Ex vivo СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ КАЧЕСТВА КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ ОТ ВОЗРАСТНЫХ ДОНОРОВ Российский патент 2013 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для улучшения качества культивируемых прогениторных клеток, полученных от доноров старшего возраста, для дальнейшего их применения в регенеративной медицине.

В связи с увеличением области применения стволовых клеток все актуальней становится проблема получения в короткий временной период требуемого количества мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток для дальнейшего решения практических задач. Наиболее удобными и безопасными для применения являются аутологичные клетки, однако эти клетки на момент их выделения уже могут претерпеть ряд возрастных изменений. Таким образом, на фоне увеличивающегося среднего возраста населения актуальным является поиск метода, позволяющего повысить эффективность выделения и улучшить качество клеток-предшественников, полученных от доноров старшего возраста.

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки-предшественники (ММСК) характеризуются большим пролиферативным потенциалом, способностью к самоподдержанию, а также способностью к дифференцировке в различные клеточные типы под действием определенных стимулов.

Проводимые исследования старения ММСК показали, что с возрастом снижается их способность к колониеобразованию и пролиферативная активность. Морфологически, стареющие клетки характеризуются увеличением размеров и экспрессией β-галактозидазы (Fehrer С., Lepperdinger G., 2005; Sethe S, Scutt A, Stolzing A., 2006; Паюшина О.В., Домарацкая Е.И., Старостин В.И. 2006; Zhou S, Greenberger JS, Epperly MW, Goff JP, Adier C, Leboff MS, Glowacki J. 2008).

Кроме этого было показано влияние возраста донора на потенциал дифференцировки культивируемых ММСК. Так, Wilson показал достоверное снижение экспрессии щелочной фосфатазы при сохранении фенотипа, что свидетельствует о снижении потенциала остеогенной дифференцировки (Wilson A, Shehadeh LA, Yu H, Webster KA. 2010). Вместе с тем, с увеличением возраста донора увеличивается потенциал адипогенной дифференцировки клеток-предшественников (Sethe S, Scutt A, Stolzing A. 2006), что может отрицательно влиять на эффективность последующего их использования в терапевтических целях.

Задача, решаемая изобретением, заключается в повышении эффективности выделения и улучшении качества ММСК, полученных от доноров старшего возраста, с помощью культивирования клеток с момента выделения при пониженном содержании кислорода (5%), которое выражалось в адгезии более ранних предшественников в первичной культуре, в значительном увеличении пролиферативной активности к третьему пассажу, с сохранением фенотипа, снижении потенциала адипогенной дифференцировки и увеличении потенциала остеогенной дифференцировки, а также в улучшении способности к колониеобразованию.

Выделяют клетки-предшественники путем адгезии клеток на пластик и постоянно осуществляют дальнейшее их культивирование от 6 до 12 дней при 5% содержании кислорода в газовой среде. Определяют количество адгезированных клеток на третий день культивирования в первичной культуре, число удвоений, проводят анализ фенотипа мезенхимальных стромальных клеток путем их идентификации с помощью набора маркеров, характерных для мезенхимальных стромальных клеток-предшественников CD90, CD54, CD44, CD73, а также гемопоэтических маркеров, включая CD11b и CD45. Оценивают потенциал адипогенной и остеогенной дифференцировки и содержание бета-галактозидазы на втором пассаже. Исследуют эффективность колониеобразования.

Техническим результатом изобретения является получение мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток-предшественников с улучшенными свойствами от доноров старшего возраста при повышении эффективности их выделения с сохранением фенотипа и сохранением потенциала дифференцировки.

Таким образом, разработан способ повышения качества мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток-предшественников, полученных от возрастных доноров.

Технический результат достигается с помощью постоянного культивирования мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток-предшественников, выделенных из костного мозга доноров старшего возраста, в условиях пониженного содержания кислорода (5%). При этом первичная культура характеризуется количеством адгезированных клеток и числом удвоений с третьего по шестой день культивирования, оценена пролиферативная активность 1-3 пассажей, фенотип клеток с помощью набора маркеров, характерных для мезенхимальных стромальных клеток-предшественников CD90, CD54, CD44, CD73, а также гемопоэтических маркеров, включая CD11b и CD45, потенциал остеогенной и адипогенной дифференцировки, потенциал колониеобразования и содержание в культуре стареющих клеток.

При проведении исследования было установлено, что постоянное культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток-предшественников, полученных от крыс старше 12 месяцев, при пониженном содержании кислорода до 5% позволяло выделять клетки, обладающие повышенной пролиферативной активностью, высокой способность к колониеобразованию, сниженным числом стареющих клеток и адипогенезом, при повышенном потенциале остеогенной дифференцировки.

Материалы и методы

Химические реактивы:

среда α-МЕМ (ICN, США; Биолот, Россия);

стерильный раствор глутамина с концентрацией 200 мМ (Gibco, США) раствор пирувата натрия с концентрацией 100 мМ (Gibco, США);

антибиотики (100 ед./мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина) (Gibco, США);

эмбриональная телячья сыворотка (Gibco, США; Hyclone, США);

однократный 20 мМ фосфатный буфер PBS (Gibco, США);

0,02% раствор трипсина с 0,05% ЭДТА (Gibco, США) для открепления клеток от подложки (Gibco, США);

дексаметазон (Sigma, Германия);

глицерол-2-фосфат (Sigma, Германия);

2-фосфо-L-аскорбиновая кислота (BioChemika, Германия);

изобутилметилксантин (Sigma, Германия);

инсулин (NovoNordisk, Дания);

индометацин (Sigma, Германия);

набор для определения активности щелочной фосфатазы Alkaline Phosphatase Kit (Sigma-Aldrich, США);

набор для определения адипогенной дифференцировки (Chemicon. США)

метиленовый синий;

глутаральдегид;

формальдегид;

x-gal;

K₄Fe(CN)₆*3H₂O 5mM;

K₃Fe(СН)₆*3H₂O 5mM;

MgCl₂2M.

Пластиковая посуда:

культуральные флаконы площадью 25 и 75 см²;

чашки Петри различного диаметра;

центрифужные пробирки различного объема (Nunc, Дания);

пробирки для проточного цитофлуориметра (Sarstedt, Германия);

пластиковые наконечники для автоматических пипеток (Eppendorf, Германия).

Оборудование:

ламинарный шкаф (Сампо, Россия);

CO₂-инкубатор (Sanyo, Япония);

мультигазовый инкубатор (Sanyo, Япония);

световой инвертированный фазово-контрастный микроскоп, оснащенный системой анализа изображения;

центрифуга (Eppendorf, Германия);

водяная баня (BioSan, Латвия);

проточный цитофлуориметр (Beckman Coulter, США); герметичную камеру (Stem Cell Technologies, Канада);

автоматические пипетки (Eppendorf, Германия).

Исследование проводилось на мультипотентных мезенхимальных стромальных клетках-предшественниках костного мозга крыс старше 12 месяцев. Выделение проводили по методу Javazon (2001). Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки-предшественники (ММСК) выделяли из диафизов бедренных костей крыс линии Wistar (виварий ГНЦ РФ - Института медико-биологических проблем РАН) после декапитирования животного. Диафизы промывали культуральной средой под давлением с помощью шприца с иглой большого диаметра. Далее полученную суспензию клеток костного мозга с тканевыми фрагментами дезагрегировали механически (ресуспендированием). Полученные от одного животного клетки ресуспензировали в среде роста, помещали в 2 культуральных флакона (25 см²), приоткрывали крышки флаконов и оставляли один в CO₂ - инкубаторе (20% О₂, 5% СО₂, 75% N₂, 100% влажности, 37°С), а другой - в мультигазовом инкубаторе (5% О₂, 5% СО₂, 90%. N₂, 100% влажности, 37°С) в течение 3 суток. Затем удаляли среду с неприкрепившимися клетками, путем трехразовой промывки раствором PBS, и добавляли 4 мл свежей культуральной среды. При достижении 80-90% монослоя клетки пересевали. Плотность посадки клеток составляла около 1000-1500 клеток/см². Среду во флаконах с культивируемыми клетками меняли каждые 3-4 дня.

Перед пассированием клеток удаляли среду, а клетки 2-3 раза промывали раствором PBS. Затем клетки-предшественники отделяли от пластика добавлением раствора трипсина (0,25% трипсина-ЭДТА), после чего клетки инкубировались 1-3 минуты при температуре 37°С, в инкубаторе (до отделения клеток от подложки). Контроль за откреплением клеток от субстрата производили с помощью фазово-контрастного микроскопа (Leica, Германия). Когда клетки полностью отделялись от субстрата, добавляли среду с сывороткой (для инактивации трипсина), после чего клетки тщательно ресуспендировали. Затем с помощью камеры Горяева проводили подсчет количества клеток, после чего рассчитывался необходимый объем, в котором содержится требуемое количество клеток, производили перенос клеток в культуральные флаконы и добавляли необходимое количество среды.

Для анализа пролиферативной активности клеток в культуре использовали метод видеомикроскопии. С помощью микроскопа Leica DM IL (Германия), снабженного видеокамерой, изображение передавалось на компьютер для дальнейшего анализа. Оценка пролиферативной активности проводилась с использованием формулы:

n=3,32 lg (x/х₀), где n - число удвоений, x₀ и x - число клеток в третий и шестой день культивирования для первичной культуры и в первый и шестой день соответственно, для 1-3 пассажа.

Для характеристики фенотипа полученных клеток и наблюдения за его изменением в процессе культивирования проводили иммуннофенотипирование с помощью проточного цитофлуориметра Beckman Coulter Epics XL по методике производителя.

Фенотипирование проводили на 2-3 пассажах. В работе использовались следующие маркеры: CD90; CD54; CD44; CD11b; CD73; CD45.

Для анализа клетки снимали с пластика раствором трипсин-ЭДТА, а затем фермент ингибировали культуральной средой, содержащей 10% сыворотки. После этого проводили подсчет клеток и центрифугирование (1000 об/мин, 5 мин). Затем супернатант сливали и разводили осадок из расчета 100 мкл PBS на 10⁵ клеток (одна проба), ресуспендировали и разделяли по пробиркам на пробы. В полученные пробы добавляли антигенспецифические антитела или изотипический контроль, согласно инструкции производителя. После этого клетки инкубировались при температуре

+4°С 20 мин. Перед проведением анализа в пробу добавляли 500 мкл PBS.

Для оценки дифференцировочного потенциала мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс исследовали их способность к остеогенной и адипогенной дифференцировке в ответ на определенные дифференцировочные стимулы (индуцированная дифференцировка). Для индукции дифференцировки клетки культивировали в среде с добавлением остеогенных (10^-8 М дексаметазона, 10 мМ глицерол-2-фосфата (Sigma, США) и 0,2 мМ 2-фосфо-L-аскорбиновой кислоты (Fluka, Германия)) или адипогенных (0,5 мМ изобутилметилксантина, 1 µМ дексаметазона (Sigma, США), 10 µг/мл инсулина (NovoNordisk, Дания)) дифференцировочных стимулов.

Начальные этапы остеогенной дифференцировки ММСК анализировали с помощью набора Alkaline Phosphatase Kit (Sigma-Aldrich, США), оценивая гистохимическое выявление в клетках активности щелочной фосфатазы - раннего, но характерного маркера деятельности остеобластов. Клетки, в которых определялась активность этого фермента, рассматривали как вступившие на путь остеогенной дифференцировки (спонтанной или индуцированной).

Адипогенный дифференцировочный потенциал оценивали по появлению в культуре клеток, накапливающих в цитоплазме липидные капли, выявляемые с помощью красителя Oil Red О из набора для оценки адипогенного потенциала.

Для выявления КОЕ среди выделенных клеток полученную суспензию помещали на 2 чашки Петри (S=25 см) по 0,5 мл и добавляли 4 мл культуральной среды. Затем одна чашка культивировалась при 5% кислорода и другая - при 20% кислорода. Культивирование осуществлялось 14 дней. Для дальнейшей оценки колониеобразования клетки сажали с низкой плотностью - 24 кл/см².

Оценка содержания бета-галактозидазы проводилась по Jaques Peschon (1986). Для этого клетки фиксировали в формальдегиде и глутаральдегиде, а затем окрашивали X-gal согласно инструкции производителя.

Было показано, что постоянное культивирование клеток-предшественников, полученных от животных старше 12 месяцев в газовой среде, содержащей 5% кислорода, несмотря на меньшее количество адгезированных в первичной культуре клеток и меньшее число их удвоений, способствовало увеличению пролиферативной активности клеток, начиная со второго пассажа. При этом, изменений в иммунофенотипе клеток-предшественников не было обнаружено. Кроме этого было показано, что культивирование при 5% кислорода улучшало процесс колониеобразования и снижало долю клеток, содержащих бета-галактозидазу, что свидетельствует о субселекции менее комитированных клеток. Оценка потенциала дифференцировки показала, что культивирование при пониженном содержании кислорода оказывало противоположный старению эффект, который выражался в увеличении доли клеток, содержащих щелочную фосфотазу, которая является ранним маркером остеогенной дифференцировки, и в снижении доли клеток, содержащих липидные капли. Результаты представлены в табл.1-6.

Таблица 1 Характеристика первичной культуры ММСК старых животных при культивировании в стандартных условиях и при гипоксии   20% кислорода 5% кислорода Количество адгезированных клеток на 3 день культивирования 10,1±2,9 6,1±3,1 Число удвоений 3,1±0,2 2,3±0,3*

Таблица 2 Число удвоений ММСК старых животных при культивировании в стандартных условиях и при гипоксии   Пассаж 1 Пассаж 2 Пассаж 3 20% кислорода 3,92±0,12 2,49±0,26 2,06±0,35 5% кислорода 3,77±0,17* 3,22±0,19* 4,01±0,18* * - достоверно при p<0,05, по сравнению с теми же клетками, культивируемыми при 20% кислорода.

Таблица 3 Доля X-gal положительных клеток на втором пассаже ММСК старых животных при культивировании в стандартных условиях и при гипоксии   Первый день Третий день 20% кислорода 20,9±4,6 8,4±6,4 5% кислорода 14,6±4,8 12,3±4,6

Таблица 4 Фенотип культивируемых ММСК старых животных при культивировании в стандартных условиях и при гипоксии   20% кислорода 5% кислорода CD90 99,0±0,9 99,8±0,2 CD45 0,56±0,41 0,75±0,61 CD54 96,65±2,35 96,1±3,4 CD44 95,8±0,7 97,25±1,05 CD73 97,25±1,75 97,25±0,25 CD11b 2,2±0,78 2,69±0,62

Таблица 5 Индуцированная дифференцировка культивируемых ММСК старых животных при культивировании в стандартных условиях и при гипоксии   Доля клеток с липидными каплями Доля клеток, содержащих щелочную фосфатазу 20% кислорода 46,53±7,05 28,28±3,78 5% кислорода 8,47±3,99* 40,68±7,16* * - достоверно при р<0,05, по сравнению с теми же клетками, культивируемыми при 20% кислорода.

Изобретение относится к биохимии и представляет собой способ повышения качества клеток-предшественников, выделенных из костного мозга возрастных доноров, включающий постоянное, начиная с момента выделения суспензии и прикрепления клеток, культивирование в мультигазовом инкубаторе с заменой среды каждые трое суток до достижения 80-90% монослоя, пересев культуры клеток, причем плотность посадки клеток составляет около 1000-1500 клеток/см², а содержание кислорода в газовой среде 5%. Изобретение позволяет получить популяцию менее коммитированных ММСК, которые к третьему пассажу обладают высоким пролиферативным потенциалом, сниженным потенциалом адипогенной дифференцировки, увеличенным потенциалом остеогенной дифференцировки и сохраняющую фенотип, характерный для ММСК костного мозга, а также высокую способность к колониеобразованию. 6 табл.

Способ повышения качества клеток-предшественников, выделенных из костного мозга возрастных доноров, включающий постоянное, начиная с момента выделения суспензии и прикрепления клеток, культивирование в мультигазовом инкубаторе (5% О₂, 5% CO₂, 90%, N₂, 100% влажность, 37°С) с заменой среды каждые трое суток до достижения 80-90% монослоя, культуры клеток пересевают, плотность посадки клеток составляет около 1000-1500 клеток/см², содержание кислорода в газовой среде 5%.