СРЕДСТВО ДЛЯ ТОРМОЖЕНИЯ МИТОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК ЛИМФОСАРКОМЫ ПЛИССА Российский патент 2005 года по МПК A61K38/24 A61P35/00 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, биологии, и может использоваться для торможения митотической активности клеток лимфосаркомы Плисса.

Хорионический гонадотропин (ХГ) способен стимулировать процессы размножения клеток, их рост и дифференцировку на протяжении всего онтогенеза. Эти процессы лежат в основе формообразовательных реакций зародыша, постнатального периода онтогенеза, физиологической, репаративной и внутриклеточной регенерации и нормализующего действия этого гормона на некоторые патологические состояния в организме. В связи с этим использование этого гормона возможно для лечения структурно-функциональной патологии ряда органов [1].

Общеизвестно, что клетки злокачественных опухолей отличаются от нормальных отсутствием дифференцировки или слабой степенью ее выраженности при наличии значительно усиленной способности к воспроизводству. В результате малигнизации нормальные клетки становятся недифференцированными или слабо дифференцированными клетками эмбрионального типа со значительно усиленной пролиферативной активностью.

Есть данные о том, что при кратковременном применении экстракта трофобласта человека, содержащего много ХГ, был получен стойкий клинический эффект у больных с дессиминированным раком легкого при наличии метастазов после нерадикального хирургического удаления плоскоклеточного рака. Авторы расценивают такой эффект как влияние иммуномодулирующих свойств ХГ [2].

Опубликованы сведения о том, что введение коммерческого препарата ХГ в саркому Капоши приводило к регрессии опухоли. Под влиянием низкой концентрации препарата ХГ тормозится рост лейкемоидной линии клеток HL-60. У больных с острой миэлоидной лейкемией после инъекции ХГ и введения левомизола не наблюдал прогрессивного увеличения бластных клеток в костном мозгу и в периферической крови в течение 70-121 дня.

У одного больного содержание бластных клеток в костном мозгу до лечения составляло 10%, после лечения оно снизилось более, чем на 5% и держалось на этом уровне в течение 550 дней [3].

Показано, что синтетический полипептидный фрагмент бета-субъединицы ХГ, состоящий из 18-ти аминокислотных остатков (со 128 по 145), ингибирует рост промэлоидной лейкемоидной клеточной линии HL-60 и конкурирует на общие участки связывания на мембране HL-60 [4].

Действие коммерческого препарата ХГ на митотическую активность клеток лимфосаркомы Плисса неизвестно.

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала средств торможения митотической активности клеток лимфосаркомы Плисса.

Поставленная цель достигается тем, что ХГ применяется в качестве средства торможения митотической активности клеток лимфосаркомы Плисса.

Эксперимент выполнен на 14-ти самцах белых беспородных крыс с массой тела 180-200,0. Перевивку лимфосаркомы Плисса производили путем введения в правый бок крысы подкожно 1 мл профильтрованной без крупных кусочков опухоли взвеси опухолевых клеток, приготовленной на физиологическом растворе. ХГ в указанных дозах вводили подкожно однократно в левый бок животного. Крыс забивали декапитацией на 10-е сутки после перевивки опухоли. Кусочки опухоли фиксировали в 10% формалине, заливали в парафин. Срезы опухоли толщиной в 5-6 микрон окрашивали гематоксилином с докрашиванием эозином. Количество митозов при увеличении светового микроскопа 10Х1,5Х90 подсчитывали в 400-х полях каждого препарата. Средняя величина количества митозов в опухоли в группе из 5-ти крыс выводилась на основании подсчета митозов в 2000 полях зрения или 2000 замеров. Полученный материал обрабатывался по Стъюденту.

Животные были разделены на 3 группы: 1-ая группа животных после перевивки не подвергалась никаким воздействиям; 2-ая группа крыс получала ХГ в дозе 150 ЕД за сутки до перевивки и через 3 дня после перевивки опухоли; 3-я группа животных получала ХГ в дозе 150 ЕД на 3 и 6 сутки после перевивки опухоли.

За сутки до перевивки ХГ в дозе 150 ЕД вводили потому, что экспериментально доказано, что через 24 и 48 часов после введения этой дозы гормона концентрация ХГ в сыворотке крови увеличивается соответственно до 327,0 mlV/ml и 373,0 mlV/ml при норме, равной 1,25 mlV/ml, что позволяет считать, что ХГ стимулирует собственный эндогенный синтез под влиянием экзогенно введенного ХГ. Это обеспечивает функционирование гормона в организме более длительное время, т.к. известно, что введенный экзогенно ХГ выводится из организма в основном в течение 24-х часов.

Результаты исследования приведены в таблице 1.

Таблица 1
Количество митозов в опухоли Плисса в разных группах крысНомера крысГруппа 1Номера крысГруппа 2Номера крысГруппа 3881912346213824791143462241210734173522843638111830827362182720395  М±м796,4±22,3 349,6±20,6 398,0±20,7t
Рt_1-2=14,7
P_1-2<0,01 t_1-3=13,1
P_1-3<0,01 t_2-3=1,7
Р_2-3>0,1Примечание: P_1-2 - достоверность разницы (ДР) между 1 и 2 группами;
Р_1-3 - ДР между 1 и 3 группами;
Р_2-3 - ДР между 2 и 3 группами.

Как видно из таблицы 1 через 10 дней после перевивки в опухолях Плисса у животных 2-ой и 3-ей групп количество митотически делящихся клеток под влиянием ХГ в дозе 150 ЕД на животное, введенного как до так и после перевивки опухоли, достоверно (Р<0,01) оказалось сниженным в 2,28 и 2,00 раза соответственно по сравнению с количеством митозов в опухолевых клетках нелеченых животных. При этом разница в количестве митозов в ткани опухоли Плисса у животных 2-ой и 3-ей групп оказалось недостоверной (Р>0,1).

Полученные данные говорят о значительном торможении увеличения массы опухолевых клеток крыс, получавших ХГ в дозе 150 ЕД. На основании полученных данных подсчет количества митозов в опухолевой ткани можно считать более информативным показателем, например, в сравнении с весом опухоли, для суждения об увеличении или уменьшении массы опухоли под влиянием различных биологически активных веществ, испытываемых с целью поисков новых способов лечения злокачественных новообразований.

Вес опухоли, на основании которого принято определять процент торможения роста опухоли, представляет собой суммированный результат веса отдельных элементов, составляющих опухоль. К ним относится масса опухолевых клеток, участки некроза и соединительной ткани, замещающей участки погибших клеток, кровеносные сосуды, наполненные кровью. Весовые выражения этих элементов являются величинами непостоянными, меняющимися в зависимости от ряда факторов, в зависимости от действия изучаемого препарата на опухоль, от состояния животных, от условий содержания их и т.д.

Учитывая это, целесообразно вести подсчет количества митозов в опухолевых клетках в число тестов, определяющих состояние пролиферативной активности клеток опухолей при изучении влияния тех или иных препаратов на состояние злокачественных опухолей.

В настоящем исследовании обнаружена способность ХГ в дозе 150 ЕД тормозить митотическое деление клеток лимфосаркомы Плисса. С другой стороны известно, что в дифференцированных как нормальных, так и патологически измененных, но не опухолевым процессом, клетках обнаружена выраженная способность ХГ инициировать и стимулировать клеточное размножение на протяжении всего онтогенеза. Можно думать, что в дифференцированных клетках этот гормон тоже тормозит вступление клетки в митотический цикл, но опосредованно, путем инициации и стимуляции процесса дифференцировки, во время которого клетки не делятся.

В клетках злокачественных опухолей дифференцировка нарушена и в этих условиях проявляется способность ХГ тормозить вступление клетки в митоз, результатом чего является снижение образования новых опухолевых клеток. Такое действие ХГ можно рассматривать как нормализующее увеличенную в лимфосаркоме Плисса митотическую активность ее клеток.

Примеры.

Пример 1. Крысе №1 26-го июня перевита опухоль лимфосаркома Плисса. Перевивку делали путем введения 1 мл профильтрованной взвеси клеток опухоли в физиологическом растворе подкожно в правый бок. Через 10 дней после перевивки крысу забили декапитацией. Кусочки опухоли фиксировали в 10% формалине и заливали в парафин. Срезы толщиной в 5-6 микрон окрашивали гемотоксилином и докрашивали эозином. Количество митозов при увеличении 10×1,5×90 посчитывали в 400-х полях зрения препарата. Количество митозов в 400-х полях зрения препарата опухоли крысы №1 составляло 827.

Пример 2. Крысе №18 26-го июня в правый бок перевита опухоль лимфосаркомы Плисса. 25 и 29 июня крысе №18 вводили ХГ в дозе 150 ЕД однократно в левый бок подкожно. Перевивку делали путем введения 1 мл профильтрованной взвеси клеток опухоли в физиологическом растворе подкожно в правый бок. Через 10 дней после перевивки крысу забивали декапитацией. Кусочки опухоли фиксировали в формалине и заливали в парафин. Срезы толщиной в 5-6 микрон окрашивали гемотоксилином и докрашивали эозином. Количество митозов при увеличении 10×1,5×90 посчитывали в 400 полях зрения препарата опухоли крысы №18. Количество митозов в 400 полях зрения препарата опухоли этой крысы составляло 308.

Литература

1. Солопаева И.М. Хорионический гонадотропин в биологии и медицине. - Н.Новгород: Изд-во ННГУ, 2000. - 191 с.

2. Говалло В.И. Иммунология репродукции. - М.: Медицина, 1987. - 304 с.

3. Feldman T.J., Seiter K., Chio S.W. et al //Leukemia, 1998, Nov. 12 (11): 1749-55.

4. Валуйских А.Н., Ромашкова Ю.А., Данилович А.В. и соавт. //Бюллетень биологии и медицины. - 1997. - №4. - С.424-426.

Предложено применение гормона хорионического гонадотропина в качестве средства торможения митотической активности клеток лимфосаркомы Плисса. Ранее гормон хорионического гонадотропина был известен как средство, способное инициировать и стимулировать размножение нормальных и патологически измененных (но не опухолевым процессом) клеток. Изобретение позволяет нормализовать митотическую активность клеток лимфосаркомы Плисса, в результате чего снижается образование новых опухолевых клеток. 1 табл.

Применение гормона хорионического гонадотропина в качестве средства торможения митотической активности клеток лимфосаркомы Плисса.