ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ МОБИЛИЗАЦИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК Российский патент 2009 года по МПК A61K38/18 A61P7/00 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к смеси биологически активных молекул, используемых в мобилизации стволовых клеток крови у пациента или у нуждающегося в этом субъекта. В частности, в настоящем изобретении представлена смесь гранулоцитарного колониестимулирующего фактора G-CSF и плацентарного фактора роста PlGF, особенно эффективная в стимулировании мобилизации клеток-предшественников периферической крови (КППК), увеличивающая тем самым возможность осуществления и эффективность органной или клеточной трансплантации и протоколов радиохимиотерапии у онкологических пациентов.

ОПИСАНИЕ ПРЕДШЕСТВУЮЩЕГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

Аутологичные КППК значительно расширили показания, возможности осуществления и эффективность высоких доз радиохимиотерапии и трансплантации аутологичных стволовых клеток (ТСК)^1,2 среди больных с неходжкинской лимфомой (НХЛ)³, рецидивом ходжкинской лимфомы (ХЛ)⁴, а также множественной миеломой (ММ)⁵.

Аллогенные КППК представляют собой предпочтительный источник стволовых клеток для совпадающих по HLA-антигенам ТСК и уникальный источник для не совпадающих по HLA аллотрансплантатов^{6,7,8,9,10,11}, которые потенциально являются эффективной терапией для пациентов с высоким риском развития лейкозов, не имеющих близких по HLA-антигенам родственных или неродственных доноров, то есть приблизительно для 40% общего числа пациентов, которым может быть полезна аллогенная трансплантация.

Протоколы, используемые для мобилизации аутологичных КППК у онкологических пациентов, включают в себя применение миелоидных факторов роста отдельно, или совместно со средствами, позволяющими достичь оптимальной мобилизации КППК, в течение восстановительного периода после цитотоксической химиотерапии^12,13,14. Мобилизация аллогенных КППК, полученных от здоровых доноров, обычно достигается короткими курсами рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (rhG-CSF) в интервале доз от 10 до 20 мкг/кг/в день^15,16,17,18.

У онкологических пациентов, которым производили аутотрансплантацию ≥5×10⁶ CD34+клеток/кг, происходило быстрое и длительное гематопоэтическое приживление, тогда как пациенты, составившие группу риска в отношении замедленного приживления, отсутствия приживления или вторичной миелодисплазии¹⁹, получали ≤2×10⁶ CD34+клеток/кг. Поэтому существенным необходимым предварительным условием для проведения аутологичной ТСК является доступность адекватных количеств клеток CD34+. У значительной части не подвергавшихся химиотерапии (от 10 до 20%) или рецидивирующих/невосприимчивых (от 30 до 40%) онкологических пациентов не происходит мобилизации оптимальных количеств клеток CD34+ как вследствие предшествующей обширной радиохимиотерапии, так и факторов, связанных с болезнью ^20,21,22.

Накопление адекватного количества аллогенных клеток CD34+ не является критической проблемой у реципиентов, идентичных по HLA, трансплантатов; однако от 5 до 15% нормальных доноров проявляют слабую мобилизацию стволовых клеток требуют увеличенных доз rhG-CSF и проведения многократных процедур афереза^23,24,25. После несовпадающей по HLA аллотрансплантации реципиентам требовалась реинфузия «мега» доз CD34+ клеток без Т-лимфоцитов для предотвращения отторжения трансплантата и тяжелой реакции "трансплантат против хозяина" (GvHD)²⁶. При стандартном режиме мобилизации (то есть при 7-дневном курсе rhG-CSF) доноры несовпадающих по HLA ТСК подвергались в среднем 4-кратному лейкаферезу для забора дозы клеток-мишеней - клеток CD34+ (12×10⁶ CD34+клеток/кг веса тела), при том, что значительный процент доноров (от 20 до 25%) не способен обеспечить дозу клеток-мишеней CD34+.

Несмотря на то, что возраст, пол, схема лечения цитокинами, а также предшествующая радиохимиотерапия может влиять на мобилизацию стволовых клеток^27,28,29, не было выявлено никаких определенных характеристик, являющихся прогностическими факторами для мобилизации цитокинов. Поэтому предполагается, что любая процедура, применимая к онкологическим пациентам или нормальным донорам и способствующая увеличению выработки циркулирующих клеток-предшественников при отсутствии дополнительной токсичности, будет играть существенную роль в возможности осуществления, снижения токсичности и стоимости как аутологичной, так и аллогенной ТСК.

Увеличение мобилизации КППК может быть достигнуто путем использования молекул, способных к интерференции, по механизму (механизмам) регуляции направленной миграции гематопоэтических стволовых клеток, то есть трансмиграции через просвет эндотелия к экстраваскулярным промежуткам костного мозга в хоминге и обратно при мобилизации^30,31,32,33. Один дополнительный подход для усиления мобилизации КППК основан на использовании комбинаций цитокинов, таких как рекомбинантный человеческий (rh) гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (rhGM-CSF) вместе с rhG-CSF³⁴, интерлейкин-3 (rhIL-3) вместе с rhG-CSF или rhGM-CSF³⁵, и PIXY-321³⁶. Наконец, усиление мобилизации КППК может быть достигнуто путем включения в стандартный режим мобилизации цитокинов раннего действия, таких как фактор стволовых клеток (rhSCF)^37,38 лиганд flt-3³⁹, способствующих росту костномозговых клеток-предшественников, таким образом увеличивая количество клеток, восприимчивых к последующей мобилизации rhG-CSF.

До сих пор и заменители, и средства, дополняющие rhG-CSF, не могли значительно усилить мобилизацию клеток-предшественников крови, достигаемую только под действием rhG-CSF, или приводили к ограниченному улучшению, сводившемуся к нулю значительным увеличением токсичности.

Плацентарный фактор роста (PlGF) является членом семейства сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и действует как ангиогенный амплификатор, передавая сигнал через рецептор-1 VEGF (VEGFR1). В последнее время показано, что введение аденовирусного вектора, экспрессирующего человеческий (h) PlGF, вызывает сложные гематопоэтические эффекты, включая усиление восстановления костного мозга после миелосупрессии и мобилизацию гематопоэтических клеток-предшественников. Однако введение факторов роста после инъекции рекомбинантных аденовирусных векторов имеет несколько основных отличий от непосредственной инъекции очищенного фактора, и невозможно прогнозировать эффект, когда факторы роста вводятся согласно методикам, используемым в клинических условиях.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Вследствие существенного клинического воздействия любой процедуры, способной повысить мобилизацию стволовых клеток, авторы изобретения тестировали мобилизующую активность PlGF в экспериментах на животных моделях, позволяющих стимулировать мобилизацию КППК, как это происходит в клинической ситуации. Нормальным мышам BALB/c внутрибрюшинно (в/б) в течение 5 дней вводили либо контрольный носитель, забуференный фосфатом солевой раствор/метансульфоновая кислота (PBS/MSA), отдельно rhG-CSF (10 мкг/д), либо комбинацию rhG-CSF (10 мкг/д) и рекомбинантного мышиного (rm)PlGF (2,5-5 мкг/д). Через 2 часа после последнего введения цитокинов осуществляли забор проб крови и оценивали следующие параметры: количество белых клеток крови (WBC), частота экспрессии и абсолютное количество колониеобразующих клеток (CFC), абсолютное количество клеток-стимуляторов долговременной культуры (LTC-IC).

Действие rmPlGF показано ниже в Таблицах 1-4. Очевидно, что отдельно введенный rmPlGF не оказывает никакого эффекта на мобилизацию WBC, CFC и LTC-IC. Введение rmPlGF (5 мкг/д) в сочетании с rhG-CSF в течение 5 дней значительно повышает мобилизацию CFC и LTC-IC по сравнению с изолированным введением rhG-CSF.

Кроме того, на модели приматов (макак Резус) тестировали мобилизирующую активность комбинаций PlGF/G-CSF. В дальнейшем полученные на мышах результаты подтвердились на этой экспериментальной животной модели. В частности, комбинация PlGF/G-CSF повышала мобилизацию WBC, CFC, колониеобразующих клеток с высоким пролиферативным потенциалом (HPP-CFC) и LTC-IC, в терминах кинетики, частоты экспрессии и абсолютных количеств.

Вышеупомянутое исследование проводили с использованием манипуляций и условий, которые очень сходны с введением гематопоэтических факторов роста больному человеку. Результаты ясно показывают наличие синергического эффекта hG-CSF и rhPlGF в мобилизации клеток-предшественников периферической крови.

В этой связи, объектом настоящего изобретения является комбинированный препарат G-CSF и PlGF, полезный для стимуляции мобилизации стволовых клеток крови у пациента или у нуждающегося в этом субъекта. Используемые в настоящем описании термины "пациент" и "субъект" предпочтительно относятся к человеку, но они могут относиться также и к животным, в частности к млекопитающим. Примеры симптомов, состояний или заболеваний, при которых может быть эффективна мобилизация стволовых клеток крови, включают в себя органную или клеточную трансплантацию и радиохимиотерапию опухолей, в частности, аутологичную^1,2 или аллогенную ТСК у больных с НХЛ, рецидивом ХЛ⁴, (ММ)⁵ или на стадии восстановления после миелосупрессивной химиотерапии, не ограничиваясь перечисленным.

Активные компоненты комбинированного препарата можно вводить одновременно или раздельно в составе с фармацевтически приемлемыми носителями и наполнителями. Парентеральный путь введения является предпочтительным. Способы приготовления фармацевтических композиций, подходящих для парентерального введения, известны в данной области техники; подробности можно найти в "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Mack Publishing Со. Согласно настоящему изобретению количество активных компонентов в комбинированных препаратах может изменяться в зависимости, например, от пути введения, от искомого эффекта или состояния, которое намереваются лечить, и от ответной реакции пациента. Является общим правилом, что эффективное количество G-CSF и PlGF способно вызвать желательную реакцию в плане мобилизации стволовых клеток крови. В ходе лечения можно осуществлять мониторинг ответа пациента/субъекта, например, путем подсчета стволовых клеток циркулирующей крови и, при необходимости, соответственно менять дозировки. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения рекомбинантный hG-CSF и rhPlGF используются в форме растворов для инъекций, обеспечивающих ежедневное количество активных веществ, содержащих G-CSF от 1 до 150, предпочтительно от 5 до 20 мкг/кг и PIGF от 10 до 300, предпочтительно от 20 до 150 мкг/кг.

Далее следующие примеры поясняют настоящее изобретение.

ПРИМЕРЫ 1-11 - активирующие эффекты объединения PIGF/G-CSF на модели мыши

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

Животные. Самки мышей BALB/c в возрасте от шести до 8-недель, с весом тела от 20 до 25 г, были получены от Charles River (Milano, Italy, EU). Экспериментальные манипуляции, выполнявшиеся на животных, проводились в соответствии с руководящими принципами Координационного Комитета Великобритании по онкологическим исследованиям (UK Coordinating Committee on Cancer Research. UKCCCR guidelines for the welfare of animals in experimental neoplasia. Br. J. Cancer., 58:109-113, 1998). Ежедневно, внутрибрюшинно (в/б), в течение 5 дней, мышам вводили в качестве контрольного носителя (PBS/MSA), изолированно rhG-CSF (10 мкг/д), или rhG-CSF (10 мкг/д) вместе с рекомбинантным мышиным (rm)PlGF (2,5-5 мкг/д). Каждый эксперимент проводили по меньшей мере в три отдельных приема и на каждую группу в каждой временной точке использовали от трех до четырех мышей.

Цитокины. Рекомбинантный гранулоцитарный человеческий колониестимулирующий фактор (rhG-CSF, Neupogen®) приобретали у Roche (Milan, Italy, EU); rmPlGF был приобретен в R&D Systems Inc., Abingdon, United Kingdom); наличие rhPIGF было обеспечено Geymonat SpA (Anagni, Italy, EU).

Протоколы мобилизации. Стандартный протокол мобилизации включал в себя однократное ежедневное введение мышам BALB/c rhG-CSF (10 мкг/мышь, в/б) в течение 5 дней. Для оценки эффектов мобилизации под действием PIGF, rmPlGF (2,5-5 мкг/мышь, в/б) вводили однократно ежедневно в течение 5 дней либо в качестве единственного средства, либо совместно с rhG-CSF. Контрольным группам производили инъекции PBS/MSA.

Параметры мобилизации. Мобилизацию оценивали путем подсчета лейкоцитов (WBC), частоты экспрессии и абсолютных количеств колониеобразующих клеток (CFC) и абсолютного количества клеток-стимуляторов долговременной культуры (LTC-IC). Если не оговорено особо, животных забивали через два часа после последнего введения.

Получение и сепарация клеток. ПК отбирали в содержащие гепарин пробирки из орбитального сплетения. После подсчета лейкоцитов (WBC) ПК разбавляли в объемном отношении 1:4 PBS и мононуклеарные клетки (МНК) отделяли центрифугированием (280 g, 30 минут, при комнатной температуре) в непрерывном градиенте плотности Фиколла. После этого клетки дважды промывали в питательной среде Dulbecco, модифицированной по способу Iscove (IMDM, Seromed, Berlin, Germany, EU), с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS, Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada), 2 ммоль L-глутамина и антибиотиков.

Подсчет WBC. Подсчет WBC проводили, используя обработанную гепарином кровь и автоматизированный счетчик (ADVIA 120, Bayer, Milano, Italy, EU).

Анализ колониеобразующих клеток (CFC). Все колониеобразующие клетки (CFC), т.е. гранулоцитарно-макрофагальные колониеобразующие единицы (CFU-GM), ранние эритроидные предшественники, образующие «взрывообразные» колонии (BFU-E) и линиенеспецифические колониеобразующие единицы (CFU-GEMM) оценивались суммарно в стандартной метилцеллюлозной культуре. Кратко, 1 мл аликвотного количества крови (от 5×10⁴ до 2×10⁵ МНК) высевали в чашках Петри (размером 35 мм) в питательной среде на основе метилцеллюлозы (НСС-3434; Stem Cell Technologies) с добавлением рекомбинантного мышиного (rm) фактора стволовых клеток (rmSCF, 50 нг/мл), рекомбинантного мышиного (rm) интерлейкина-3 (rmIL-З, 10 нг/мл), рекомбинантного человеческого (rh) интерлейкина-6 (rhIL-6, 10 нг/мл) и рекомбинантного человеческого (rh) эритропоэтина (rhEpo, 3 Ед/мл). Колонии подсчитывались согласно стандартным критериям после 12-14 дней инкубации при 37°С во влажной атмосфере с содержанием в воздухе 5% CO₂ (Humphries, R.К. et al., Blood, 53:746-763, 1979).

Анализ клеток-стимуляторов долговременной культуры (LTC-IC). LTC-IC оценивали в смешанной культуре (Carlo-Stella С, et al. Blood. 1999; 93:3973-82). Кратко, в полной питательной среде (Myelocult^TM 5100, Stem Cell Technologies) тестируемые клетки (5-8×10⁶) ресуспендировали и высевали в культуры, содержащие фидер из облученных (2000 сГи) мышиных клеток AFT024 (любезно предоставленных Dr. К. Moore, Princeton University, Princeton, NJ, USA) (Moore КА, et al., Blood. 1997;89:4337-47).

Полная питательная среда состояла из альфа-среды с добавлением FBS (12,5%), лошадиной сыворотки (12,5%), L-глутамина (2 ммоль), 2-меркаптоэтанола (10^-4 моль), инозита (0,2 ммоль), фолиевой кислоты (20 мкмоль) вместе со свежим раствором гидрокортизона (10^-6 моль). Культуры еженедельно подпитывались путем замены половины среды для выращивания на свежую полную питательную среду. После 4 недель культивирования неадгезивные клетки и адгезивные клетки, полученные путем обработки трипсином, смешивали, промывали и совместно анализировали на предмет наличия клоногенных клеток в метилцеллюлозных культурах. Общее количество клоногенных клеток (а именно, CFU-GEMM плюс BFU-Е плюс CFU-GM), присутствующее в 4-недельной долговременной культуре (LTC), определяет относительный показатель количества LTC-IC, изначально представленных в тестируемой суспензии. Абсолютные количества LTC-IC рассчитывали путем деления общего количества клоногенных клеток на 4, что является средним выходом клоногенных клеток из LTC-IC (Sutherland HJ, et al., Blood. 1989;74:1563-70).

ПРИМЕР 1

Таблица 1
Подсчет лейкоцитов у мышей после введения rmPlGF и/или rhG-CSF Режим мобилизации* WBC/мкл крови   Средние значения (диапазон) Среднее значение ± СО (стандартное отклонение) PBS/MSA 2000 (850-4000) 2165±929 rhG-CSF (10 мкг/д) 6000 (5200-21650) 9577±5575 rmPlGF (5 мкг/д) 2450 (1350-2950) 2450±141 rhG-CSF (10 мкг/д) + rmPlGF (2,5 мкг/д) 5600 (4600-13700) 7040±3778 rhG-CSF (10 мкг/д) + rmPlGF (5 мкг/д) 9500 (4800-18400) 9980±5715

*Мышам BALB/c в течение 5 дней внутрибрюшинно (в/б) вводили либо PBS/MSA, либо отдельно rhG-CSF (10 мкг/д), либо совместно rhG-CSF (10 мкг/д) и rmPlGF (2,5-5 мкг/д). Пробы крови отбирали через 2 часа после последнего введения rmPlGF и/или rhG-CSF.

ПРИМЕР 2

Таблица 2
Частота экспрессии циркулирующих CFC у мышей после введения rmPlGF и/или rhG-CSF Режим мобилизации* WBC/мкл крови   Средние значения (диапазон) Среднее значение ± СО (стандартное отклонение) PBS/MSA 7(2-15) 8±3 rhG-CSF (10 мкг/д) 76 (51-148) 82±29 rmPlGF (5 мкг/д) 8 (7-9) 8±1 rhG-CSF (10 мкг/д) + rmPlGF (2,5 мкг/д) 115 (93-184) 130±37 rhG-CSF (10 мкг/д) + rmPlGF (5 мкг/д) 195 (113-253) 180±58

*Мышам BALB/c в течение 5 дней внутрибрюшинно (в/б) вводили либо PBS/MSA, либо отдельно rhG-CSF (10 мкг/д), либо совместно rhG-CSF (10 мкг/д) и rmPlGF (2,5-5 мкг/д). Пробы крови отбирали через 2 часа после последнего введения rmPlGF и/или rhG-CSF. CFC включают в себя гранулоцитарно-макрофагальную колониеобразующую единицу (CFU-GM), эритроидные предшественники, образующие «взрывообразные» колонии (BFU-E) и полипотентную колониеобразующую единицу (CFU-Mix). Данные о CFC получены на четырехкратно пересеянных культурах на основе проб от каждого животного.

ПРИМЕР 3

Таблица 3
Абсолютное количество циркулирующих CFC у мышей после введения rmPlGF и/или rhG-CSF Режим мобилизации* WBC/мкл крови   Средние значения (диапазон) Среднее значение ± СО (стандартное отклонение) PBS/MSA 57 (9-288) 81±75 rhG-CSF (10 мкг/д) 3129 (1042-5518) 2977±1126 RmPlGF (5 мкг/д) 96 (87-105) 96±13 rhG-CSF (10 мкг/д) + rmPlGF (2,5 мкг/д) 2568 (1480-5885) 3198±1928 rhG-CSF (10 мкг/д) + rmPlGF (5 мкг/д) 6143 (2486-11520) 6015±3674

*Мышам BALB/c в течение 5 дней внутрибрюшинно (в/б) вводили в виде инъекции либо PBS/MSA, либо только rhG-CSF (10 мкг/д), либо совместно rhG-CSF (10 мкг/д) и rmPlGF (2,5-5 мкг/д). Пробы крови забирали через 2 часа после последнего введения rmPlGF и/или rhG-CSF. CFC включают в себя гранулоцитарно-макрофагальную колониеобразующую единицу (CFU-GM), ранние эритроидные предшественники, образующие «взрывообразные» колонии (BFU-E) и полипотентную колониеобразующую единицу (CFU-Mix). Данные о CFC получены на четырехкратно пересеянных культурах на основе проб от каждого животного. Абсолютным количеством циркулирующих в крови CFC является показатель частоты экспрессии CFC, умноженный на общее количество МНК/мл крови.

ПРИМЕР 4

Таблица 4
Абсолютное количество циркулирующих LTC-IC у мышей после введения mPlGF и/или rhG-CSF Режим мобилизации* WBC/мкл крови   Средние значения (диапазон) Среднее значение ± СО (стандартное отклонение) PBS/MSA 7 (3-29) 9±5 rhG-CSF (10 мкг/д) 194 (57-337) 208±98 RmPlGF (5 мкг/д) 4 (3-5) 4±2 rhG-CSF (10 мкг/д) + rmPlGF (2,5 мкг/д) 565 (279-852) 565±405 rhG-CSF (10 мкг/д) + rmPlGF (5 мкг/д) 1173 (852-2070) 1365±364

*Мышам BALB/c в течение 5 дней внутрибрюшинно (в/б) вводили либо PBS/MSA, либо только rhG-CSF (10 мкг/д), либо совместно rhG-CSF (10 мкг/д) и rmPlGF (2,5-5 мкг/д). Пробы крови забирали через 2 часа после последнего введения rmPlGF и/или rhG-CSF. Абсолютное количество циркулирующих LTC-IC анализировали в смешанной культуре. Тестируемые клетки (5-8×10⁶) высевали в культуры, содержащие фидер из облученных мышиных клеток AFT024. После 4 недель культивирования полученные путем трипсинизации неадгезивные клетки и адгезивные клетки смешивали, промывали и совместно анализировали на клоногенные клетки. Общее количество клоногенных клеток (т.е. CFU-Mix плюс BFU-Е плюс CFU-GM), присутствующее в 4-недельной LTC, определяет относительный показатель количества LTC-IC, изначально представленных в тестируемой суспензии. Абсолютным количеством LTC-IC в крови является показатель частоты экспрессии LTC-IC, умноженный на общее количество МНК/мл крови.

ПРИМЕРЫ 5-11 - Активирующие эффекты объединения PIGF/G-CSF на модели приматов

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

Схема эксперимента. Группе макак Резус (n=4) вначале для мобилизации отдельно вводили G-CSF (100 мкг/кг/ в день, подкожно (п/к), в течение 5 дней) (цикл 1) и после 6-недельного периода выведения им проводили вторую мобилизацию, состоящую из rhPlGF (130 мкг/кг, внутривенно (в/в), в течение 5 дней) совместно с rhG-CSF (100 мкг/кг/ в день, п/к, в течение 5 дней) (цикл 2). После дополнительного 6-недельного периода выведения у той же группы макак применяли третий цикл мобилизации, состоящий из rhPlGF (260 мкг/кг, ВВ, в течение 5 дней) плюс rhG-CSF (100 мкг/кг/ в день, ПК, в течение 5 дней) (цикл 3). Согласно схемам исследований, кинетика мобилизации после цикла 1 послужила внутренней контрольной группой у макак для оценки мобилизации во время циклов 2 и 3.

Параметры мобилизации. Авторы анализировали кинетику мобилизации белых клеток крови (WBC), а также частоту экспрессии и абсолютные количества коммиттированных колониеобразующих клеток (CFC), колониеобразующих клеток с высоким пролиферативным потенциалом (HPP-CFC) и клеток-стимуляторов долговременной культуры (LTC-IC). Параметры мобилизации анализировали ежедневно в течение периода введения (дни от 1 до 5), и на 3 и 5 дни после прекращения введения. Пробы периферической крови забирали из бедренной вены приматов с применением асептики после анестезии (кетамин, 10 мг/кг, внутримышечно).

Подсчет WBC. Подсчет WBC производили, используя обработанную ЭДТА кровь и автоматизированный счетчик (ADVIA 120, Bayer, Milano, Italy, EU).

Анализ CFC и HPP-CFC. Общее количество CFC [т.е. гранулоцитарно-макрофагальных колониеобразующих единиц (CFU-GM), х эритроидных предшественников, образующих «взрывообразные» колонии (BFU-E) и линиенеспецифических (гранулоцитарных, эритроцитарных, макрофагальных, мегакариоцитарных) колониеобразующих единиц CFU (CFU-GEMM)] и HPP-CFC анализировали, используя гепаринизированную кровь согласно вышеописанной технологии (41, 42). Кратко, мононуклеарные клетки (МНК), полученные путем центрифугирования в непрерывном градиенте Фиколла (плотность=1,077 г/мл) четырехкратно пересевали (от 1×10⁴ до 2×10⁵ на мл) в чашках Петри размером 35 мм в питательной среде на основе метилцеллюлозы (НСС-4100, Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada) с добавлением рекомбинантного человеческого фактора стволовых клеток (rhSCF, 50 нг/мл, Stem Cell Technologies), интерлейкина-3 (rhIL-3, 20 нг/мл, Stem Cell Technologies), интерлейкина-6 (rhIL-6, 20 нг/мл, Stem Cell Technologies), rhG-CSF (20 нг/мл, Stem Cell Technologies), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (rhGM-CSF, 20 нг/мл, Stem Cell Technologies), и эритропоэтина (rhEpo, 3 Ед/мл, R&D Systems Inc, Abingdon, United Kingdom). Подсчет CFC проводили после 12-14 дней инкубации (37°С, 5% СО₂) согласно стандартным критериям. НРР-CFC, определяемые как макроскопически видимые колонии > 1 мм в диаметре при компактном росте колоний, подсчитывали после 28 дней инкубации в метилцеллюлозных культурах с добавлением rhSCF (50 нг/мл), rhIL-3 (20 нг/мл), rhIL-6 (20 нг/мл), rhG-CSF (20 нг/мл), rhGM-CSF (20 нг/мл), и rhEpo (3 Ед/мл) (43). Абсолютным количеством циркулирующих в крови CFC или НРР-CFC является показатель частоты экспрессии CFC или НРР-CFC, умноженный на общее количество МНК на мл крови.

Анализ LTC-IC. Частоту экспрессии LTC-IC оценивали в условиях серийных разведений (44). Кратко, последовательные разведения тестируемых клеток (от 2×10⁵ до 3×10³) ресуспендировали в 150 мкл полной питательной среды (Myelocult^TM 5100, Stem Cell Technologies), состоящий из альфа-среды с добавлением эмбриональной бычьей сыворотки (12,5 %), лошадиной сыворотки (12,5 %), L-глутамина (2 ммоль), 2-меркаптоэтанола (10^-4 моль), инозита (0,2 ммоль), фолиевой кислоты (20 мкмоль) вместе со свежим раствором гидрокортизона (10^-6 моль) и высевали в 96-луночные плоскодонные планшеты. Для каждой дозы тестируемых клеток высевали от 16 до 22 репликаций. Тестируемые клетки высевались в чашки, содержащие фидерный слой из облученных (8,000 сГи) мышиных клеток М2-10В4 (3 х 10⁴/см², любезно предоставленных Dr. С. Eaves, Terry Fox Laboratory, Vancouver, Canada), полученных путем переноса ретровирусного гена с целью выработки человеческого IL-3 и G-CSF (45). Культуры еженедельно подпитывали путем замены половины среды растущих клеток свежей полной питательной средой. После 5 недель культивирования неадгезивные и адгезивные клетки из индивидуальных лунок, полученные в результате трипсинизации, промывали и совместно анализировали на рост CFC. После периода инкубации от 12 до 14 дней культуры оценивались как положительные (≥ колоний) или отрицательные (отсутствие колоний) и частоту экспрессии LTC-IC подсчитывали с использованием программного обеспечения L-Calc (Stem Cell Technologies). Абсолютные количества циркулирующих LTC-IC оценивали в смешанной культуре (46). Кратко, тестируемые клетки (5-8×10⁶) ресуспендировали в полной питательной среде и высевали в культуры, содержащие фидерный слой из облученных мышиных клеток М2-10В4 (3×10⁴/см²). Через 5 недель культивирования неадгезивные клетки и адгезивные клетки, полученные путем трипсинизации, смешивали, промывали и совместно анализировали на клоногенные клетки. Общее количество клоногенных клеток (а именно, CFU-GEMM плюс BFU-Е плюс CFU-GM), присутствующее в 5-недельной долговременной культуре (LTC), определяет относительный показатель количества LTC-IC, изначально представленных в тестируемой суспензии. Абсолютное количество LTC-IC в крови рассчитывали путем деления общего количества клоногенных клеток на 4, что является средним выходом клоногенных клеток на LTC-IC.

ПРИМЕР 5

Циркулирующие WBC. Введение только rhG-CSF в течение 5 дней вызывало в среднем 5-кратное увеличение средних количеств (±СО) WBC по сравнению с их количеством до введения. Добавление 130 или 260 мкг/кг rhPlGF к rhG-CSF приводило к незначительному увеличению количества WBC, определяемому на 5 день введения.

Таблица 5
Подсчет WBC у макак Резус после введения только rhG-CSF или введения rhPIGF вместе с rhG-CSF Число WBC на мкл крови*   Цикл 1 Цикл 2 Цикл 3 День rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) rhPlGF (130 мкг/кг, в/в, в течение 5 дней rhG-CSF + rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) rhPlGF (260 мкг/кг, в/в, в течение 5 дней) + rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) 1 8708±2458 13498±5514 8370±1585 2 31313±3889 24533±2789 41180±7364 3 40600±6274 35388±2207 44085±6588 4 43055±6562 39440±6744 37960±3598 5 43523±13790 60040±9508 49048±7120 8 14363±4163 23073±9017 17783±5964 10 12145±5421 16398±8314 11150±2915

*У макак Резус (n=4) проводили три цикла мобилизации с 6-недельными перерывами на период выведения. В цикле 1 мобилизацию вызывали введением только rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день), в цикле 2 - совместным введением rhPlGF (130 мкг/кг, в/в, с 1 по 5 день 1-5) и rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день), и в цикле 3 - совместным введением rhPlGF (260 мкг/кг, в/в, и с 1 по 5 день) и rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день). Количество WBC анализировали ежедневно в течение периода введения (от 1 до 5 дня), а также на 3 и 5 дни после прекращения терапии. Данные выражены как средние значения ±СО.

ПРИМЕР 6

Частота экспрессии CFC. По сравнению с исходными значениями, средняя частота экспрессии CFC в крови (на 10⁵ МНК), зарегистрированная на пике, увеличилась в 19, 53 и 52 раза при введении только rhG-CSF, rhG-CSF/rhPlGF (130 мкг/кг) и rhG-CSF/rhPlGF (260 мкг/кг) соответственно. По сравнению с введением только rhG-CSF, совместное введение rhPlGF/rhG-CSF вызвало 2-кратное увеличение частоты экспрессии CFC в пиковый день.

Таблица 6
Частота экспрессии циркулирующих CFC у макак Резус после введения только rhG-CSF или введения rhPlGF вместе с rhG-CSF CFC/10⁵ МНК*   Цикл 1 Цикл 2 Цикл 3 День rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) rhPlGF (130 мкг/кг, в/в, в течение 5 дней rhG-CSF + rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) rhPlGF (260 мкг/кг, в/в, в течение 5 дней) + rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) 1 6±1 4±1 5±3 2 4±2 9±1 19±8 3 9±1 39±13 48±26 4 114±51 213±87 245±151 5 63±26 196±26 261±83 8 66±11 40±11 60±39 10 10±7 19±10 21±18

*У макак Резус (n=4) проводили три цикла мобилизации, с 6-недельными перерывами на период выведения. В цикле 1 мобилизацию вызывали введением только rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день), в цикле 2 - совместным введением rhP1GF (130 мкг/кг, в/в, с 1 по 5 день 1-5) и rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день), и в цикле 3 - совместным введением rhP1GF (260 мкг/кг, в/в, с 1 по 5 день) с rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день). Количество CFC анализировали ежедневно в течение периода введения (от 1 до 5 дня), а также на 3 и 5 дни после прекращения терапии. Данные выражены как средние значения ±СО. CFC включают в себя гранулоцитарно-макрофагальную колониеобразующие единицы (CFU-GM), ранние эритроидные предшественники, образующие «взрывообразные» колонии (BFU-E) и полипотентные колониеобразующие единицы (CFU-Mix). Данные о CFC получены после четырехкратного пассирования проб от каждого животного.

ПРИМЕР 7

Абсолютные значения CFC. Абсолютным количеством циркулирующих в крови CFC является показатель частоты экспрессии CFC, умноженный на общее количество MNC в мл крови. По сравнению с исходными значениями, введение только rhG-CSF, введение rhG-CSF/rhPlGF (130 мкг/кг) и rhG-CSF/rhPlGF (260 мкг/кг) приводило соответственно к 85-, 335 и 358-кратному увеличению CFC. В циклах 2 и 3 пиковые уровни CFC возросли в 4 и 5 раз по сравнению с циклом 1 (отдельное введение rhG-CSF).

Таблица 7
Абсолютные количества циркулирующих CFC у макак Резус после отдельного введения rhG-CSF или введения rhPlGF вместе с rhG-CSF CFC на мл крови*   Цикл 1 Цикл 2 Цикл 3 День rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) rhPlGF (130 мкг/кг, в/в, в течение 5 дней rhG-CSF + rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) rhPlGF (260 мкг/кг, в/в, в течение 5 дней) + rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) 1 134±9 138±38 170±129 2 344±207 724±254 6552±4365 3 472±60 6420±4775 9634±7006 4 11406±4093 32347±14206 53002±25250 5 5397±3074 46283±8287 60777±8563 8 3952±2666 4532±3714 3719±1899 10 224±164 448±168 943±994

*У мака Резус (n=4) проводили три цикла мобилизации с 6-недельными перерывами на период выведения. В цикле 1 мобилизацию вызывали введением только rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день), в цикле 2 - совместным введением rhPlGF (130 мкг/кг, в/в, с 1 по 5 день 1-5) и rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день), и в цикле 3 - совместным введением rhPlGF (260 мкг/кг, в/в, с 1 по 5 день) и rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день). Количество CFC анализировали ежедневно в течение периода введения (от 1 до 5 дня), а также на 3 и 5 дни после прекращения терапии. Данные выражены как средние значения ±СО. CFC включают в себя гранулоцитарно-макрофагальные колониеобразующие единицы (CFU-GM), ранние эритроидные предшественники, образующие «взрывообразные» колонии (BFU-E) и полипотентные колониеобразующие единицы (CFU-Mix). Данные о CFC получены после четырехкратного пассирования проб от каждого животного. Абсолютным количеством циркулирующих в крови CFC является показатель частоты экспрессии CFC, умноженный на общее количество МНК на мл крови.

ПРИМЕР 8

Частота экспрессии HPP-CFC. По сравнению с исходными данными, средние значения частоты экспрессии в крови HPP-СРС (на 10⁵ МНК), зарегистрированные на 5 день мобилизации, возросли в 5 и в 12 раз после введения только rhG-CSF или введения rhG-CSF/rhPlGF (130 мкг/кг) соответственно. По сравнению с отдельным введением rhG-CSF, совместное введение rhPlGF/rhG-CSF вызывало 2-кратное увеличение частоты экспрессии HPP-CFC в пиковый день.

Таблица 8
Частота экспрессии циркулирующих HPP-CFC у макак Резус после введения только rhG-CSF или введения rhPlGF вместе с rhG-CSF HPP-CFC/10⁵ МНК*   Цикл 1 Цикл 2 День rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) rhPlGF (130 мкг/кг, в/в, в течение 5 дней) + rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) 1 4±1 3±1 2 6±1 3±1 3 13±4 11±3 4 15±4 27±10 5 20±9 37±8 8 18±6 6±4 10 6±1 5±4

*У макак Резус (n=4) проводили три цикла мобилизации с 6-недельными перерывами на период выведения. В цикле 1 мобилизацию вызывали введением только rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день), в цикле 2 - совместным введением rhP1GF (130 мкг/кг, в/в, с 1 по 5 день 1-5) и rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день), и в цикле 3 - совместным введением rhPlGF (260 мкг/кг, в/в, с 1 по 5 день) и rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день). Количество HPP-CFC анализировали ежедневно в течение периода введения (от 1 до 5 дня), а также на 3 и 5 дни после прекращения терапии. Данные выражены как средние значения ±СО. Данные о HPP-CFC получены после четырехкратного пассирования проб от каждого животного.

ПРИМЕР 9

Абсолютные значения HPP-CFC. Абсолютное количество в крови HPP-CFC на мл, зарегистрированное на 5 день введения rhG-CSF, было в 17 раз выше, чем значение перед введением. У обезьян, которым вводили объединенный rhG-CSF/rhPlGF (130 мкг/кг), наблюдалось 158-кратное увеличение HPP-CFC по сравнению с исходными данными. В цикле 2 уровень HPP-CFC на 5 день 5-кратно превосходил уровень цикла 1.

Таблица 9
Абсолютные количества циркулирующих HPP-CFC у макак Резус после введения только rhG-CSF или введения rhPlGF вместе с rhG-CSF HPP-CFC на мл крови*   Цикл 1 Цикл 2 День rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) rhPlGF (130 мкг/кг, в/в, в течение 5 дней) + rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) 1 96±17 54±49 2 493±218 258±34 3 683±155 1709±989 4 1521±332 3883±1309 5 1593±405 8557±1142 8 998±541 603±384 10 121±52 121±87

*У макак Резус (n=4) проводили три цикла мобилизации с 6-недельными перерывами на период выведения. В цикле 1 мобилизацию вызывали введением только rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день), в цикле 2 - совместным введением rhPlGF (130 мкг/кг, в/в, с 1 по 5 день 1 - 5) и rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день), и в цикле 3 - совместным введением rhPlGF (260 мкг/кг, в/в, с 1 по 5 день) и rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день). Количество HPP-CFC анализировали ежедневно в течение периода введения (от 1 до 5 дня), а также на 3 и 5 дни после прекращения терапии. Данные выражены как средние значения ±СО. Данные о HPP-CFC получены после четырехкратного пассирования проб от каждого животного. Абсолютным количеством циркулирующих в крови HPP-CFC является показатель частоты экспрессии HPP-CFC, умноженный на общее количество МНК на мл крови.

ПРИМЕР 10

Частота экспрессии LTC-IC. Анализ частоты экспрессии LTC-IC путем серийного разведения показал, что совместное введение rhPlGF (130 мкг/кг) и rhG-CSF в среднем приводит к увеличению частоты экспрессии LTC-IC в 11 раз (1 в 5829 против 1 в 64064 клетках), по сравнению с введением только rhG-CSF.

Таблица 10
Частота экспрессии циркулирующих LTC-IC у макак Резус при 5-дневном курсе изолированного введения rhG-CSF или введения rhPlGF вместе с rhG-CSF Животное № Режим мобилизации Частота экспрессии LTC-IC (значение)* Доверительный интервал (CI) 95% LTC-IC на 10⁵ MN Нижняя частота Верхняя частота 1 rhG-CSF 1/84265 1/69209 1/102598 1,2 2 rhG-CSF 1/65835 1/54341 1/79761 1,5 3 rhG-CSF не установлено** не установлено не установлено не установлено 4 rhG-CSF 1/42091 1/34837 1/50854 2,4 1 rhPlGF (130 мкг/кг) + rhG-CSF 1/4009 1/5977 1/2689 24,9 2 rhPlGF (130 мкг/кг) + rhG-CSF 1/7562 1/11100 1/5152 13,2 3 rhPIGF (130 мкг/кг) + rhG-CSF не установлено не установлено не установлено не установлено 4 rhPlGF (130 мкг/кг) + rhG-CSF 1/5916 1/8725 1/4011 16,9

*Частоту экспрессии LTC-IC анализировали при серийном разведении с использованием мышиных клеток линии М2-10В4 в качестве стромального слоя. Пробы крови отбирали на 5 день мобилизации. Последовательные разведения тестируемых клеток (от 2×10⁵ до 3×10³) культивировали в течение 5 недель, и высевали от 16 до 22 репликаций для каждой дозы тестируемых клеток. Через 5 недель неадгезивные и адгезивные клетки из индивидуальных лунок анализировали на клоногенные клетки и рассчитывали частоту экспрессии LTC-IC с помощью статистики Пуассона и принципа максимального правдоподобия.

ПРИМЕР 11

Абсолютные значения LTC-IC. После изолированного введения rhG-CSF абсолютные количества циркулирующих LTC-IC возрастали в 53 раза на 4 день введения по сравнению с исходными данными. Совместное введение rhG-CSF/rhPlGF (130 мкг/кг) увеличило количество LTC-IC в 389 раз по сравнению с данными перед введением и в 15 раз - по сравнению с введением только rhG-CSF.

Таблица 11
Абсолютные количества циркулирующих LTC-IC у макак Резус после введения только rhG-CSF или введения rhPlGF вместе с rhG-CSF   LTC-IC на мл крови*   Цикл 1 Цикл 2 День rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) rhPlGF (130 мкг/кг, в/в, в течение 5 дней) + rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, в течение 5 дней) 1 4±7 8±5 2 92±43 56±20 3 111±30 624±340 4 211±41 742±176 5 130±25 3,115±988 8 63±22 533±270 10 6±2 112±40

*У макак Резус (n=4) проводили три цикла мобилизации с 6-недельными перерывами на период выведения. В цикле 1 мобилизацию вызывали введением только rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день), в цикле 2 - совместным введением rhP1GF (130 мкг/кг, в/в, с 1 по 5 день 1-5) и rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день), и в цикле 3 - совместным введением rhPlGF (260 мкг/кг, в/в, с 1 по 5 день) и rhG-CSF (100 мкг/кг/в день, п/к, с 1 по 5 день). Количество LTC-IC анализировали ежедневно в течение периода введения (от 1 до 5 дня), а также на 3 и 5 дни после прекращения терапии. Данные выражены как средние значения ±СО и получены после четырехкратного пассирования проб от каждого животного на каждую временную точку. Абсолютное количество циркулирующих LTC-IC анализировали в смешанной культуре. Тестируемые клетки (5-8×10⁶) высевали в культуры, содержащие фидерный слой из облученных мышиных клеток М2-10В4. После 5 недель культивирования неадгезивные клетки и адгезивные клетки, полученные путем трипсинизации, смешивали, промывали и совместно анализировали на клоногенные клетки. Общее количество клоногенных клеток (а именно, CFU-Mix плюс BFU-Е плюс CFU-GM), представленных в 5-недельном LTC, определяет относительный показатель количества LTC-IC, изначально представленных в тестируемой суспензии. Абсолютное количество циркулирующих LTC-IC в крови определяется частотой экспрессии LTC-IC, умноженной на общее количество МНК на мл крови.

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Gianni AM. High-dose chemotherapy and autotransplants: a time for guidelines. Ann Oncol. 1997;8:933-5.

2. Demirer T, Bensinger WI, Buckner CD. Peripheral blood stem cell mobilization for high-dose chemotherapy. J Hematother. 1999;8:103-13.

3. Gianni AM, Bregni M, Siena S, et al. High-dose chemotherapy and autologous bone marrow transplantation compared with MACOP-B in aggressive B-cell lymphoma. N Engl J Med. 1997;336:1290-7.

4. Ferme C, Mounier N, Divine M, et al. Intensive salvage therapy with high-dose chemotherapy for patients with advanced Hodgkin's disease in relapse or failure after initial chemotherapy: results of the Groupe d'Etudes des Lymphomes de l'Adulte H89 Trial. J Clin Oncol. 2002;20:467-75.

5. Barlogie B. High-dose therapy and innovative approaches to treatment of multiple myeloma. Semin Hematol. 2001;38(2 Suppi 3):21-7.

6. Korbling M, Przepiorka D, Huh YO, et al. Allogeneic blood stem cell transplantation for refractory leukemia and lymphoma: potential advantage of blood over marrow allografts. Blood. 1995;85:1659-1665.

7. Schmitz N, Bacigalupo A, Hasenclever D, et al. Allogeneic bone marrow transplantation vs filgrastim-mobilised peripheral blood progenitor cell transplantation in patients with early leukaemia: first results of a randomised multicentre trial of the European Group for Blood and Marrow Transplantation. Bone Marrow Transplant. 1998;21:995-1003.

8. Appelbaum FR. Choosing the source of stem cells for allogeneic transplantation: no longer a peripheral issue. Blood. 1999,94:381-383.

9. Bensinger WI, Martin PJ, Storer B, et al. Transplantation of bone marrow as compared with peripheral-blood cells from HLA-identical relatives in patients with hematologic cancers. N Engi J Med. 2001;344:175-181.

10. Anderlini P, Korbling M, Dale D, et al. Allogeneic blood stem cell transplantation: considerations for donors. Blood. 1997,90:903-908.

11. Aversa F, Tabilio A, Terenzi A, et al. Successful engraftment of T-cell-depleted haploidentical "three-loci" incompatible transplants in leukemia patients by addition of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor-mobilized peripheral blood progenitor cells to bone marrow inoculum. Blood. 1994;84:3948-3955.

12. Haas R, Mohle R, Fruhauf S, et al. Patient characteristics associated with successful mobilizing and autografting of peripheral blood progenitor cells in malignant lymphoma. Blood. 1994;83:3787-94.

13. Bensinger WI, Longin K, Appelbaum F, et al. Peripheral blood stem cells (PBSCs) collected after recombinant granulocyte colony stimulating factor (rhG-CSF): an analysis of factors correlating with the tempo of engraftment after transplantation. Br J Haematol. 1994;87:825-31.

14. Watts MJ, Sullivan AM, Jamieson E, et al. Progenitor-cell mobilization after low-dose cyclophosphamide and granulocyte colony-stimulating factor: an analysis of progenitor-cell quantity and quality and factors predicting for these parameters in 101 pretreated patients with malignant lymphoma. J Clin Oncol. 1997;15:535-46.

15. Matsunaga T, Sakamaki S, Kohgo Y, Ohi S, Hirayama Y, Niitsu Y. Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor can mobilize sufficient amounts of peripheral blood stem cells in healthy volunteers for allogeneic transplantation. Bone Marrow Transplant. 1993;11:103-108.

16. Kroger N, Renges H, Sonnenberg S, et al. Stem cell mobilisation with 16 µg/kg vs 10 µg/kg of G-CSF for allogeneic transplantation in healthy donors. Bone Marrow Transplant. 2002;29:727-730.

17. Basara N, Schmetzer B, Blau IW, et al. Lenograstim-mobilized peripheral blood progenitor cells in volunteer donors: an open label randomized split dose escalating study. Bone Marrow Transplant. 2000;25:371-376.

18. Engelhardt M, Bertz H, Afting M, Waller CF, Finke J. High-versus standard-dose filgrastim (rhG-CSF) for mobilization of peripheral-blood progenitor cells from allogeneic donors and CD34+ immunoselection. J Clin Oncol. 1999;17:2160-2172.

19. Siena S, Schiavo R, Pedrazzoli P, Carlo-Stella C. Therapeutic relevance of CD34+ cell dose in blood cell transplantation for cancer therapy. J Clin Oncol. 2000,18:1360-77.

20. Dreger P, Kloss M, Petersen B, et al. Autologous progenitor cell transplantation: prior exposure to stem cell-toxic drugs determines yield and engraftment of peripheral blood progenitor cell but not of bone marrow grafts. Blood. 1995;86:3970-8.

21. Weaver CH, Hazelton B, Birch R, et al. An analysis of engraftment kinetics as a function of the CD34 content of peripheral blood progenitor cell collections in 692 patients after the administration of myeloablative chemotherapy. Blood. 1995;86:3961-9.

22. Tarella C, Di Nicola M, Caracciolo D. High-dose ara-C with autologous peripheral blood progenitor cell support induces a marked progenitor cell mobilization: an indication for patients at risk for low mobilization. Bone Marrow Transplant. 2002;30:725-32.

23. Anderlini P, Przepiorka D, Seong D, et al. Clinical toxicity and laboratory effects of granulocyte-colony-stimulating factor (filgrastim) mobilization and blood stem cell apheresis from normal donors, and analysis of charges for the procedures. Transfusion. 1996;36:590-595.

24. Anderlini P, Przepiorka D, Huh Y, et al. Duration of filgrastim mobilization and apheresis yield of CD34+ progenitor cells and lymphoid subsets in normal donors for allogeneic transplantation. Br J Haematol. 1996;93:940-942.

25. Grigg AP, Roberts AW, Raunow H, et al. Optimizing dose and scheduling of filgrastim (granulocyte colony-stimulating factor) for mobilization and collection of peripheral blood progenitor cells in normal volunteers. Blood. 1995,86:4437-4445.

26. Aversa F, Tabilio A, Velardi A, et al. Treatment of high-risk acute leukemia with T-cell-depleted stem cells from related donors with one fully mismatched HLA haplotype. N Engl J Med. 1998;339:1186-1193.

27. Miflin G, Charley C, Stainer C, Anderson S, Hunter A, Russell N. Stem cell mobilization in normal donors for allogeneic transplantation: analysis of safety and factors affecting efficacy. Br J Haematol. 1996;95:345-348.

28. Anderlini P, Przepiorka D, Seong C, et al. Factors affecting mobilization of CD34+ cells in normal donors treated with filgrastim. Transfusion. 1997;37:507-512.

29. de la Rubia J, Arbona C, de Arriba F, et al. Analysis of factors associated with low peripheral blood progenitor cell collection in normal donors. Transfusion. 2002;42:4-9.

30. Craddock CF, Nakamoto B, Andrews RG, Priestley GV, Papayannopoulou T. Antibodies to VLA4 integrin mobilize long-term repopulating cells and augment cytokine-induced mobilization in primates and mice. Blood. 1997,90:4779-88.

31. King AG, Horowitz D, Dillon SB, et al. Rapid mobilization of murine hematopoietic stem cells with enhanced engraftment properties and evaluation of hematopoietic progenitor cell mobilization in rhesus monkeys by a single injection of SB-251353, a specific truncated form of the human CXC chemokine GROβ. Blood. 2001,97:1534-42.

32. Pruijt JF, van Kooyk Y, Figdor CG, Lindley IJ, Willemze R, Fibbe WE. Anti-LFA-1 blocking antibodies prevent mobilization of hematopoietic progenitorcells induced by interleukin-8. Blood. 1998;91:4099-105.

33. Carlo-Stella C, Di Nicola M, Magni M, et al. Defibrotide in combination with granulocyte colony-stimulating factor significantly enhances the mobilization of primitive and committed peripheral blood progenitor cells in mice. Cancer Res. 2002;62:6152-7.

34. Koc ON, Gerson SL, Cooper BW, et al. Randomized cross-over trial of progenitor-cell mobilization: high-dose cyclophosphamide plus granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) versus granulocyte-macrophage colony-stimulating factor plus G-CSF. J Clin Oncol. 2000; 18:1824-30.

35. Rosenfeld CS, Bolwell B, LeFever A, et al. Comparison of four cytokine regimens for mobilization of peripheral blood stem cells: IL-3 alone and combined with GM-CSF or G-CSF. Bone Marrow Transplant. 1996;17): 179-83.

36. Bishop MR, Jackson JD, O'Kane-Murphy B, et al. Phase I trial of recombinant fusion protein PIXY321 for mobilization of peripheral-blood cells. J Clin Oncol. 1996;14:2521-6.

37. Shpall EJ, Wheeler CA, Turner SA, et al. A randomized phase 3 study of peripheral blood progenitor cell mobilization with stem cell factor and filgrastim in high-risk breast cancer patients. Blood. 1999;93:2491-501.

38. Facon T, Harousseau JL, Maloisel F, et al. Stem cell factor in combination with filgrastim after chemotherapy improves peripheral blood progenitor cell yield and reduces apheresis requirements in multiple myeloma patients: a randomized, controlled trial. Blood. 1999;94:1218-25.

39. Brasel K, McKenna HJ, Charrier K, Morrissey PJ, Williams DE, Lyman SD. Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice. Blood. 1997;90:3781-8.

40. Hattori K, Heissig B, Wu Y, et al. Placental growth factor reconstitute hematopoiesis by recruiting VEGFR1+ stem cells from bone marrow microenvironment. Nature Med. 2002; 8:841-9.

41. MacVittie TJ, Farese AM, Davis TA, Lind LB, McKeam JP. Myelopoietin, a chimeric agonist of human interleukin 3 and granulocyte colony-stimulating factor receptors, mobilizes CD34+ cells that rapidly engraft lethally x-irradiated nonhuman primates. Exp Hematol. 1999; 27:1557-68.

42. Carlo-Stella C, Di Nicola M, Longoni P, Milani R, Milanesi M, Guidetti A, Haanstra K, Jonker M, Cleris L, Magni M, Formelli F, Gianni AM. Mobilization of primitive and committed hematopoietic progenitors in nonhuman primates treated with defibrotide and recombinant human granulocyte colony-stimulating factor. Exp Hematol. 2004; 32:68-75.

43. Craddock CF, Nakamoto B, Andrews RG, Priestley GV, Papayannopoulou T. Antibodies to VLA-4 integrin mobilize long-term repopulating cells and augment cytokine-induced mobilization in primates and mice. Blood. 1997; 90:4779-88.

44. Lemieux ME, Rebel VI, Lansdorp PM, Eaves CJ. Characterization and purification of a primitive hematopoietic cell type in adult mouse marrow capable of lymphomyeloid differentiation in long-term marrow "switch" cultures. Blood. 1995;86:1339-1347.

45. Sutherland HJ, Eaves CJ, Lansdorp PM, Tacker JD, Hogge DE. Differential regulation of primitive human hematopoietic cells in long-term cultures maintained on genetically engineered murine stromal cells. Blood. 1991;78:666-72.

46. Carlo-Stella C, Regazzi E, Sammarelli G, et al. Effects of the tyrosine kinase inhibitor AG957 and an Anti-Fas receptor antibody on CD34+ chronic myelogenous leukemia progenitor cells. Blood. 1999;93:3973-82.

47. Sutherland HJ, Eaves CJ, Eaves AC, Dragowska AC, Lansdorp PM. Characterization and partial purification of human marrow cells capable of initiating long-term hematopoiesis in vitro. Blood. 1989; 74:1563-70.

Изобретение относится к медицине и биохимии и касается комбинированного фармацевтического препарата, содержащего G-CSF и P1GF в качестве активных веществ. Изобретение обеспечивает синергический эффект в мобилизации стволовых клеток крови у пациента или у нуждающегося в этом субъекта. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 11 табл.

1. Комбинированный фармацевтический препарат, содержащий G-CSF и P1GF в качестве активных веществ, используемый для мобилизации стволовых клеток крови у пациента или у нуждающегося в этом субъекта.

2. Комбинированный препарат по п.1, где G-CSF и P1GF вводятся указанному пациенту или субъекту одновременно или раздельно.

3. Комбинированный препарат по п.1 или 2 для парентерального введения.

4. Комбинированный препарат по п.3, содержащий рекомбинантный hG-CSF и rhPlGF.

5. Комбинированный препарат по п.4, содержащий от 1 до 150 мкг/кг G-CSF и от 10 до 300 мкг/кг P1GF.

6. Применение комбинации G-CSF и P1GF в изготовлении фармацевтической композиции для лечения состояний, нарушений или заболеваний, при которых необходима мобилизация стволовых клеток крови.

7. Применение по п.6 в изготовлении парентеральной композиции.

8. Применение по п.6, где указанные G-CSF и P1GF представляют собой рекомбинантный человеческий G-CSF (rhG-CSF) и рекомбинантный человеческий P1GF (rhPlGF).

9. Применение по п.6, где указанные состояния, нарушения или заболевания включают в себя органную или клеточную трансплантацию и радиохимиотерапию опухолей, в частности, аутологичную или аллогенную трансплантацию стволовых клеток у пациентов с неходжкинской лимфомой (НХЛ), рецидивом ходжкинской лимфомы (ХЛ), множественной миеломой или находящихся на стадии восстановления после миелосупрессивной химиотерапии.

10. Применение по п.6, где фармацевтическая композиция обеспечивает 10 мкг/кг G-CSF и 130 мг/кг P1GF ежедневно.