СПОСОБ РЕГИСТРАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ ПРИ ПОМОЩИ СОПРЯЖЕННОЙ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ СКАНИРУЮЩЕЙ ПРОБНОЙ МИКРОСКОПИИ И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ Российский патент 2009 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к протеомике и медицинской диагностике и касается применения методов зондовой микроскопии и масс-спектрометрии для регистрации и идентификации макромолекул при протеомных исследованиях, диагностике, в вирусологии и т.д.

В качестве прототипа может быть использован стандартный SELDI метод, который позволяет аффинно биоспецифически вылавливать макромолекулы из раствора на поверхность биочипа с иммобилизованными молекулами, после чего проводить измерение масс выловленных макромолекул с помощью масс-спектрометра с источником ионизации MALDI (Lewczuk P., Esselmann H., Groemer T.W., Bibi M., Maler J.M., Steinacker P., Otto M., Kornhuber J., Wiltfang, J., Biol. Psychiatry. 2004, 55, 524-530.; Landuyt В., Jaap Jansen J., Wildiers H., Goethals L., Boeck G.D., et al., J. Separation Science, 2003, 26, 619-623). Применение термина "вылавливают" (на английском языке "Fishing"), используемого в международных научных изданиях, в данном контексте означает захват молекулой, иммобилизованной на поверхности чипа, макромолекулы-партнера из раствора и концентрированно захваченных макромолекул на поверхности биочипа (см. review: Nelson R.W. and Krone J.R. J. of Molecular recognition 1999, 12, 77-93. Natsume Т., Nakayama H., Isobe T. Trends in Biotechnology 2001, 19, S28-S33).

Недостатком этого метода является отсутствие возможности визуализации комплексов, а именно нет информации о структуре комплексов.

Существует метод зондовой сканирующей микроскопии как частный случай атомно-силовой микроскопии (АСМ) для регистрации и визуализации структуры макромолекулярных комплексов в аналите, при котором биочип с иммобилизованными молекулами инкубируется в растворе аналита, при этом производится аффинное биоспецифическое вылавливание макромолекул из раствора, концентрирование их на поверхности биочипа, перешивание выловленных комплексов молекула/макромолекула, при этом концентрационная чувствительность которого достигает чрезвычайно высокого уровня - 10^-19 М (заявка № 2004119864 от 30 июня 2004). Недостаток использования этого метода - нет достоверной идентификации выловленных комплексов из-за мешающего влияния артефактов от загрязненности образца.

Преодоление этих недостатков может быть достигнуто применением сопряжения двух методов сканирующей зондовой микроскопии и масс-спектрометрии, позволяющее проводить регистрацию макромолекул в растворе аналита с высокой чувствительностью до 10^-19 М, характерной для метода атомно-силовой микроскопии, и одновременно идентифицировать выловленные молекулы с помощью методов масс-спектрометрии. Он заключается в том, что ансамбль аффинных иммобилизованных молекул на поверхности биочипа инкубируется в растворе макромолекул, которые за счет аффинного биоспецифического связывания с иммобилизованными молекулами вылавливаются из этого раствора, отмываются от неспецифически сорбированных молекул, после чего полученные комплексы иммобилизованных белков с выловленными макромолекулами регистрируются с помощью сканирующего зондового микроскопа.

Идентификация выловленных комплексов производится методом масс-спектрометрии in situ с использованием лазерной ионизации с десорбцией из матрицы (MALDI) или методом электроспрейной ионизации (ESI). В последнем случае комплексы смываются с биочипа и производится прямой масс-спектрометрический анализ методом электроспрейной ионизации. Метод пригоден как для анализа белков, так и для анализа олигонуклеотидов. Если белок имеет массу более 30 кДа, то может производиться протеолиз как in situ на биочипе, так и в смытом аналите в случае анализа ESI. В обоих случаях анализируются пептиды - продукты протеолиза.

Для повышения чувствительности комплексы молекул с макромолекулами на поверхности чипа могут ковалентно сшиваться с помощью химических, фотохимических, химических методов с радиоизотопной меткой.

В качестве примера реализации поставленной задачи был создан АСМ биочип, состоящий из ансамбля иммобилизованных молекул, расположенных на подложке биочипа к сканирующему атомно-силовому микроскопу для идентификации макромолекул с использованием сканирующей зондовой микроскопии и сопряжен с масс-спектрометром.

В качестве иммобилизованных на поверхности биочипа молекул, как пример, использовались антитела (анти-HCVcore) к HCVcore антигену (HCVcoreAg) вируса гепатита С, ковалентно иммобилизованные на поверхности модифицированной положке слюды с неровностью рельефа порядка 1 нм.

В качестве биоспецифического партнера антител к HCVcore антигену использовался раствор аналита с находящимися в нем макромолекулами HCVcore антигенов. Эти макромолекулы HCVcore антигенов специфически связывались и за счет этого вылавливались из раствора аналита, образуя биоспецифические комплексы anti-HCVcore/HCVcore на поверхности биочипа. Затем осуществлялась отмывка биочипа от неспецифически сорбировавшихся молекул на поверхности биочипа, после чего, проводилось обнаружение и визуализация белков и их комплексов на поверхности биочипа с помощью атомно-силовой микроскопии и затем проводился масс-спектрометрический анализ белков, оставшихся на подложке.

На фиг.1 приведено АСМ-изображение участка поверхности биочипов с иммобилизованными антителами к HCVcore и биочипов с анти-HCVcore/HCVcore комплексами, которые образовывались на поверхности биочипа с иммобилизованными анти-HCVcore при инкубации его в растворе аналита, содержащего HCV антигены при концентрации 10^-9 М.

На фиг.1,А приведено изображение изолированных антител к HCVcore антигену на подложке биочипа. Высоты антител имеют распределение по высоте с размерами 1,5-2 нм. На биочипе с иммобилизованными анти-HCVcore, инкубированном в растворе аналита, содержащего HCVcore (фиг.1,В), кроме антител наблюдаются комплексы антиген/антитело, с размером 2,5-5 нм, превышающим размеры изолированных антител.

Для повышения чувствительности комплексы молекул с макромолекулами на поверхности чипа могут ковалентно сшиваться с помощью химических, фотохимических, химических методов с радиоизотопной меткой. На фиг.2 приведено АСМ-изображение части поверхности биочипов с активированными фотолинкерами, иммобилизованными антителами к HCVcore, и биочипов с анти-HCVcore/HCVcore комплексами, которые образовывались на поверхности биочипа с иммобилизованными анти-HCVcore при его инкубации в растворе аналита, содержащего HCV антигены при концентрации 10^-14 М и последующей ковалентной фотосшивкой между анти-HCVcore с HCVcore антигенами посредством проведения фотореакции. На фиг.2,А приведено изображение изолированных активированных антител к HCVcore антигену на подложке биочипа. Высоты антител имеют распределение по высоте с размерами 1,5-3 нм. На биочипе с иммобилизованными анти-HCVcore, инкубированном в растворе аналита, содержащего HCVcoreAg (фиг.2,В), кроме антител наблюдаются комплексы антиген/антитело с размером 3,5-7 нм, превышающим размеры изолированных антител. Из сравнения фиг.2, В и фиг.1, В видно, что использование ковалентной сшивки между HCVcoreAg и анти-HCVcore позволяет зафиксировать примерно такое же количество белковых комплексов, что и в случае, когда не применяется ковалентная сшивка между белками при гораздо меньшей концентрации HCVcoreAg в аналите (на 5 порядков). То есть фиксация белков в комплексе на поверхности биочипа за счет ковалентной сшивки между белками в комплексе при вылавливании белков позволяет повысить чувствительность регистрации макромолекул в растворе аналита. Расчеты показывают, что чувствительность может быть повышена до 10-19 М.

На фиг.3 приведены масс-спектры, полученные методом MALDI с поверхности AFM-биочипа, с изолированными антителами (фиг.3,С), биочипа с комплексами антитген/антитело (фиг.3,D) и контрольные масс-спектры от антител в растворе (фиг.3,А) и от HCVcoreAg в растворе (фиг.3,В).

Как видно из фиг.3,А, масс-спектр анти-HCVcore в растворе имеет характерные сигналы с массами в диапазоне М=147 kDa, соответствующими массам целых молекул анти-HCVcore, и фрагментов легкой и тяжелой цепей этих антитела с сигналами в области М=24 kDa, 32 kDa и М=47 kDa соответственно. Масс-спектр HCVcore антигена в растворе имеет характерные сигналы с массами в диапазоне М=25 kDa, соответствующими массам целых молекул антигена. Масс-спектр иммобилизованных на поверхности биочипа изолированных анти-HCVcore (фиг.3,С) имеет характерные сигналы, соответствующие массам фрагментов легкой и тяжелой цепей этих антител с сигналами в области М=24 kDa, 32 kDa и М=47 kDa соответственно. Масс-спектр объектов на поверхности биочипа с иммобилизованными анти-HCVcore, которые были инкубированы в растворе аналита, содержащего HCV антигены (фиг.3,D), видно изменение паттерна масс-спектра по сравнению с паттерном масс-спектра изолированных анти-HCVcore (фиг.3,С), что связано со вкладом в полный масс-спектр сигналов от HCVcoreAg. Так, кроме сигналов, соответствующих массам фрагментов легкой и тяжелой цепей антител, появляются сигналы с массами М=52 kDa и 77 kDa, соответствующие комплексам фрагментов, включающих легкую цепь антител с антигенами HCVcore, а также существенное увеличение сигнала в области 25 kDa, соответствующей вкладу от целого антигена HCVcore. Таким образом, сопряжение системы на основе сканирующей атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии позволяет регистрировать HCVcore антиген с помощью биочипа к атомно-силовому микроскопу в растворе и идентифицировать эти антигены с помощью масс-спектрометрического анализа. Если белок имеет массу более 30 кДа, то может производиться протеолиз как in situ на биочипе, так и в смытом аналите в случае анализа методом ESI, как описано в обзоре [Williams С., Addona T.A. TIBTECH, 2000, v.18, February, 45-48]. В обоих случаях анализируются пептиды - продукты протеолиза.

Для повышения чувствительности комплексы молекул с макромолекулами на поверхности чипа могут ковалентно сшиваться с помощью химических, фотохимических, химических методов с радиоизотопной меткой.

В качестве методов ионизации при масс-спектрометрометрическом анализе могут быть использованы LD, MALDI, SELDI, SALDI, ESI, SIMS, FAB (fast atom bombardment). В случае использования последних двух методов поверхность отмытого биочипа может покрываться тонким слоем золота, получаемого методом напыления в вакууме.

В качестве масс-анализаторов могут быть использованы TOF, Q, Q-TOF, FTICR, ion TRAP, ORBITRAP.

Изобретение относится к медицинской диагностике. Предложен способ регистрации специфических макромолекул в биологической пробе с использованием комбинации двух методов: сканирующей зондовой микроскопии и масс-спектрометрии, что позволяет проводить регистрацию макромолекул в растворе аналита методом атомно-силовой микроскопии и одновременно идентифицировать выловленные молекулы с помощью методов масс-спектрометрии. Способ позволяет с чувствительностью до 10^-19 М идентифицировать макромолекулы при проведении протеомных, вирусологических, диагностических исследований. 2 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ регистрации и идентификации макромолекул в растворе аналита при помощи сопряженной системы на основе сканирующей пробной микроскопии и масс-спектрометрии, при котором ансамбль аффинных иммобилизованных молекул на поверхности биочипа инкубируют в растворе макромолекул, которые за счет аффинного биоспецифического связывания с иммобилизованными молекулами вылавливаются из этого раствора, отмывают от неспецифически сорбированных молекул, после чего полученные комплексы иммобилизованных белков с выловленными макромолекулами регистрируют с помощью сканирующего зондового микросокопа, а идентификацию выловленных комплексов производят методом масс-спектрометрии in situ с использованием лазерной десорбции LD, а также MALDI, SELDI, SALDI, SIMS, FAB или методом ESI, при этом комплексы молекул с макромолекулами на поверхности чипа могут ковалентно сшиваться с помощью химических, фотохимических или химических методов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве сканирующего зондового микроскопа используют атомно-силовой микроскоп, или сканирующий туннельный микроскоп, или оптический ближнепольный микроскоп в одноканальном или многоканальном исполнении.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве молекул, иммобилизованных на поверхности чипа, могут быть антитела, антигены, аптамеры, фотоаптамеры, олигонуклеотиды или их фрагменты как в виде отдельного чипа, так и любые комбинации этих молекул в виде поля.