СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУР МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ЛИПОАСПИРАТА Российский патент 2009 года по МПК C12N5/08 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при получении культур стволовых клеток для различных целей.

С учетом возрастания области применения стволовых клеток перед цитологами достаточно остро стоит проблема получения в короткий временной период требуемого количества мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток с низкой гетерогенностью и высокой жизнеспособностью, поскольку именно такие клетки необходимы для решения практических задач.

Стромальные костно-мозговые клетки-предшественники, называемые также мезенхимальными стволовыми клетками (МСК), могут быть выделены из различных тканей. Они представляют собой малочисленную популяцию клеток, характеризующихся большим пролиферативным потенциалом, способных к самоподдержанию с сохранением недифференцированного состояния, а также обладающих возможностью дифференцироваться в различные клеточные типы под действием определенных стимулов. Способность МСК дифференцироваться, по крайней мере, в клетки тканей мезенхимального происхождения лежит в основе их репаративного потенциала.

До настоящего времени костный мозг рассматривался как главный источник стволовых клеток взрослого организма. Костный мозг содержит гемопоэтические стволовые клетки и их более коммитированные потомки, строму, а также так называемые мезенхимальные стромальные клетки или клетки-предшественники взрослого организма (МСК) (Caplan AI. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 1991 #9 Vol.5, p.641-650; Friedenstein AJ. Precursor cells of mechanocytes. Int. Rev. Cytol. 1976 #47, p.327-359).

Известно, что МСК - это малочисленная популяция клеток, которые обладают способностью к самоподдержанию, могут длительно пролиферировать вне организма и обладают способностью к дифференцировке в различные клеточные типы, такие как адипо- и хондроциты, остеобласты, миоциты, нейроны. Сейчас доказано существование МСК не только в костном мозге, но и практически во всех тканях организма, например в коже, жировой ткани, эпителии тонкого кишечника и др. (Zuk, P.A., Zhu, M., Mizuno H., et al., Multiliniage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. // Tissue Eng. - 2001-Vol.7 - P. 211-226; Zuk PA, Zhu, M., Mizuno H. et al Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. // Molecular biology of the cell - 2002 - Vol.13 - P.4279-4295 и др.).

Известен, например, способ выращивания человеческих мезенхимальных стволовых клеток, взятых из крови, в котором одним из условий является повышенное количество СО₂ (патент US 7060494 от 13.06.2006, класс 435/366, C12N 5/00).

Жировая ткань рассматривается как одна из альтернатив костному мозгу для получения МСК и последующего их применения в терапевтических целях. Подкожная жировая клетчатка, как и костный мозг, является производным мезенхимы и содержит строму, которая может быть легко изолирована. К тому же процедура взятия жировой ткани является значительно менее травматичной и переносится пациентами значительно легче, чем пункция костного мозга. Многими исследователями, независимо друг от друга показано, что клетки, выделяемые при ферментативной обработке жировой ткани и последующем культивировании in vitro, способны дифференцироваться в различные клеточные типы под воздействием химических стимулов (Zuk PA, Zhu, M., Mizuno H. et al Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. // Molecular biology of the cell - 2002 - Vol.13 - P. 4279-4295; Katz AJ, Tholpady A, Tholpady SS, Shang H, Ogle RC. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells. Stem Cells. 2005 # 23 Vol.3, p.412-423). Полученные данные свидетельствуют о том, что МСК, выделенные из жировой ткани и культивируемые in vitro, могут быть использованы в регенеративной медицине. В то же время методы выделения МСК во многих лабораториях различаются. Большинство исследователей для выделения МСК из жировой ткани используют методику, предложенную в работе Ryden (Rydén M, Dicker A, Götherström C, Aström G, Tammik C, Amer P, Le Blanc K. Functional characterization of human mesenchymal stem cell-derived adipocytes. Biochem Biophys Res Commun. 2003 #311 Vol.2. p391-397), которая заключается в измельчении ткани, обработке ее коллагеназой, нескольких последовательных центрифугированиях и адгезии полученного клеточного осадка на пластике. Получаемые при выделении из жира клетки называют мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками-предшественниками, выделенными из липоаспирата или жировой ткани (далее - лМСК). Возможное использование лМСК в регенеративной медицине ставит перед исследователями некоторые проблемы - как за меньший период времени культивирования МСК вне организма человека нарастить достаточную для использования клеточную массу.

Авторами данного изобретения была решена задача получения лМСК в условиях действия пониженного (до 5%) содержания кислорода на пролиферацию, жизнеспособность и экспрессию маркеров клеток-предшественников, выделенных из липоаспирата человека, при постоянном культивировании.

Техническим результатом является создание нового способа, расширяющего арсенал средств получения мезенхимальных стромальных клеток при повышении их выхода с сохранением их фенотипа и высокой жизнеспособности.

Поставленная задача решена с помощью способа получения культур мезенхимальных стромальных клеток человека, выделенных из липоаспирата, включающего выделение клеток-предшественников путем измельчения ткани, обработки ее коллагеназой, нескольких последовательных центрифугирований и адгезии полученного клеточного осадка на пластике и последующее культивирование до получения целевой клеточной культуры, культивирование от 4 до 10 дней в условиях гипоксии с содержанием кислорода не менее 5%, при этом используют клетки от 1-го до 2-го пассажей, после чего определяют количество живых, некротических и апоптотических клеток и проводят анализ фенотипа мезенхимальных стромальных клеток путем их идентификации с помощью набора моноклональных гематопоэтических и эндотелиальных антител CD31, CD34, CD62L, CD62E, CD62P, CD117(c-kit), HLA-DR, CD9, CD54, CD71, CD90, CD 105, HLA-ABC, виментин, которые являются маркерами, характерными для мезенхимальных стромальных клеток-предшественников.

В процессе проведенных исследований авторами было установлено, что на ранних этапах культивирования МСК, выделенных из липоаспирата, также как и из костного мозга, в условиях пониженного содержания кислорода (5% O₂) происходит значительная стимуляция пролиферации клеток-предшественников.

Кроме того, неожиданно авторами было обнаружено, что культивирование стромальных клеток-предшественников, выделенных из липоаспирата, от 4 до 10 суток при использовании 1-2 пассажей в условиях гипоксии не только ускоряет пролиферацию клеток, но и приводит к снижению гетерогенности культуры, уменьшению количества апоптотических и некротических клеток при повышении ее пролиферативной активности и жизнеспособности клеток и при сохранении фенотипа и дифференцировочного потенциала, т.е. по сути нами была решена проблема ускоренного получения культур лМСК с низкой гетерогенностью и высокой жизнеспособностью.

Способ осуществляют следующим образом.

Липоаспират получали после процедуры липосакции у пациентов, обратившихся в специализированную клинику. Материал до выделения хранили в холодильнике при 4°С.

Выделение лМСК из липоаспирата и получение первичной культуры проводили с помощью следующих средств.

Материалы:

Пробирки стерильные, 50 мл (Nunc, Дания)

Пипетки стерильные, 10 и 25 мл (Nunc, Дания)

Клеточный фильтр, стерильный, 100 нм (Nunc, Дания)

Чашки Петри, 60 и 90 мм, стерильные, (Nunc, Дания)

Флаконы культуральные, 25 см² и 75 см², (Nunc, Дания)

Пробирки нестерильные для проточного цитофлуориметра

Наконечники стерильные на 200-1000 мкл (Eppendorf, Германия)

Ростовая среда: DMEM с низким содержанием глюкозы, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл

Амфотерицин В 50 мкг/мл, L-глютамин 2 мМ, натрия бикарбонат 1 г/л

Сыворотка фетальная телячья (FBS) (Hyclone, США)

Трипсин-EDTA 0,25-0,04% (Gibco, UK)

D-PBS (Gibco, UK)

Коллагеназа IА (Sigma-Aldrich, США)

Полная среда: ростовая среда+10% FBS

Оборудование

Центрифуга Eppendorf 5804R

Ламинарный шкаф (Сампо, Россия)

Водяная баня (Elmi, Латвия)

Весы (Ohaus, Германия)

Электрическая пипетка

Пипетки автоматические, набор (Eppendorf, Германия)

Микроскоп инвертированный, фазово-контрастный (Leica, Германия)

Проточный цитофлуориметр BeckmanCoulter Epix XL (BeckmanCoulter, США)

CO₂-инкубатор (Sanyo, Япония)

Стандартные условия культивирования: 5% CO₂ + 95% воздуха, 37°С, 100% влажность.

В 50 мл пробирку помещали липоаспират (примерно 1/3 от объема пробирки) и долить до 50 мл D-PBS, аккуратно встряхивали 5 раз.

Центрифугировали 5 минут при 1500 оборотов в минуту, при 18°С. На дне пробирки находится осадок из эритроцитов, над осадком - слой буфера и затем липоаспират. Липоаспират сверху покрыт слоем жира из разрушенных адипоцитов.

Осторожно перенесли липоаспират в чистую стерильную пробирку (50 мл) и повторно отмыли ткань при следующих условиях - 10 минут, 1000 об/мин, 18°С.

Осторожно перенесли липоаспират в предварительно взвешенную стерильную пробирку (50 мл), взвесили и добавили раствор коллагеназы IA. Приготовили 0,15% раствор коллагеназы.

В пробирку с предварительно взвешенным липоаспиратом добавили раствор фермента до конечной концентрации 0,075%.

Инкубировали на водяной бане при 37°С, 30 минут, периодически встряхивали - 1 раз в 5 минут.

Инактивировали коллагеназу IA добавлением полной среды до 50 мл.

Центрифугировали 5 минут, 1500 об/мин, 18°С.

Супернатант слили и осадок ресуспендировали в 10 мл полной среды, довести до 50 мл ростовой средой

Центрифугировали 5 минут, 1500 об/мин, 18°С.

Супернатант слили и осадок ресуспендировали в 10 мл полной среды.

Клеточный фильтр поместили на 50 мл пробирку и суспензию клеток и остатков ткани пропустили через него. В пробирку добавили ростовую среду до 50 мл.

Центрифугировали 10 минут, 1000 об/мин, 18°С.

Супернатант слили, осадок ресуспендировали в 10 мл ростовой среды.

Отобрали аликвоту среды с клетками и подсчитали количество ядросодержащих клеток в гемацитометре.

Развели клеточную суспензию из расчета, чтобы плотность посадки составляла 2×105-300×105 см².

Посадили клетки в культуральные флаконы, оставили в СО₂-инкубаторе на 24 часа.

Отобрали надосадочную жидкость с неприкрепившимися клетками и 2 раза промыть D-PBS.

Добавили нужное количество полной среды.

Меняли среду через 2 дня на 3.

Контролировали рост клеток под микроскопом.

Пассировали клетки при достижении 70-80% конфлуентности.

Моделирование гипоксии in vitro проводили следующим образом. Часть клеток сразу после выделения помещали в мультигазовый инкубатор Sanyo (Япония), где поддерживалась концентрация кислорода 5%. Культура клеток постоянно находилась в условиях пониженного содержания кислорода, и период нормоксии составлял не более 30 минут при замене среды.

После чего была изучена пролиферативная активность лМСК, выделенных из липоаспирата человека.

Для анализа пролиферации клеток в культуре использовали метод видеомикроскопии. С помощью микроскопа Leica DM IL (Leica, Германия), снабженного цветной видеокамерой, изображение передавалось на компьютер и впоследствии анализировалось. Оцифровка лМСК, культивируемых в газовой среде при стандартном (21% O₂) и пониженном (5% O₂) содержании кислорода, проводили через каждые 24 часа, начиная с первого дня после посадки и до момента следующего пассирования и используя объектив ×10. На дно каждого флакона снаружи были нанесены маркерные точки, для того чтобы проводить фотографирование одних и тех же полей зрения на разных сроках культивирования. В каждом флаконе фотографировали по 10 стационарных полей зрения, площадью 1,0 мм². На полученных изображениях клетки подсчитывали с помощью программы анализа изображения SigmaScan Pro 5.0 Image Analysis Software (SPSS Inc, США).

Оценку эффективности прикрепления культивируемых клеток проводили следующим образом: при пассировании клеток плотность посадки составляла в среднем 3000 клеток на см². Эффективность прикрепления оценивали по количеству прикрепленных клеток на 1 см² через 24 часа после посадки.

Была проведена оценка жизнеспособности лМСК человека.

Жизнеспособность лМСК оценивали с помощью набора ANNEXIN V-FITC-PI (Immunotech, Франция) - по стандартной методике на проточном цитофлуориметре. Метод основан на одновременном использовании пропидия йодида (PI), проникающего в поврежденные клетки и взаимодействующего с ДНК, и аннексина V (Annexin V меченый FITC), аффинного к фосфатидилсерину, который в процессе апоптоза локализуется на клеточной поверхности и формирует один из специфичных сигналов для распознавания апоптотических клеток. Использование пары AnnexinV-FITC - PI позволяет идентифицировать живые, некротические и апоптотические клетки.

Для анализа отбирали 2×105 клеток, ресуспендировали в фосфатном буфере и повторно центрифугировали при 1000 оборотов в минуту, в течение 5 минут. Полученный клеточный осадок ресуспендировали в ледяном связывающем буфере, добавляли растворы Annexin V-FITC и PI, и инкубировали в течение 10 минут при t=+4°С, после чего объем пробы доводили до 500 мкл связывающим буфером и проводили анализ на проточном цитофлуориметре Epics XL (Beckman Coulter, США). Анализировали не менее 10000 событий.

Жизнеспособность клеток оценивали в конце пассажа в суспензии клеток, приготовленных для субкультивирования.

Анализ фенотипа культивируемых лМСК проведен следующим образом.

Для идентификации выделенных и культивируемых клеток, подтверждения статуса лМСК использовали набор моноклональных антител фирмы Beckman Coulter - гематопоэтические и эндотелиальные (CD31, CD34, CD62L, CD62E, CD62P, CD117(c-kit), HLA-DR) и также антитела к CD9, CD54, CD71, CD90, CD105, HLA-ABC, виментину, которые являются маркерами, характерными для мезенхимальных стромальных клеток-предшественников. В качестве изотипического контроля к антителам использовались FITC- и РЕ-меченые IgG соответствующего класса. Для анализа выбранных маркеров клетки после отбора среды культивирования промывали фосфатным буфером, снимали раствором трипсин-ЭДТА и ингибировали фермент избытком DMEM с 10% FBS. Полученную суспензию центрифугировали (1000 об/мин, 5 минут), после чего супернатант сливали, ресуспендировали в 1 мл фосфатного буфера с 1% FBS, после чего проводили подсчет клеток в гемацитометре и готовили пробы с концентрацией клеток не менее 105 в пробе. Клетки перемешивали и инкубировали с антиген-специфичными антителами или изотипического контроля в течение 20 минут при t=+4°C. После чего объем пробы доводили до 800 мкл фосфатным буфером и проводили фенотипирование на проточном цитофлуориметре EPIX XL (Beckman Coulter, США). При двойном окрашивании первичными антителами окрашивали по приведенной ранее схеме, затем отмывали от несвязавшейся метки (центрифугирование в избытке фосфатного буфера с 1% FBS, 1000 rpm, 5 минут), добавляли вторичные FITC- или РЕ-антитела и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре, после чего доводили объем пробы до 800 мкл и проводили фенотипирование. Иммунофенотипирование проводили в нескольких повторах, для каждого маркера анализировали не менее 10000 клеток.

Таблицы 1-11 поясняют предлагаемое изобретение

Пример 1.

Выделение и культивирование лМСК

Вес липоаспирата - 49 г.

Время после липосакции - 72 часа.

Количество ядросодержащих клеток - 4,2х106.

Сразу после выделения все клетки были разделены на 2 части и помещены в условия нормоксии (95% воздуха, 5% СО₂, N-клетки) или гипоксии (5% О₂, 5% CO₂, 90% N₂, Нур-клетки).

Время до первой отмывки - 24 часа.

Первое пассирование - через 4 дня.

Количество пассажей - 2.

Пролиферативная активность лМСК.

Определение плотности посадки на 1 пассаже было затруднено в связи с тем, что при пересевании клеток из первичной культуры образуется большое количество клеточных агрегатов и трудно получить равномерное распределение клеток на подложке. Эффективность прикрепления на 2 пассаже составляла 80-90% от плотности посадки и практически не различалась в N- и Нур-клетках.

На втором пассаже проводили определение пролиферативной активности лМСК, как описано выше. На основании полученных данных были построены кривые пролиферации, характеризующие рост лМСК в течение всего пассажа.

В табл. 1 приведены данные по клеточному приросту за все время культивирования во 2 пассаже. Мы не обнаружили увеличения количества клеток, культивируемых в условиях нормоксии, в то время как в условиях гипоксии прирост количества клеток был весьма значительным (табл. 1).

Характер роста клеток в Нур-культурах описывался типичной кривой пролиферации: лаг-фаза в течение 48-72 часов, которая сменялась фазой роста (фиг.1).

Количество удвоений популяции Нур-клеток значительно превышало аналогичные показатели N-клеток, а время удвоения Нур-клеток было существенно меньше (табл.2).

Пример 2.

Вес липоаспирата - 77 г.

Время после липосакции - 20 часов.

Количество ядросодержащих клеток - 18,8×106.

Время до первой отмывки - 24 часа.

Первое пассирование - через 7 дней.

После трипсинизации клеток первичной культуры в суспензии образовывалось большое количество клеточных конгломератов, которые трудно поддавались ресуспендированию, в связи с этим плотность посева 1 пассажа была выше, чем при последующем субкультивировании. Эффективность прикрепления N- и Нур-клеток достоверно не отличалась и составляла около 70%.

В 1-3 день культивирования как в N-, так и Нур-культурах не обнаружено достоверного увеличения количества клеток. После 3 дней культивирования мы наблюдали увеличение количества клеток в обеих культурах, причем количество клеток в гипоксии было значительно больше, чем в нормоксии. Прирост N-клеток составил 540% за 8 дней культивирования, а Нур-клеток - 1290% за то же время (табл.3).

Характер кривой клеточной пролиферации был сходным в N- и Нур-культурах. Лаг-фаза наблюдалась в течение 72-96 часов, после чего начиналась фаза роста (фиг.2).

Оценка жизнеспособности лМСК, культивируемых в условиях гипоксии (5% O₂) и нормоксии (20% O₂), показала, что различия в содержании O₂ не влияют на жизнеспособность клеток, которая остается высокой (90+3%) вне зависимости от выбранной модели культивирования (табл.5).

Пример 3.

Вес липоаспирата - 30 г.

Время после липосакции - 24 часа.

Количество ядросодержащих клеток - 4,0×10⁶.

Время до первой отмывки - 24 часа.

Первое пассирование - через 7 дней.

Пролиферативную активность и жизнеспособность лМСК оценивали на 2 пассаже. Показано, что культивирование клеток в условиях гипоксии стимулировало их пролиферативную активность (табл.6). Количество клеточных удвоений в культуре, постоянно находившейся в условиях пониженного содержания кислорода, было в 2 раза выше, а время удвоения - в 2 раза меньше по сравнению с лМСК в стандартных условиях культивирования (табл.7).

Культивирование в условиях пониженного содержания кислорода (5% Oz) не влияло на жизнеспособность лМСК и составляло 95±0,1% как в нормоксических, так и в гипоксических условиях (табл.8).

Приведенные результаты позволяют сделать вывод о том, что во всех исследованных культурах лМСК снижение содержания кислорода в среде приводило к увеличению пролиферативной активности. Время удвоения клеток в Нур-культурах было значительно ниже, а количество клеточных удвоений за то же время больше, чем в N-культурах во всех трех выделениях.

Кривая клеточной пролиферации как для N-, так и для Нур-клеток имела стандартный вид: лаг-фаза в течение 1-4 дней, которая сменялась фазой роста.

Жизнеспособность N- и Нур-клеток не отличалась в трех независимых сериях и составляла около 90%. Следует отметить, что пролиферативная активность культивируемых в стандартных условиях лМСК, выделенных из липоаспиратов различных доноров, варьирует в очень широких пределах.

Таким образом, культивируемые в газовой среде с пониженным содержанием кислорода (5% O₂) лМСК имеют более высокую пролиферативную активность по сравнению с лМСК, находящимися в стандартных условиях (95% воздуха + 5% СО₂). Характер роста N- и Нур-клеток не отличается и описывается стандартной кривой пролиферации. Различия в значениях клеточного прироста могут быть связаны с индивидуальными особенностями доноров лМСК. Изменение содержания кислорода в газовой среде не снижает жизнеспособность культивируемых клеток.

Результаты иммунофенотипирования в выделениях лМСК на втором пассаже приведены в табл. 9-11.

Во всех трех экспериментах, как в N-, так и в Нур-культурах не было обнаружено клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндотелия и гематопоэтических клеток-предшественников (CD31, CD34, CD62L, CD62E, CD62P, CD117(c-kit), HLA-DR). Наличие таких антигенов как CD9, CD54, CD71, CD90, CD105, CD106, HLA-ABC, виментин свидетельствовало о том, что исследуемые клетки можно охарактеризовать как лМСК. Количество клеток, несущих исследуемые маркеры - CD9, CD54, CD71, CD105, CD106, HLA-ABC, виментин не отличалось в N- и в Нур-культурах во всех трех сериях исследований. Доля CD90-положительных клеток варьировала от 75 до 96%. Проведенный иммунофенотипический анализ позволил подтвердить, что клетки, выделенные согласно используемому протоколу, являются стромальными мезенхимальными клетками-предшественниками. Культивирование в условиях пониженного содержания кислорода не влияет на экспрессию антигенов, характерных для МСК, и сохраняет их высокую жизнеспособность клеток в культуре и способность к направленной дифференцировке.

Таким образом, было показано, что культивирование клеток в условиях пониженного (5%) содержания кислорода не влияет на фенотип и жизнеспособность культивируемых клеток и оказывает стимулирующее действие на пролиферативную активность лМСК, что позволяет получить большую клеточную массу за тот же период культивирования по сравнению со стандартными условиями.

Таблица 1 Влияние постоянного культивирования в условиях пониженного содержания кислорода (5%) на пролиферативную активность лМСК Пассаж Прирост клеток за время культивирования, % от 1 суток Нур/N, кратность различий Нормоксия Гипоксия 1 14 42 3 2 2 66 33

Таблица 2 Количество удвоений и время удвоений лМСК при постоянном культивировании в условиях пониженного содержания кислорода (5%) и в стандартных условиях (20%) Пассаж Количество удвоений Время удвоения, часы Нормоксия Гипоксия Нормоксия Гипоксия 1 0,19 0,5 380 144 2 0,03 0,73 5600 93

Таблица 3 Влияние постоянного культивирования в условиях пониженного содержания кислорода (5%) на пролиферативную активность лМСК Пассаж Прирост клеток за время культивирования, % Нур/N, кратность различий Нормоксия Гипоксия 2 445 1196 2,7

Таблица 4 Количество удвоений и время удвоений лМСК при постоянном культивировании клеток в условиях пониженного содержания кислорода (5%) и в стандартных условиях Пассаж Количество удвоений Время удвоения, часы Нормоксия Гипоксия Нормоксия Гипоксия 2 8,8 10,2 21,9 18,9

Таблица 5 Жизнеспособность лМСК человека при культивировании в нормоксии (20% О₂) и гипоксии (5% О₂) Пассаж Нормоксия Гипоксия живые, % An+, % PI+, % An-PI+, % живые, % An+, % PI+, % An-PI+, % р2 87,98 8,91 1,02 2 88,9 7,93 0,88 2,29

Таблица 6 Влияние постоянного культивирования клеток в условиях пониженного содержания кислорода (5%) на пролиферативную активность лМСК Пассаж Прирост клеток за время культивирования, % Нур/N, кратность различий Нормоксия Гипоксия 2 148 475 2,5

Таблица 7 Количество удвоений и время удвоений лМСК при постоянном культивировании клеток в условиях пониженного содержания кислорода (5%) и в стандартных условиях Пассаж Количество удвоений Время удвоения, часы Нормоксия Гипоксия Нормоксия Гипоксия 2 1.31 2,52 55 29

Таблица 8 Жизнеспособность лМСК человека при культивировании в нормоксии (21% O₂) и гипоксии (5% O₂) Пассаж Нормоксия Гипоксия живые, % An+, % PI+, % An-PI+, % живые, % An+, % PI+, % An-PI+, % р2 94,9 0,29 2,43 2,38 95,0 0,88 1,83 2,29

Таблица 9 Иммунофенотипирование культивируемых лМСК (2 пассаж, выделение А). Экспрессия маркера в % Показатель CD31 CD34 CD62L CD62E CD62P CD117 (c-kit) HLA-DR CD9 CD54 CD71 CD90 CD105 HLA-ABC виментин Нормоксия 0 0 0 0 0 0 0 40+5 71+8 95+3 75+4,5 100 100 100 Гипоксия 0 0 0 0 0 0 0 42+4 75+7 100 76+3,5 100 100 100

Таблица 10 Иммунофенотипирование культивируемых лМСК (2 пассаж, выделение Б). Экспрессия маркера в % Показатель CD31 CD34 CD62L CD62E CD62P CD117 (c-krt) HLA-DR CD9 CD54 CD71 CD90 CD105 HLA-ABC виментин Нормоксия 0 0 0 0 0 0 0 45+5 60+5 100 95+4,5 100 100 100 Гипоксия 0 0 0 0 0 0 0 44+4 60+7 100 96+3,5 100 100 100

Таблица 11 Иммунофенотипирование культивируемых лМСК (2 пассаж, выделение В). Экспрессия маркера в % Показатель CD31 CD34 CD62L CD62E CD62P CD117 (c-krt) HLA-DR CD9 CD54 CD71 CD90 CD105 HLA-ABC виментин Нормоксия 0 0 0 0 0 0 0 20+2,3 76+4,5 н/о 94+4,5 н/о 100 100 Гипоксия 0 0 0 0 0 0 0 18+3,4 78+7 н/о 95+3,5 н/о 100 100 Примечание: н/о - не определяли.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении культур стволовых клеток для различных целей. Проводят выделение клеток-предшественников, дополнительную отмывку буфером с помощью двух последовательных центрифугирований, ферментативную обработку ткани коллагеназой, несколько последовательных отмывок центрифугированием, адгезию полученного клеточного материала на пластике и последующее культивирование от 4 до 10 дней в условиях гипоксии с содержанием кислорода не менее 5% до получения целевой клеточной культуры. Используют клетки от 1-го до 2-го пассажей. Определяют количество живых, некротических и апоптотических клеток и проводят анализ фенотипа мезенхимальных стромальных клеток путем их идентификации с помощью набора моноклональных антител гематопоэтическим и эндотелиальным маркерам CD31, CD34, CD62L, CD62E, CD62P, CD117(c-kit), HLA-DR, а также к маркерам, характерным для мезенхимальных стромальных клеток-предшественников CD9, CD54, CD71, CD90, CD105, HLA-ABC, виментин. Изобретение позволяет получить мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки при повышении их выхода с сохранением их фенотипа и высокой жизнеспособности. 2 ил., 11 табл.

Способ получения культур мезенхимальных стромальных клеток человека, выделенных из липоаспирата, включающий выделение клеток-предшественников, дополнительную отмывку буфером с помощью двух последовательных центрифугирований, обработку ткани коллагеназой, несколько последовательных отмывок центрифугированием, адгезию полученного клеточного осадка на пластике и последующее культивирование до получения целевой клеточной культуры, отличающийся тем, что культивирование ведут от 4 до 10 дней в условиях гипоксии с содержанием кислорода не менее 5%, при этом используют клетки от 1-го до 2-го пассажей, после чего определяют количество живых, некротических и апоптотических клеток и проводят анализ фенотипа мезенхимальных стромальных клеток путем их идентификации с помощью набора моноклональных гематопоэтических и эндотелиальных антител CD31, CD34, CD62L, CD62E, CD62P, CD117(c-kit), а также к маркерам, характерным для мезенхимальных стромальных клеток-предшественников: HLA-DR, CD9, CD54, CD71, CD90, CD105, HLA-ABC, виментин.