способ по прототипу осуществляют следующим образом: четырем белым беспородным крысам вводили гидрокортизон в дозе 0,5 мл в количестве двух инъекций: первую инъекцию проводили в день операции - резекции 30% ткани печени, вторую - через 24 часа после резекции 30% ткани печени. Однако осуществление способа применения гидрокортизона имеет ряд существенных недостатков, ограничивающих его применение для стимуляции регенерации печеночной ткани. В частности, данное вещество оказывает незначительный стимулирующий эффект на регенерацию печени после ее резекции /собственные данные/. Кроме того, применение гидрокортизона влечет за собой многочисленные осложнения и побочные действия, в частности симптомокомплекс Иценко-Кушинга, гипергликемию вплоть до диабета, усиление выделения кальция и остеопороз, обострение язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, изъязвления пищеварительного тракта, прободение нераспознанной язвы, геморрагический панкреатит, понижение сопротивляемости к инфекциям, повышение свертываемости крови с возможностью тромбообразования, появление лунообразного лица, ожирения. Возможны также нервные и психические нарушения: бессонница, возбуждение с развитием в некоторых случаях психозов. При длительном применении глюкокортикостероидов следует учитывать возможность угнетения функции коры надпочечников с подавлением биосинтеза гормонов, не исключена атрофия надпочечников /5, 10/. Поэтому задачей изобретения является повышение эффективности способа стимуляции регенерации печеночной ткани с одновременным снижением побочных эффектов от применяемого лечебного средства.

Поставленная задача решается благодаря способу стимуляции регенерации печеночной ткани путем воздействия на нее гормонсодержащего вещества, в котором, в соответствии с изобретением, в качестве гормонсодержащего вещества используют экстракт вытяжки коры надпочечников.

В источниках информации подобного способа стимуляции регенерации печеночной ткани не обнаружено. Поэтому авторы полагают, что техническое решение является новым и соответствует критерию "изобретательский уровень".

Способ стимуляции регенерации печеночной ткани осуществляли в эксперименте на 19 белых беспородных крысах. Для этого опытным группам животных вводили экстракты вытяжки коры свиных и фетальных /человеческих/ надпочечников в дозе по 0,5 мл в количестве двух инъекций /четырем животным/. Первую инъекцию осуществляли в день операции - резекции 30% ткани печени, вторую - через 24 часа после резекции 30% ткани печени.

Для сравнения эффекта стимуляции регенерации печеночной ткани четырем животным вводили гидрокортизон в дозе 0,5 мл в количестве двух инъекций: первую в день операции, вторую - через 24 часа после резекции 30% ткани печени. Экстракт вытяжки коры свиных и фетальных надпочечников и гидрокортизон приготовляли на спиртовой основе, поэтому четырем животным после резекции 30% ткани печени вводили 10% раствор спирта в дозе 0,5 мл в количестве двух инъекций: первую в день операции, вторую - через 24 часа после резекции 30% ткани печени. Инъекции осуществляли подкожно в утренние часы: 9 - 10 часов. Животных подбирали одинаковых по массе тела /150 - 180 г/ и половой принадлежности /самцы/.

Контролем служили две группы животных: одна из них не подвергалась никаким воздействиям - интактные /три животных/, другая группа /четыре животных/ подвергалась только резекции 30% ткани печени - оперированный контроль. Контрольные животные были одинаковы по массе тела и половой принадлежности. Таким образом, все экспериментальные животные были разделены на 6 групп:
1 группа - оперированный контроль - животные, подвергавшиеся только резекции 30% ткани печени;
2 группа - животные, получавшие после резекции 30% ткани печени 10% раствор спирта;
3 группа - животные, получавшие после резекции 30% ткани печени экстракт вытяжки коры свиных надпочечников;
4 группа - животные, получавшие после резекции 30% ткани печени гидрокортизон;
5 группа - животные, не подвергавшиеся никаким воздействиям - интактный контроль;
6 группа - животные, получавшие после резекции 30% ткани печени экстракт вытяжки коры фетальных надпочечников человека.

Средство для стимуляции регенерации печеночной ткани получают следующим образом. Из замороженных в жидком азоте надпочечников свиней и новорожденных умерших детей отделяют корковую часть, измельчают при помощи волчка и подвергают экстрагированию эфиром. Полученный экстракт переводят в спирт, а затем в физиологический раствор. Из 3 грамм ткани коры надпочечников получают 1 мл экстракта. Технологическая схема производства экстракта вытяжки коры надпочечников описана в литературных источниках /6/.

Животных всех экспериментальных групп забивали через 48 часов после резекции 30% ткани печени. Кусочки печени, взятые при забое животных, фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, заливали в парафин. На гистологических срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, подсчитывали митотический индекс гепатоцитов /МИ/, являющийся показателем пролиферативной активности клеток печени, и количество двуядерных гепатоцитов. Результаты выражали в промиллях /%_o/. Для более полного представления об эффективности биологического действия вводимых веществ на стимуляцию регенерации печени, кроме указанных выше параметров, наряду с визуальным описанием гистопрепаратов, в паренхиме печени определяли количественные показатели репаративных процессов. С этой целью подсчитывали количество нормальных и дистрофических гепатоцитов /НГ и ДГ/ с последующим вычислением коэффициента нормализации паренхимы - КНП = НГ/ДГ. Результаты выражали в условных единицах /у.е./ на тест-площадь препарата. Измерения проводили с помощью морфометрических сеток С. Б. Стефанова с использованием рекомендаций по количественной морфологии биоптатов органов пищеварения /7/. К дистрофическим гепатоцитам относили безъядерные клетки с разорванной клеточной мембраной, а также клетки с ядром в состоянии кариопикноза и кариорексиса. Доверительный интервал колебания средней арифметической величины при P = 0,05 определяли по формуле и таблицам Р. П. Стрелкова /9/. Цифровой материал обработан статистически по методу Стьюдента.

Как показали результаты исследования, количество митозов в регенерирующей печени через 48 часов после резекции 30% ткани печени у животных 1 экспериметальной группы составляло 3,72 ± 1,29%_o. Самым высоким МИ был у животных 3 экспериментальной группы, получавших после резекции 30% ткани печени экстракт вытяжки коры свиных надпочечников - 8,99 ± 3,01%_o /P < 0,05 по сравнению с оперированным контролем - 1 экспериментальной группой/. В других экспериментальных группах /2, 4 и 6/ отмечалось незначительное увеличение пролиферативной активности гепатоцитов /см. таблицу 1/.

Количество двуядерных гепатоцитов у животных 1 экспериментальной группы /оперированный контроль/ через 48 часов после резекции 30% ткани печени составляло 39,58 ± 4,98%_o, т.е. почти в два раза превышало число двуядерных гепатоцитов у интактных животных - 20,33 ± 0,34%_o /P < 0,05/,что свидетельствует о более длительном течении репаративного процесса в регенерирующей печени по сравнению с животными, получавшими после резекции 30% ткани печени экстракт вытяжки коры свиных надпочечников. Количество двуядерных гепатоцитов у животных 3 экспериментальной группы достигло нормальных значений и составляло 19,92 ± 4,70%_o. У животных, получавших после резекции 30% ткани печени гидрокортизон /4 экспериментальная группа/, число митозов и двуядерных гепатоцитов после операции было незначительным: МИ составлял 5,50 ± 0,75%_o, двуядерные клетки - 7,75 ± 2,49%_o. Близким к этим значениям были показатели пролиферативной активности гепатоцитов у животных 2 экспериментальной группы, получавших после резекции 30% ткани печени 10% раствор спирта: МИ = 4,67 ± 1,83%_o, двуядерные - 12,58 ± 2,34%_o. У животных 6 экспериментальной группы отмечалось очень незначительное количество митозов - МИ = 2,37 ± 1,24%_o, однако достаточно высокое содержание двуядерных гепатоцитов - 28,58 ± 1,21%_o при норме 20,33 ± 0,34%_o /P < 0,01/, что свидетельствует о недавно прошедших митозах, не завершенных цитотомией /один из механизмов образования двуядерных клеток/.

Анализ клеточного состава паренхимы печени у животных разных экспериментальных групп показал более выраженную степень нормализации структуры печени у животных, получавших после резекции 30% ткани печени экстракты вытяжки коры свиных надпочечников /3 группа/ и фетальных надпочечников /6 группа/ по сравнению со всеми другими экспериментальными группами /P < 0,001/. Коэффициент нормализации паренхимы печени составлял у них соответственно: 3,21 ± 0,13 у.е. и 3,58 ± 0,21 у.е./у интактных животных - 4,11 ± 0,06 у.е./.

Гистологическое изучение препаратов выявило у животных 3 и 6 экспериментальных групп нормальное балочное строение печени, лишь местами отмечалось расширение синусоидов, незначительная жировая инфильтрация гепатоцитов, как результат недавно перенесенной резекции печени. У животных данных экспериментальных групп в небольшом количестве встречались безъядерные гепатоциты - 0,45 ± 0,14 у.е., гепатоциты с разорванной цитоплазматической мембраной - 1,34 ± 0,14 у.е., а также с пикнотичным и разрушенным ядрами - 1,82 ± 0,16 у. е. У интактных животных дистрофические гепатоциты составляли соответственно: 0,53 ± 0,46 у.е., 0,25 ± 0,13 у.е., 3,46 ± 0,15 у.е. У животных других экспериментальных групп процесс нормализации паренхимы печени выражен в меньшей степени, особенно в группе животных, получавших после резекции 30% ткани печени гидрокортизон /4 экспериментальная группа/. У них отмечалось самое высокое число безъядерных гепатоцитов - 2,57 ± 0,42 у.е. /P < 0,05/ по сравнению с животными 3 экспериментальной группы, получавших после резекции 30% ткани печени экстракт вытяжки коры свиных надпочечников. Эти гепатоциты находятся в стадии резко выраженной белковой дистрофии - гидропической дегенерации. Также резко выражен полиморфизм ядер гепатоцитов. Встречаются очаги некрозов, а на месте погибших клеток наблюдается лимфоцитарная инфильтрация. Вследствие этого коэффициент нормализации паренхимы печени у животных данной экспериментальной группы очень низкий - 0,90 ± 0,09 у.е.

Таким образом, сравнительное изучение биологического действия различных веществ на модели регенерирующей печени выявило стимулирующий эффект на пролиферацию гепатоцитов при введении животным экстрактов вытяжек коры свиных и фетальных надпочечников, проявляющийся в усилении митотической активности гепатоцитов, увеличении количества нормальных и снижении числа дистрофических клеток печени. Анализ полученных данных показывает, что использование экстрактов вытяжек коры свиных и фетальных надпочечников приводит к стимуляции регенерации печени и нормализации ее структуры, что позволяет предложить данный способ для регенерационной терапии при патологии печени в условиях эксперимента.

Источники информации:
1. Билич Г. Л. , Колла В. Э. Пути лекарственной регуляции регенерации//Совр. проблемы регенерации: Матер. 2 Всесоюзн. шк. молодых ученых и спец. по совр. пробл. регенерации. Йошкар-Ола, 1982. С. 25 - 35.

2. Влияние производных пурина на регенерацию и иммунологическую реактивность у животных /печень//Рябинина З.А., Кипичников М.М., Суздальцев А.А., Дакина Н.Н.//Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1978. - N 10. - С. 465 - 467.

3. Влияние синтетических аналогов глюкокортикоидов на развитие регенерационного процесса при экспериментальном хроническом гепатите и циррозе печени /Пулатова М.К., Абдуллаев Н.Х., Мухамедов Т.М., Расулев Н.И. и др.//Сб. научн. тр. Горьк. мед. ин-т им. С.М. Кирова. - Горький, 1970. - В. 32. С. 346.

4. Мансурова И. Д. , Мун Н.П. К патогенезу жировой инфильтрации печени//Успехи гепатологии. В. 5. - Рига, 1975. - С. 217 - 232.

5. Машковский М.Д. Лекарственные средства//М.: Медицина, 1986. - Т.1. - С. 568-570.

Розенцвейг П.Э., Сандер Ю.К. Технология лекарств и галеновых препаратов//Руководство для фармацевтов. - Медицина, Ленинградское отделение, 1967. - С. 695-696.

7. Солопаева И.М,, Стефанов С.Б., Жданова Т.Ф. Количественная морфология биоптатов органов пищеварения//Метод.рекомендации. - Горький, 1982, - 16 с.

8. Солопаева И.М. Хорионический гонадотропин как стимулятор регенерации печени и перспективы его использования//Регенерация. Адаптация. Гомеостаз: Сб.научн.тр./Горьк.мед.ин-т им.С.М.Кирова. - Горький, 1990. - С. 14-21.

9. Стрелков Р. Б. Метод вычисления стандартной ошибки и доверительный интервал средних арифметических величин с помощью таблиц. - Сухуми: Алашара, 1966. - 12 с.

10. Угрюмов Б. Д., Верховская А.А., Кириченко Д.Ф. О побочном действии кортикостероидтерапии при эпидемическом гепатите Боткина//Тез. докл. выездной сессии, посвящ.вопросам кишечных инфекций. - М., 1966. - С. 73.

Изобретение можeт быть использовано в медицинской биологии и в клинике для регенерационной терапии при паталогии печени. Способ осуществляется путем подкожного введения экспериментальным животным вытяжки коры свиных или фетальных (человеческих) надпочечников в дозе по 0,5 мл в количестве двух инъекций. Способ повышает эффективность регенерации печеночной ткани и восстановление паренхимы патологически измененной печени с одновременным снижением побочных эффектов от применяемого синтетического лекарственного средства. 1 табл.

Способ стимуляции регенерации печеночной ткани путем воздействия на нее гормонсодержащего вещества, отличающийся тем, что экспериментальным животным подкожно вводят экстракты вытяжки коры свиных или фетальных (человеческих) надпочечников в дозе по 0,5 мл в количестве двух инъекций.