ЛИНИЯ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПОДКОЖНО-ЖИРОВОЙ КЛЕТЧАТКИ ЧЕЛОВЕКА (PANNICULUS ADIPOSUS HOMO SAPIENSE) ДЛЯ КЛЕТОЧНОЙ И ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ Российский патент 2009 года по МПК C12N5/06 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной и медицинской биотехнологии, в частности, к получению линии диплоидных мультипотентных мезенхимных стволовых клеток подкожно-жировой клетчатки человека.

Факт наличия в организме взрослой особи популяций стволовых клеток во многих тканях и органах привел к бурному развитию целого направления клеточных технологий в биологии развития, вирусологии, биотехнологии и медицине, среди которых можно выделить тканевую инженерию. Тканевая инженерия - новый и перспективный методологический подход, эффективность которого зависит от правильного подбора источника клеток в комплексе с матриксом и биологически активными молекулами. Различают два отличающихся друг от друга вида стволовых клеток: эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) и клетки, выделенные из органов и тканей взрослого организма - региональные стволовые клетки (РСК). Стволовые клетки являются уникальными по своим характеристикам. Во-первых, они способны самообновляться и самоподдерживаться в течение длительного времени или всей жизни организма, а во-вторых, они обладают широким спектром дифференцировки в клетки других клеточных типов.

В настоящее время стало возможным получать из организма взрослого человека (костный мозг, подкожно-жировая клетчатки, дерма) его собственные (ауто-) стволовые клетки, длительно культивировать с сохранением их первоначального фенотипа, наращивать в огромных количествах, направлять их на определенный путь развития (дифференцировка) в специализированные клетки, создавать трехмерные структуры, соответствующие условиям тканевого окружения, получать клеточно-тканевые трансплантаты на основе биодеградируемых материалов. Все это способствует разработке новых технологий клеточной и тканевой терапии, которые помогут решить проблему лечения ряда тяжелых заболеваний животных и человека.

Особенно перспективными в данном направлении являются мультипотентные мезенхимные стволовые клетки (ММСК). Эти клетки, как известно, являются структурными и функциональными стержнями различных видов тканей. Известно, что такие клетки способны к самообновлению. При проникновении с током крови в различные органы и ткани, особенно в поврежденные, эти клетки обеспечивают развитие или замещают поврежденную ткань, что и является их регенерационным эффектом. Полагают, что регенерация органов, содержащих клетки и ткани мезенхимного происхождения, должна иметь единый общий биологический механизм. ММСК доступны, просты в культивировании, при определенных условиях способны дифференцироваться в различные типы и виды тканей и органов и самое главное не вызывают реакцию иммунного отторжения. Эти данные послужили толчком к развитию медико-биологических исследований, направленных на изучение возможности использования ММСК для клеточной терапии многих известных приобретенных и наследственных заболеваний.

Согласно общепринятому мнению, костный мозг является самым подходящим источником ММСК. Серией успешных экспериментов рядом авторов было показано, что стволовые клетки, выделенные из костного мозга, способны при определенных условиях подвергаться дифференцировке в клетки тканей, имеющих мезодермальное происхождение. Однако их использование ограничено из-за сложности и болезненности забора костного мозга. В последние годы появились сообщения, что жировая ткань взрослого организма содержит популяцию клеток с характеристиками, подобными ММСК костного мозга, которые способны при определенных условиях дифференцироваться в клетки других тканей и органов (Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H., Huang J.I. Futrell W.J., Katz A.J., Benhaim P., Lorenz H.P., Hedric M.H. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies// Tissue. Eng. 2001. V. 7. P. 211-226; Zuk P.A., Zhu M., Ashijian P., De Ugarte D.A., Huang J.I., Mizuno H., Alfonso Z.C., Fraser J.K., Benhaim P., Hedrick M.H. Human adipose tissue is a source ofmultipotent stem cells// Mol. Biol. Cell. 2002. V. 13. P. 4279-4295). Перспективность использования стволовых клеток жировой ткани обусловлена, в первую очередь, доступностью биологического материала и легкостью наращивания в условиях культивирования in vitro. Жировая ткань, которая часто и безболезненно удаляется во время операций по коррекции тела у пациентов (липоаспирации, блефаропластика), представляет собой ценный материал для получения ММСК.

За последние 5 лет были выделены только из костного мозга 4 субпопуляций клеток с фенотипом, подобным мезенхимным стволовым клеткам, ММСК - RS (rapidly self-renewing) клетки (Colter D.C., Class R., DiGirolamo C.M., Prockop D.J. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow // PNAS. 2000. V.97. P.3113-3218), МАРС (multipotent adult progenitor cells) (Reyes M., Lund Т., Lenvik Т., Aguiar D., Koodie L., Verfaillie K. M.. Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells// Blood. 2001. V.98. P.2615-2625), MIAMI (D'lppolito G., Diabira S., Howard G.A. et al. Marrow-isolated adult multilineage inducible (MIAMI) cells, a unique population of postnatal young and old human cells with extensive expansion and differentiation potential// J. Cell. Sci. 2004. V. 117. P. 2971-2981) и SD (serum-deprivated) клетки (Pochampally R, Prockop D.J. et al. Serum deprivation of human marrow stromal cells (hMSCs) selects for a subpopulation of early progenitor cells with enhanced expression of OCT-4 and other embryonic genes// Blood. 2004. V.103. P.1647-1652). Во всех перечисленных работах получены клетки, имеющие разные морфофункциональные характеристики и принципиальные отличия по экспрессии поверхностных антигенов в зависимости от условий выделения и культивирования. Все это свидетельствует о том, что биологическая основа и сигнальная программа мультипотентного генома РСК не достаточно изучена.

Известно, что в организме взрослого человека имеется запас резервных стволовых клеток, которые по своему составу не однородны. Считается, что в популяции стволовых клеток существуют свои собственные законы, в частности строгая иерархия (Minguell J.J., Erices A. and Conget P. Mesenchymal stem cells// Exp.Biol. Med.. 2001. V.226. P.507-520). Набор стволовых клеток включает примитивные стволовые клетки с неограниченным потенциалом самообновления и дифференцировки, мультипотентные потомки стволовых клеток - прогениторные клетки и линии уже детерминированных (коммитированных) предшественников. В связи с этим следует заметить, что во всех предпринимаемых на сегодняшний день попытках выделить популяцию стволовых клеток - родоначальниц ММСК человека из костного мозга и других тканей остается много неясного. Самое главное, что во всех случаях получены клетки, имеющие разные морфофункциональные характеристики и принципиальные отличия по экспрессии поверхностных антигенов. Насколько можно провести параллели между популяцией клеток, выделенной Колтером и клетками, охарактеризованными Верфайлле? Работы по выделению стволовой мезенхимной клетки - родоначальницы всех форм ее потомков требуют дальнейшего тщательного исследования. ММСК, выделенные из других биологических источников, в частности из жировой ткани, также имеют сильные отличия по своим характеристикам (Gronthos S., Franklin D.M., Leddy H.A., Robey P.O., Storms R.W., Gimble J.M. Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells// J. Cell Physiol. 2001. V.189. P.54-63; Mizuno H., Hyakusoku H.. Mesengenic potential and future clinical perspective of human processed lipoaspirate cells// J. Nippon. Med. Sch. 2003. V.70. З. 300-306; De Ugarte DA., Alfonso Z.C., Zuk P. A., Elbarbary A., Zhu M., Ashjian P., Benhaim P., Hedrick M.H., Fraser J. K... Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multilineage cells from adipose tissue and bone marrow// Immunology letters. 2003. V. 89. P. 267-270; Aust L., Delvin В., Foster S., Halvorsen Y, Hicok K., Laney Td.T., Sen A., Willingmyre G., Gimble J. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates// Cytotherapy. 2004. V.6. P.7-14).

Известен факт, что резервные стволовые клетки обладают повышенной жизнеспособностью и устойчивостью к экстремальным условиям окружающей среды. Считается, что резервная стволовая клетка тестикул - сперматогоний типа А0, более устойчива к химическим агентам и облучению, чем ее более коммитированные потомки А1-А4. Ваканти с соавторами (Vacanti M.P., Roy A., Cortiella J. et al. Identification and initial characterization of spore-like cells in adult mammals// J. of Cellular Biochemistry. 2001. V.80. P.455-460) сообщили о наличии маленьких, спорообразных клеток (диаметр-3 мкм) во всех тканях и органах млекопитающих, которые характеризовались широким спектром цитодиффференцировки. Эти клетки обладали высокой жизнеспособностью и сохранялись в экстремальных условиях: низкотемпературный и высокотемпературный шоки (-860°С; +860°С), гипоксия (кислородное голодание в течение 5 сут).

Работа по выделению клеток с характеристиками мультипотентных мезенхимных стволовых клеток, сохраняющихся в экстремальных условиях в биологически-доступной ткани как животных, так и человека, и их характеристика является актуальной. Актуальность работы по получению новых линий стволовых клеток, выделенных из доступного биологического источника, обусловлена тем, что способ выделения и очистка являются ключевыми моментами в получении различных популяций стволовых клеток из одних и тех же тканей и органов млекопитающих. В настоящий момент в России ни в одной коллекции клеточных культур не имеются в доступе охарактеризованные популяции стволовых клеток млекопитающих, в том числе человека. Получение культур стволовых клеток млекопитающих даст возможность провести расширенные эксперименты по изучению потенций этих клеток к направленной дифференцировке.

Направленная дифференцировка региональных стволовых клеток (РСК) является актуальной проблемой биологии и медицины. Благодаря современным достижениям биотехнологии в настоящее время положительно решается вопрос о клиническом применении РСК. Однако вопрос о возможном развитии инфекционных процессов в недифференцированных стволовых клетках под действием индукторов дифференцировки остается практически не изученным. Получение новых линий стволовых клеток позволит определить чувствительность РСК к вирусной инфекции и изучить развитие инфекции в РСК, индуцированных к дифференцировке в клетки заданной ткани. Выделенный нами диплоидный штамм клеток может представлять удобную модельную систему для изучения инфекций, в том числе и человека in vitro в дифференцированных и стволовых клетках. Получение культур стволовых клеток с уникальными характеристиками будет способствовать созданию технологических предпосылок для получения искусственных биологических тканей с заданными свойствами in vitro. Полученная диплоидная линия мультипотентных мезенхимных стволовых клеток подкожно-жировой клетчатки человека представляет перспективный материал для получения трехмерных тканевых трансплантатов и их тестирования в организме животного. На основе этих клеток можно будет создать клеточные системы для изучения молекулярных механизмов происходящих на уровне изменения экспрессии генов в процессе направленной дифференцировке. Кроме того, факт сохранения в ткани, подвергнутой физиологическому шоку, популяции стволовых клеток, позволяет сделать вывод о возможности сохранения генетических ресурсов млекопитающих, в том числе человека в экстремальных условиях.

В связи с этим в задачу наших исследований входило получить клетки с фенотипом ММСК. Поставленную задачу удалось достичь благодаря тому, что нами были созданы экстремальные условия для жизнеспособности и нормального функционирования клетки в ткани. Подкожно-жировую клетчатку получали в процессе липоаспирации у пяти пациентов под местной анестезией с их согласия. Для создания экстремальной ситуации ведущей к массовой гибели клеток использовали низкотемпературный шок. В результате из подкожно-жировой клетчатки, подвергнутой низкотемпературному шоку (-70°С), была выделена популяция клеток, которая сохранялась в экстремальных условиях для жизнеспособности и нормального функционирования клетки в ткани и отличалась своими признаками и свойствами от ММСК, выделенных из свежеизолированной подкожно-жировой клетчатки.

В известных источниках информации аналогичной линии не выявлено.

В качестве прототипа мы взяли клетки, выделенные нами ранее из подкожно-жировой клетчатки человека с фенотипом ММСК (Тепляшин А.С., Коржикова С.В., Шарифуллина С.З., Чупикова Н.И., Ростовская М.С., Савченкова И.П.. Характеристика мезенхимальных стволовых клеток человека, выделенных из костного мозга и жировой ткани// Цитология. 2005. Т.47. №2. С.130-135).

Клетки с фенотипом ММСК, полученные нами из свежеизолированного липоаспирата подкожно-жировой клетчатки, обладали следующими свойствами и признаками.

Морфологические признаки. Клеточная популяция, выделенная нами из свежеизолированной жировой ткани, была гетерогенна и состояла из 3-х сильно отличающихся друг от друга по морфологии клеток. Первый тип клеток включал крупные распластанные клетки (до 60 мкм в диаметре), фибробластоподобной морфологии, с повышенной гранулярностью, а также многочисленными вакуолями и выростами цитоплазмы. Второй тип клеток представлял собой субпопуляцию малых веретеновидных клеток диаметром 10-15 мкм, четко выделенным ядром и гомогенной цитоплазмой. Третий тип представляли клетки округлой формой с вытянутым с одной стороны плоским выростом цитоплазмы, размер клеток достигал 40 мкм; отмечалось темное ядро, смещенное к одному краю, гетерогенная цитоплазма и повышенная гранулярность в ядерной области.

Иммунофенотипирование. Цитофлуореметрический анализ (цитометр Epics Elite Coulter) выявил на их поверхности наличие АГ, характерных для ММСК человека. Так, клетки положительно окрашивались AT (BD Bioscience Pharmingen, США) к АГ: CD29, CD44, CD49a, b, d, CD73, CD90, CD105, CD166, HLA АВС. Клетки были отрицательны по CD34, CD45 и CD133 - маркерам, свойственным стволовым клеткам крови, CD31 маркеру эндотелиальных клеток, CD 117 (рецептор фактора стволовых клеток c-kit), STRO-1, а также HLA DR, HLA DP, HLA DQ.

Цитогенетика. Цитогенетический анализ включал анализ 31 метафазных пластинок на каждом пассаже. На ранних пассажах не было выявлено анеуплоидии. Дифференциальная окраска не обнаружила структурных перестроек хромосом. На более поздних пассаж (9 пассаж) была выявлена моносомия по хромосоме 6. Таким образом, G-анализ хромосом позволил сделать заключение, что линия имеет диплоидный кариотип 46, XX, который может измениться на протяжении длительного культивирования in vitro

Потенциал к дифференцировке. Дальнейшая характеристика выделенной популяции клеток выявила их мультипотентность. При индукции к дифференцировке in vitro они показали способность формировать клетки костной, жировой и хрящевой тканей.

Предложенная нами линия мультипотентных мезенхимных стволовых клеток в отличие от прототипа обладает следующими свойствами и признаками.

Морфологические признаки. Клеточная популяция была представлена одним типом клеток гомогенных по морфологии. Эти клетки были мелкими (d-10 цм), веретенообразными по форме с четко выделенным ядром и гомогенной цитоплазмой.

Культуральные свойства. Основной средой для культивирования клеток, выделенных из замороженной ПЖК, является среда ДМЕМ с низким содержанием глюкозы (1 г/л) фирмы Gibco Invitrogene, Life Technologies, США, дополненная 10% сыворотки плода коров (СПК) фирмы HyClone, Perbio, Бельгия, однократным раствором заменимых аминокислот и антибиотиками (Gibco, Invitrogene, Life Technologies, США). Конечная концентрация стрептомицина - 100 мкг/мл, а пенициллина - 100 Ед/мл.

Время удвоения клеток составляет 60-64 час, митотический индекс 36⁰/₀₀.

Цитогенетика. Цитогенетический анализ включал анализ 38 метафазных пластинок на каждом пассаже. В образцах на 10-м пассаже из 38 метафазных пластинок 35 имели диплоидный кариотип 466 XX. В трех при кариотипе 456ХХ отсутствовали разные хромосомы, что свидетельствует о том, что кариотип 45, XX - результат методической потери по одной хромосоме из набора хромосом. Анеуплоидии не было выявлено. Дифференциальная окраска не обнаружила структурных перестроек хромосом. Таким образом, G-анализ хромосом позволил сделать заключение, что линия имеет диплоидный кариотип 46, XX, который сохраняется на протяжении 10-ти пассажей in vitro.

Иммунофенотипирование. Конкретные примеры характеристики предложенной линии отражены в таблице 1. Сравнительный анализ экспрессии данных АГ в клетках, выделенных из ШКТ, подвергнутой низкотемпературному шоку, показал, что среди этих двух популяций имеются некоторые различия. Как видно из результатов, представленных в таблице, клеточная популяция, выделенная из жировой ткани, подвергнутой низкотемпературному шоку, была более гомогенна. В ней отсутствовала примесь гематопоэтических (CD34, CD45, CD133) и эндотелиальных клеток (РЕСАМ-1). Значительные отличия наблюдались между этими двумя клеточными популяциями по экспрессии интегринов. Экспрессия α1- и α4 - интегринов была выше у полученных клеток на 8,0 и 8,3% соответственно, а экспрессия α6-интегрина, экспрессия которого характерна для дермальных фибробластов, была значительно ниже (на 20%) в этой группе по сравнению с прототипом. Интересным оказался факт, что клеточная популяция, полученная из ткани, подвергнутой температурному шоку, была отрицательной (2,6%) при окраске Ат к Stro-1, экспрессия которого характерна для стромальных клеток.

Потенции к дифференцировке. В отличие от прототипа полученная популяция обладала более высокой эффективностью к направленной дифференцировке (таблица 2). Так при культивировании в среде, индуцирующей дифференцировку в клетки костной ткани, на 14 сут были обнаружены клетки, положительно окрашенные на щелочную фосфатазу. При более продолжительном культивировании в этой же среде ММСК формировали минеральные комплексы, которые выявлялись при окраске ализариновым красным и von Kossa. Клетки, выделенные из ПЖК, подвергнутой низкотемпературному шоку, образовывали минеральные комплексы с эффективностью 70-78%, в то время как клетки из свежеизолированной ткани формировали в эти же сроки минеральные комплексы с эффективностью в 24-30%.

При культивировании клеток, выделенных из ПЖК как подвергнутой низкотемпературному шоку, так и свежеизолированной, в среде, которая содержала индукторы, направляющие дифференцировку в клетки жировой ткани, наблюдали формирование кластеров адипоцитов с одинаковой эффективностью. Морфологическая оценка подтверждалась при окраске экспериментальных образцов специальными красителями (Oil red).

Агрегация клеток с последующим культивированием в среде, содержащей индуктор дифференцировки в клетки хрящевой ткани, приводила к формированию в пробирке трехмерных кусочков хрящевой ткани. Иммуноцитохимический анализ полученных образцов установил наличие клеток, положительно окрашенных антителами к маркеру хондроцитов - аггрекану. Эффективность формирования трехмерных агрегатов с активной областью хондрогенеза у предложенных клеток была значительно выше и превышает таковую у ММСК жира в 3 раза.

Туморогенность клеток оценивали посредством введении клеточной суспензии в организм бестимусных мышей линии Balb/C nude. Клетки вводили в хвостовую вену 30 мышам в концентрации 1×10⁶ клеток на 1 кг живой массы. Спустя 4-8 недель после введения мышей забивали и оценивали их органы и ткани на наличие опухолей. Анализ результатов показал, что клетки не вызывают образование опухолей.

Предложенная нами линия клеток депонирована в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко (СХЖ РАСХН) под №65.

Предложенная нами линия апробирована с положительным результатом в 2006 г. в «ООО» Институт Стволовой Клетки, г.Москва.

Технико-экономическая эффективность.

Таким образом, было установлено, что в подкожно-жировой клетчатке в экстремальных условиях для организма сохраняется популяция клеток с фенотипом, подобным ММСК жировой ткани. По сравнению с прототипом клетки обладают следующими характеристиками:

- клеточная популяция гомогенна и представлена одним типом маленьких (диаметр - 10 мкм), веретенообразных по форме клеток;

- клетки не имеют примеси гематопоэтических и эндотелиальных клеток, имеются отличия в экспрессии интегринов, Stro-1, CD 10 и др. маркеров стволовых клеток;

- обладает диплоидным набором хромосом, который сохраняется при длительном культивировании (10 пассажей);

- имеют в три раза большую эффективность к индуцированной дифференцировке в направлении остео- и хондрогенеза;

- не туморогененны.

Предложенная линия найдет применение в лабораториях занимающихся тканевой инженерией и новыми клеточными технологиями с целью регенерации и репарации тканей и органов млекопитающих, в том числе человека. Полученная диплоидная линия мультипотентных мезенхимных стволовых клеток подкожно-жировой клетчатки человека представляет перспективный материал для получения костных и хрящевых трехмерных тканевых трансплантатов. На основе этих клеток можно будет создать клеточные системы для изучения молекулярных механизмов, происходящих на уровне изменения экспрессии генов в процессе направленной дифференцировки. Кроме того, факт сохранения в ткани, подвергнутой шоку, популяции мультипотентных стволовых клеток, позволяет сделать вывод о возможности сохранения генетических ресурсов млекопитающих, в том числе человека, в экстремальных условиях. Эти клетки представляют ценный материал для клеточной инженерии с целью конструирования новых клеточных типов посредством ядерного переноса.

Таблица. 1.
Сравнительный анализ экспрессии поверхностных антигенов в клетках, выделенных и свежеизолированной (прототип) и подвергнутой низкотемпературному шоку жировой ткани (предложенный) Антиген Доля клеток жировой ткани с данным АГ (%) свежевыделенная ткань (прототип) замороженная ткань (предложенный) CD10 металлопротеиназа 73,6 88,6 CD13 металлопротеиназа 99,4 99,3 CD29 β1-интегрин 98,3 98,5 CD31 РЕСАМ-1 3,4 0,9 CD34 сиаломуцин 5,7 2,2 CD44 НСАМ 98.6 98,2 CD45 LCA 1,7 0,7 CD49a α1-интегрин 85,8 93,8 CD49b α2-интегрин 96,2 95,0 CD49d α4-интегрин 81,9 90,2 CD49f α6-интегрин 33,2 13,2 CD54 ICAM-1 78,6 84,6 CD71 трансфериновый рецептор 85,3 86,7 CD73 конечная 5' нуклеотизаза 99,1 99 CD90 Thy-1 99,1 99,3 CD105 эндоглин 98,8 99 CD106 5,9 2,6 CD117 рецептор фактора стволовых клеток 2,8 2,2 CD133 AC133-2 2,5 0,2 CD166 ALCAM 98,0 98,0 Stro1 17,6 2,6 HLA-A, B, C 99,1 98,8 HLA-DP 1,9 0,4 HLA-DQ 0,8 0,1 HLA-DR 3,5 1,5

Таблица 2.
Сравнительный анализ эффективности дифференцировки ММСК при индукции в клетки жировой, костной и хрящевой тканей Штамм клеток Эффективность дифференцировки клеток при индукции адипогенеза остеогенеза хондрогенеза Прототип +++ ++ ++ Предложенный +++ +++++ +++++

Изобретение относится к области ветеринарной и медицинской биотехнологии. Предложена линия мультипотентных мезенхимных стволовых клеток подкожно-жировой клетчатки человека (panniculus adiposus homo sapiense) для клеточной и тканевой инженерии. Изобретение может быть использовано в лабораториях, занимающихся тканевой инженерией и новыми клеточными технологиями, с целью регенерации и репарации тканей и органов млекопитающих, в том числе человека. Полученный диплоидный штамм резервных стволовых клеток представляет перспективный материал для получения костных и хрящевых трехмерных тканевых трансплантатов и их тестирования в организме животного. 2 табл.

Линия мультипотентных мезенхимных стволовых клеток подкожно-жировой клетчатки человека (panniculus adiposus homo sapiense), депонированная в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко (СХЖ РАСХН) под №65, для клеточной и тканевой инженерии.