СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОМЕТРИАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ ТКАНИ Российский патент 2016 года по МПК C12N5/775 

Изобретение относится к области медицины, в частности к регенеративной медицине, которая включает принципы и методы клеточной биологии и инженерии, то есть культивирование и имплантацию клеток, предназначенных для стимуляции роста и регенерации эндометрия при лечении гинекологических заболеваний.

В настоящее время в мире проводятся обширные исследования по разработке технологий использования мезенхимных стволовых клеток (МСК) для клеточной терапии различных заболеваний. МСК обладают высокой пролиферативной активностью и способны дифференцироваться в разные ткани взрослого организма. Основное достоинство этих клеток состоит в возможности использования для восстановительной трансплантации аутологичных (собственных) клеток, что снижает риск отторжения и развития нежелательных иммунологических реакции. Клетки со свойствами МСК выделены из различных тканей взрослого организма, включая подкожную и висцеральную жировую ткань, легкие, пульпу зуба, периодонтальную связку, скелетные мышцы, хрящи, сухожилия, синовиальную оболочку. Наиболее распространенными источниками для выделения МСК, помимо костного мозга, являются жировая ткань (Parker and Katz, 2006) и пупочный канатик (Bieback and Kluter, 2007).

Установлено, что МСК костного мозга способны дифференцироваться не только в многочисленные типы клеток мезенхимального происхождения, включая клетки костной, хрящевой, мышечной, сухожильной и жировой ткани, но также в клетки других зародышевых листков, включая глиальные клетки и нейроны, гепатоциты, клетки панкреатических островков (Woodbury et al., 2000). Кроме того, МСК костного мозга обладают высокой миграционной способностью, секретируют большое число биологически активных молекул и обладают иммуномодулирующим действием. Этими ключевыми свойствами МСК костного мозга и обусловлена возможность их эффективного применения в качестве источников стволовых клеток для лечения гематологических, аутоиммунных, сердечно-сосудистых заболеваний, травм и заболеваний костно-суставной системы (Wang et al., 2011; Bernardo et al., 2012).

Кроме костного мозга, МСК были выделены из жировой ткани (Parker, Katz, 2006), пуповинной крови (Harris et al., 2007), амниотической жидкости (De Coppi et al., 2007), а также из ткани эндометрия (Cho et al., 2004; Gargett, 2006). Не модифицированные эндометриальные мезенхимные стволовые клетки (эМСК) были использованы в экспериментальных исследованиях на животных при таких заболеваниях, как мышечная дистрофия Душена, инфаркт миокарда (Hida et al., 2008; Toyoda et al., 2007), инсульт (Borlongan et al., 2010), болезнь Паркинсона (Wolff et al., 2011).

Известен случай восстановления эндометрия при использовании клеточной терапии (Nagori et al., 2011) (аналог 1). Для восстановления эндометриальной ткани матки было проведено лечение пациентки стволовыми клетками, выделенными из ее костного мозга (т.е. аутологичными клетками). После пункции проводили забор костного мозга аспирацией в количестве 45 мл. Затем выделяли стволовые клетки при помощи магнитного сортинга по CD9, CD44, и CD90. Было получено 39 млн положительных по этим маркерам клеток, которые были введены внутриматочно. После дополнительной гормонотерапии была проведена успешная процедура экстракорпорального оплодотворения, что привело к развитию беременности.

Таким образом, стволовые клетки, изолированные из аутологичного костного мозга, могли регенерировать повреждённый эндометрий. Однако этот способ довольно травматичный (пункция костной ткани, которая может занимать 2-3 часа, и связана с риском развития осложнений) и трудоёмкий.

Несмотря на все достоинства стволовых клеток, методы получения клеточного материала из костного мозга и жировой ткани являются болезненными и могут быть опасными для доноров, а клетки из пупочного канатика можно получить лишь раз в жизни (при рождении). Это приводит к необходимости поиска альтернативного источника МСК.

Эндометриальные мезенхимные стволовые клетки из менструальной крови (эМСК) благодаря не инвазивному для донора способу их получения, высокой пластичности, активной пролиферации и кариотипической стабильности являются привлекательным объектом для применения в клинике (Земелько, 2011).

Широкое использование клеточной терапии ограничивается из-за предполагаемых онкогенных рисков. Хотя большинство исследователей считают, что МСК костного мозга человека при культивировании не трансформируются, дискуссия относительно туморогенных свойств этих клеток продолжается. Накопленные к настоящему времени данные противоречивы. Поскольку МСК, так же, как и фибробласты, происходят из мезодермы и морфологически с ними сходны, можно было бы предположить, что их поведение в культуре будет сходным. Действительно, МСК мышей, как и их фибробласты, при длительном культивировании трансформируются и иммортализуются (Гринчук и др., 2008; Попов и др., 2009), напротив длительное культивирование МСК из костного мозга человека, так же, как диплоидных фибробластов человека, не сопровождается их спонтанной трансформацией (Bernardo et al., 2007). Тем не менее, появились публикации о спонтанной трансформации стволовых клеток жировой ткани человека (Rubio et al.,2005), клеток костного мозга (Røsland et al., 2009), нейрональных стволовых клеток (Wu et al., 2011). Однако первые две публикации недавно были отозваны авторами в связи с тем, что в обоих случаях, как оказалось, имела место кросс-контаминация культур клетками постоянных опухолевых линий человека (Torsvik et al., 2012), то есть факт спонтанной трансформации МСК не подтвердился.

Таким образом, для уменьшения степени онкогенного риска трансплантации стволовых клеток необходима их предварительная модификация. Создание методов, позволяющих ограничить пролиферативную активность трансплантируемых клеток, сделает их более безопасными для клинического применения.

Известно, что клетки с остановленной пролиферацией активно применяются in vitro в качестве фидерного слоя для культивирования эмбриональных стволовых клеток (Lee et al., 2005) (аналог 2). Для этих целей используют различные культуры клеток животных и человека, где в основном для остановки деления применяются химические агенты (например, митомицин С) (Nieto A. 2007) (аналог 3). Эндометриальные мезенхимные стволовые клетки (эМСК) с остановленной пролифераций с помощью митомицина С также с успехом применяются в качестве фидерного слоя для культивирования клеток (Земелько и др., 2011) (аналог 4). Однако клетки, обработанные химическими агентами могут быть опасны при использовании в клинических целях.

Другим наиболее изученным и наиболее подходящим способом модификации, останавливающим пролиферацию различных типов клеток, таких как эмбриональных и мезенхимных стволовых клеток, является воздействие ионизирующей радиации (Sokolov, 2013) (аналог 5). Среди изученных клеток действие ионизирующей радиации на пролиферацию эндометриальных мезенхимных стволовых клеток в научно-технической литературе нами не обнаружено.

Известен способ (Михайлов и др., 2013), который является наиболее близким по техническому осуществлению к предлагаемому изобретению и поэтому выбран в качестве прототипа, заключающийся в получении эндометриальной ткани человека из менструальной крови, культивировании клеток для получения адгезивной клеточной популяции, повторном культивировании для получения монослоя эндометриальных стволовых клеток, анализе стволовых свойств полученных клеточных культур, определении экспрессии специфичных для них поверхностных маркеров, последующей трансплантации интактных стволовых клеток в стенку рога матки псевдобеременных крыс и серии морфологических исследований для оценки роста, целостности и дифференцировки децидуальных клеток эндометриальной ткани крыс.

Недостатком способа является применение активно делящихся стволовых клеток с возможным риском онкогенной трансформации. Предлагаемое изобретение лишено указанных недостатков благодаря модификации стволовых клеток нелетальными дозами ионизирующей радиации для остановки пролиферации.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение эффективности и надежности способа, упрощение способа модификации стволовых клеток и имеет ряд преимуществ, которые обусловлены снижением риска онкогенной активности эндометриальных мезенхимных стволовых клеток с целью дальнейшего использования для имплантации.

Технический результат достигается тем, что в известном способе получения стволовых клеток для культивирования и имплантации, предназначенных для регенерации эндометриальной ткани, который включает известные и общие с заявленным новым способом признаки, используют эндометриальную ткань человека из менструальной крови, культивируют клетки для получения адгезивной клеточной популяции, повторно культивируют для получения монослоя эндометриальных стволовых клеток, анализируют стволовые свойств полученных клеточных культур, определяют экспрессию специфичных для них поверхностных маркеров, трансплантируют интактные стволовых клеток в стенку рога матки псевдобеременных крыс, проводят серию морфологических исследований для оценки роста, целостности и дифференцировки децидуальных клеток эндометриальной ткани крыс, в предлагаемом способе интактные эндометриальные мезенхимными стволовые клетки человека обрабатывают нелетальными дозами ионизирующей радиации для остановки пролиферации. При этом предварительно устанавливают нелетальную дозу ионизирующей радиации. Для это эМСК человека обрабатывают в диапазоне допустимых доз ионизирующей радиации от 3.0 до 10.0 Гр. И оптимальная доза ионизирующей радиации составляет 4,5 Гр. При такой дозе ионизирующей радиации пролиферации клеток не происходит, но сохраняется их жизнеспособность. Затем такие клетки имплантируют в стенку рога матки псевдобеременных крыс и проводят морфологические исследования эндометриальной ткани крыс для установления стимулирующего действия стволовых клеток человека на образование децидуальной оболочки.

Заявленный способ был апробирован в лабораторных условиях на базе Федерального государственно бюджетного учреждения науки Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург. Результаты проведенных исследований поясняются следующими примерами.

Наиболее предпочтительный вариант осуществления предлагаемого изобретения описан в примере 1.

Пример 1

В частном конкретном случае для осуществления предлагаемого изобретения выделяют эндометриальные мезенхимные стволовые клетки (эМСК). Для этого менструальную кровь, содержащую фрагменты эндометрия, получают от женщин, проходящих подготовку к экстракорпоральному оплодотворению в Международном центре репродуктивной медицины (г. Санкт-Петербург). Возраст пациенток составляет 30-40 лет. У всех менструальный цикл регулярный 27-30 дней. Забор менструальной крови проводят на 2-й день менструального цикла. Кровь собирают аспиратором Ipas MVA plus c насадкой диаметром 4 мм, введенным в цервикальный канал до внутреннего зева. В среднем от каждой пациентки получают 1-2 мл. Полученный образец переносят в фосфатно-солевой буфер (PBS) c добавлением цитрата натрия и 10 % смеси антибиотика и антимикотика (смесь пенициллина, стрептомицина и амфотерицина). В этом растворе при температуре 4°С кровь доставляют в лабораторию в течение 2−18 ч. Центрифугированный осадок, содержащий фрагменты эндометрия, ресуспензируют в PBS с добавлением 10 % смеси антибиотика и антимикотика и инкубируют в течение 1 ч при температуре 37°С. Затем отцентрифугированные эндометриально-менструальные клетки переносят в 6-см чашки Петри. Для получения адгезивной клеточной популяции клетки культивируют в среде DMEM/F12, содержащей 10% бычьей эмбриональной сыворотки, 1% смеси антибиотика и антимикотика, 1% глутамакса. Клетки культивируют в течение 3−7 сут. За это время среду меняют несколько раз. Полученную адгезивную популяцию клеток (4−9 млн) пересевают с помощью 0,05% раствора трипсина и EDTA в соотношении 1:4 до 5-го пассажа 2 раза за 1 нед, далее в соотношении 1:3 и замораживают. Для культивирования используют флаконы Т25 и Т75. Плотность при пересеве составляет 14−15 тыс. кл./см².

Иммунофенотипический анализ полученных эМСК на поверхностные CD-маркеры проводят с использованием проточного цитофлуометра Epics XL (Beckman Coulter, США). Единичную клеточную суспензию получают при помощи 0.05%-ного трипсина и EDTA. Клетки (1млн/мл) ресуспензируют в растворе PBS, содержащем 5 % FBS. Для анализа используют антитела, конъюгированные с FITC: CD34, CD44, CD45, CD90, CD130, а также антитела к CD13, CD19, CD29, CD73, CD105, CD117, HLA-DR, меченные флуорофором PE (фикоэритрин).

Для анализа стволовых свойств полученных культур используют методы направленной дифференцировки в адипогенном и остеогенном направлении. Адипогенную дифференцировку проводят следующим образом. Клетки (2 х 10⁴ кл/см²) высевают в чашки Петри, покрытые 0.1%-ным желатином. После образования субмонослоя (80 % конфлюентности) в ростовую среду добавляют следующие факторы: 1 мМ дексаметазона, 0.5 мМ изобутилметилксантина, 10 мкг/мл рекомбинантного инсулина человека и 100 мМ индометацина. Клетки культивируют в этой дифференцировочной среде в течение 5 сут со сменой половины среды каждые 2-е сут. Следующим этапом клетки переводят на 1−2 сут в среду, поддерживающую их жизнеспособность, а именно: DMEM/F12, содержащую 10 % FBS, 1 % глутамакса, 1 % смеси пенициллина и стрептомицина и 10 мкг/мл инсулина. Таким образом, попеременно меняя среды культивирования, клетки дифференцируют 3−5 нед, а затем фиксируют 10%-ным формальдегидом в течение 1 ч. Жировые капли окрашивают красителем Oil Red согласно протоколу фирмы-производителя. Контрольные клетки культивируют одновременно с направленно-дифференцированными в той же ростовой среде, но без добавления стимулирующих факторов.

Остеогенную дифференцировку проводят следующим образом. Клетки (2 × 10⁴ кл/см²) высевают в чашки Петри, покрытые 0.1%-ным желатином. После образования монослоя (100 % конфлюентности) в ростовую среду добавляют следующие дифференцировочные факторы: 100 нМ дексаметазона, 10 мМ бета-глицерофосфата, 0.2 мМ аскорбин-2- фосфата. Клетки дифференцируют 3−5 нед. со сменой половины объема среды каждые 2−3сут. Затем клетки фиксируют 70%-ным ледяным этанолом 1 ч и окрашивали ализариновым красным (pH 4.1) 30 мин. Контрольные клетки культивируют одновременно с направленно-дифференцированными в той же ростовой среде, но без добавления стимулирующих факторов.

Установление нелетальной дозы ионизирующей радиации с помощью определения пролиферативной активности эМСК.

Для обеспечения онкогенной безопасности трансплантации стволовых клеток проводят остановку пролиферации воздействием ионизирующей радиацией в дозах 3,0 - 10,0 Грей (принятое сокращение Гр, которое используется в дальнейшем). Облучение клеток проводят на стационарном рентгеновском аппарате РАП-150/300-14 по 0.49 Гр/мин.

Культивирование эМСК для подготовки к обработке производят с использованием среды DMEM/F12 с добавлением эмбриональной коровьей сыворотки и глютамина. Для этого производят посев клеток в культуральные чашки Петри плотностью 14−15 тыс. кл./см². После достижения монослоя клетки облучают в дозах от 3,0 до 10,0 Гр (0,49 Гр/мин). После этого клетки культивируют в течении 24 часов при t 37°С и анализируют их пролиферативную активность, жизнеспособность и активность фермента SA-β-галактозидазы.

пролиферативной активности проводят построение графиков роста клеток в культуре. Для этого культуры модифицированных и не модифицированных эМСК сеят в чаши Петри в количестве 1 × 10⁵ клеток на чашку. Ежедневно, в течение 4 сут выполняют подсчет клеток. Для этого производят снятие клеток с подложки и переведение их в суспензию. Открепление клеток производят с помощью смеси трипсина и ЭДТА. Поскольку ферментативное действие трипсина может повредить мембраны клеток, что приводит к снижению их жизнеспособности, применяют трипсин низкой концентрации (0,05%) и на возможно более короткий срок (в пределах 5 мин). Для быстрого действия трипсина после удаления ростовой среды монослой клеток несколько раз промывают раствором PBS. После открепления клеток действие трипсина инактивируют путем добавления к суспензии достаточного количества ростовой среды с 10% содержанием сыворотки. Для достижения гомогенности суспензию аккуратно пипетируют. После приготовления одноклеточной суспензии производят подсчет клеток в камере Горяева. Для каждой группы измерений используют по 2 чашки, подсчет производят трижды и вычисляют среднее значение. По полученным данным строят график роста клеток в культуре.

На Фиг. 1 видно, что количество клеток в культуре модифицированных эМСК после облучения 4,5 Гр не увеличивается со временем культивирования, в отличии от количества клеток в культуре не модифицированных эМСК и при облучении в меньшей дозе (3 Гр). Так же не происходило уменьшения количества клеток за счет гибели, как это можно наблюдать при облучении в 10 Гр. Таким образом была подобрана оптимальная доза для модификации (4,5 Гр), при которой клетки не пролиферировали, но сохраняли жизнеспособность.

(Фигура 1. График роста модифицированных и не модифицированных эМСК в культуре.)

Оценка жизнеспособности и распределения модифицированных эМСК по стадиям клеточного цикла методам цитофлюорометрии.

Жизнеспособность клеток определяют методом проточной цитофлюорометрии. Определено, что жизнеспособность клеток сохраняется и соответствует соотношению живых и мертвых клеток в не модифицированных эМСК (Таблица 1).

Таблица 1

Сравнение жизнеспособности не модифицированных и модифицированных ионизирующей радиацией в дозе 4,5 Гр эМСК

  Не модифицированные эМСК Модифицированные ионизирующей радиацией в дозе 4,5 Гр эМСК Доля живых клеток, % 89,60 ± 0,98 89,20 ± 0,98 Доля мертвых клеток, % 10,40 ± 0,98 10,80 ± 1,05

В Таблице 2 приведены данные распределения эМСК по стадиям клеточного цикла. Приведенные данные свидетельствуют о том, что в результате воздействия на клетки ионизирующим облучением происходит уменьшение доли клеток, находящихся в S - фазе клеточного цикла, по сравнению с не модифицированными эМСК и накопление клеток в фазе G1, что свидетельствует об остановке пролиферации в эМСК.

Таким образом, модификация эМСК ионизирующей радиацией в дозе 4,5 Гр вызывает остановку пролиферации, но не влияет на их жизнеспособность.

Таблица 2

Сравнение распределения немодифицированных и модифицированных ионизирующей радиацией в дозе 4,5 Гр эМСК по стадиям клеточного цикла

Стадия клеточного цикла Доля клеток в культурах не модифицированных эМСК, % Доля клеток в культурах модифицированных ионизирующей радиацией в дозе 4,5 Гр эМСК, % G0-G1 57,00 ± 0,42 69,90 ± 1,06 S 21,15 ± 3,74 5,95 ± 0,98 G2-M 21,85 ± 2,75 20,95 ± 0,48

Определение активности фермента SA-β-галактозидазы в модифицированных эМСК.

Эффективность воздействия ионизирующей радиации определяют методом выявления активности фермента SA-β-галактозидазы. Этот фермент является лизосомальной гидролазой и активен в норме при рН 4.0. Идентификация не пролиферирующих клеток основана на том, что в них этот фермент проявляет свою активность при рН 6.0. Идентификацию проводят с использованием промышленно изготовленных наборов для определения активности фермента SA-β-галактозидазы в соответствии с инструкцией производителя. Активность фермента оценивают по окрашиванию цитоплазмы исследуемых клеток в синий цвет при рН 6.0.

На Фиг. 2 (а) видно окрашивание цитоплазмы клеток в синий цвет в модифицированных ионизирующей радиацией в дозе 4,5 Гр эМСК, что свидетельствует об остановке пролиферации. Тогда как в не модифицированных эМСК окрашивания не наблюдается (Фиг. 2 (б)).

(Фигура 2. Проявление активности фермента SA-β-галактозидазы в не модифицированных и модифицированные ионизирующей радиацией в дозе 4,5 Гр эМСК при pH 6.0. Ув. х 40

а - модифицированные ионизирующей радиацией в дозе 4,5 Гр эМСК,

б - не модифицированные эМСК).

Пример 2

Апробацию предлагаемого способа получения эндометриальных мезенхимных стволовых клеток (эМСК) человека, предназначенных для регенерации ткани, проводят на 30 половозрелых белых беспородных крысах-самках массой 200-220 г следующим образом. Для подготовки модели псевдобеременности у крыс методом изучения влагалищных мазков отбирают беспородную белую крысу в стадии «эструс». Для индукции псевдобеременности проводят раздражение влагалища отобранной крысы фарадическим электрическим током частотой 1 Гц, напряжением 10 мВ на протяжении 40 секунд. После проведенных манипуляций животному предоставляют покой. На пятый день, в стерильных условиях, под эфирным нарком животное фиксируют на операционном столе в спинном положении. Операционное поле тщательно выбривают и дважды обрабатывают антисептиком. Разрез 2-3 см проводят по средней линии живота от таза вверх. После вскрытия брюшной полости из боковых синусов в операционную рану извлекают рога матки. Оба рога (правый и левый) фиксируют с помощью пинцетов. Вблизи яичника правого рога матки в стенку матки трансплантируют суспензию модифицированных ионизирующей радиацией в дозе 4,5 Гр эМСК в дозе 300 тыс. клеток в 10 мкл. PBS. Вблизи яичника левого рога матки в стенку матки вводят 10 мкл. PBS. Далее все внутренние органы укладывают на свои места и рана ушивают послойно. После трансплантации животному проводят ежедневные подкожные инъекции прогестерона (2 мг на грамм веса). Через 6 дней крысу выводят из опыта передозировкой эфирного наркоза и для морфологического исследования извлекают оба рога матки.

Для трансплантации проводят подготовку и модификацию эМСК. Культивирование эМСК для подготовки к модификации и трансплантации производят с использованием среды DMEM/F12 с добавлением эмбриональной коровьей сыворотки и глютамина. Для этого производят посев клеток в культуральные флаконы 75 см² плотностью 14−15 тыс. кл./см². После достижения монослоя клетки обрабатывают ионизирующей радиацией в дозе 4,5 Гр на стационарном рентгеновском аппарате РАП-150/300-14 по 0.49 Гр/мин. После этого клетки культивируют в течении 24 часов при t 37°С. Далее производят снятие клеток с подложки и переведение их в суспензию. Для открепления клеток применяют смесь трипсина и ЭДТА низкой концентрации (0,05%) на 5 мин. Для быстрого действия трипсина после удаления ростовой среды монослой клеток несколько раз промывают PBS. После открепления клеток действие трипсина инактивируют путем добавления к суспензии достаточного количества ростовой среды с 10% содержанием сыворотки. Для достижения гомогенности суспензию аккуратно пипетируют. После приготовления одноклеточной суспензии производят подсчет клеток в камере Горяева. Далее культуральную среду заменяют на PBS. Для этого суспензию клеток центрифугируют 5 мин при 1500 об./мин, сливают супернатант и ресуспензируют осадок в PBS, доводя количество клеток до нужной концентрации путем разведения. После чего суспензию клеток набирают в шприцы в необходимом количестве для дальнейшей трансплантации. Все манипуляции, во избежание инфицирования животного, проводят с соблюдением стерильности. Далее в течении часа производят трансплантацию подготовленной суспензии экспериментальным животным.

Для подтверждения стимулирующего действия модифицированных ионизирующей радиацией в дозе 4,5 Гр эМСК на образование децидуальной оболочки (децидуа) в матке псевдобеременееных крыс проводят микроскопическое изучение крысиной эндометриальной ткани. Контрольным рогом служит левый рог матки, в который вводили PBS. Срезы сформировавшихся децидуа толщиной 15 мкм готовят на криостате так, чтобы плоскость среза была перпендикулярна или параллельна длинной оси рогов матки. При этом децидуа ориентировали так, чтобы срез проходил также параллельно мезометрально-антимезометральной оси матки. Строгая ориентация плоскостей срезов децидуа позволяет иметь репрезентативные срезы для изучения региональной дифференцировки клеток децидуа (Михайлов, 1998). Срезы фиксируют в смеси этанола- метанола при -20°С в течение 2 минут и окрашивали гематоксилином и эозином. При микроскопическом изучении оценивают целостность децидуа и отсутствие очагов воспаления или некроза.

Анализ полученных срезов показал, что трансплантация модифицированных ионизирующей радиацией в дозе 4,5 Гр эМСК в эндометрий псевдобеременных крыс не нарушает дифференцировку децидуальных клеток и организацию ткани, сохраняя в образовавшейся децидуальной оболочки крыс взаимное расположение дифференцированных клеток.

Для определения степени развития децидуа в экспериментальном и контрольном рогах матки проводят выделение децидуальной ткани и ее взвешивание. Для этого рога матки разрезают вдоль и отделение ткани производят механическим способом. Статистическую обработку данных проводят по методу Вилкоксона-Манна-Уитни.

Данные по взвешиванию децидуальной ткани, после трансплантации не модифицированных эМСК псевдобеременным крысам, которую проводили в качестве положительного контроля для сравнения результатов, представлены в Таблице 3. Взвешивание децидуальной ткани, выделенной из контрольного и экспериментального рогов матки псевдобеременных крысы после введения не модифицированных эМСК показало, что масса образовавшийся ткани в роге матки после введения не модифицированных эМСК превосходит массу ткани в роге матки, в который вводили раствор PBS более чем в 3,5 раза. Это свидетельствует о стимулирующим действии введения эМСК на развитие децидуальной ткани.

Таблица 3

Масса децидуальной ткани после введения немодифицированных эМСК крысам

  Масса децидуальной ткани, мг Введение PBS 0,170±0,14 Введение не модифицированных эМСК 0,633±0,20

Данные по взвешиванию децидуальной ткани, после трансплантации не модифицированных эМСК убитых 95% этанолом (15 мин при t - 20°С) псевдобеременным крысам, которую проводили в качестве отрицательного контроля для сравнения результатов, представлены в Таблице 4. При взвешивании децидуальной ткани, выделенной из рогов матки после введения не модифицированных эМСК, убитых 95% этанолом, было обнаружено, что введение убитых клеток не вызывает увеличение массы и не оказывает стимулирующего эффекта на рост и развитие децидуальной ткани у крыс.

Таблица 4

Масса децидуальной ткани после введения не модифицированных убитых эМСК крысам

  Масса децидуальной ткани, мг Введение PBS 0,303±0,27 Введение не модифицированных эМСК убитых этанолом 0,203±0,28

Результаты взвешивания децидуальной ткани, выделенной из рогов матки крысы после введения модифицированных ионизирующей радиацией в дозе 4,5 Гр эМСК представленны в Таблице 5. Данные показывают, что введение модифицированных ионизирующей радиацией в дозе 4,5 Гр эМСК стимулирует образование децидуальной ткани в у крыс в не меньшей степени, чем введение не модифицированных эМСК.

Таблица 5

Масса децидуальной ткани после введения модифицированных ионизирующей радиацией в дозе 4,5 Гр эМСК крысам.

  Масса децидуальной ткани, мг Введение PBS 0,020±0,07 Введение модифицированных ионизирующей радиацией в дозе 4,5 Гр эМСК 0,190±0,01

Данные результаты показывают, что модифицированные ионизирующей радиацией в дозе 4,5 Гр эМСК сохраняют все свои терапевтические свойства in vivo, однако становятся более безопасными в онкологическом отношении.

Таким образом, установлено, что трансплантация модифицированных ионизирующей радиацией в дозе 4,5 Гр эМСК в месте будущего образования децидуальной оболочки псевдобеременных крыс существенно стимулирует рост децидуальной оболочки по сравнению с контрольным рогом матки, сохраняя при этом организацию ткани и взаимное расположение дифференцированных клеток эндометрия крысы. Полученные данные демонстрируют стимулирующее действие модифицированных ионизирующей радиацией в дозе 4,5 Гр эМСК на созревание и состоятельность эндометриальной ткани крыс, в условиях псевдобеременности экспериментальных животных.

Таким образом, разработанный нами способ модификации эМСК может использоваться для разработки способа онкогенно безопасного клинического применения стволовых клеток для лечения невынашивания беременности и других заболеваний, связанных с нарушениями дифференцировки эндометрия и несостоятельности децидуа при беременности.

Литература

1. Гринчук Т. М., Иванцов К. М., Алексеенко Л. Л, Кожухарова И. В., Зайчик А. М., Петров Н. С., Михайлов В. М., Попов Б. В. 2008. Характеристика культуры мезенхимных стволовых клеток мыши, экспрессирующих GPF. Цитология. 50 (12): 1030-1035.

2. Земелько В.И., Гринчук Т.М., Домнина А.П., Арцыбашева И.В., Зенин В.В., Кирсанов А.А., Бичевая Н.К., Корсак В.С., Никольский Н.Н. «Мультипотентные мезенхимные стволовые клетки десквамированного эндометрия. Выделение, характеристика и использование в качестве фидерного слоя для культивирования эмбриональных стволовых линий человека», Цитология т.53, №12, с.919-928.

3. Михайлов В.М., Домнина А.П., Никольский Н.Н. Способ стимуляции образования децидуальной оболочки эндометрия в эксперименте RU 2515475.

4. Михайлов В.М. 1998. Жизненный цикл децидуальных клеток. Автореферат док. дис. Санкт-Петербург, 54 с.

5. Попов Б.В., Петров Н.С., Михайлов В.М., Томилин А.Н., Алексеенко Л.Л., Гринчук Т.М., Зайчик А.М. 2009. Спонтанная трансформация и иммортализация мезенхимных стволовых клеток in vitro. Цитология. 51 (2) :91-102.

6. Bernardo M. E., N. Zaffaroni, F. Novara, et al. 2007. Long-term Cultures of Bone Marrow-Derived Human Not Undergo Transformation after Long-term In vitro Culture and Do Not Exhibit Telomere Maintenance Mechanisms Cancer Res.67:9142-9149.

7. Bieback K., Klüter H. 2007 Mesenchymal stromal cells from umbilical cord blood. Curr Stem Cell Res Ther.2(4):310-23.

8. Borlongan C. V., Kaneko Y., Maki M., Yu S.J., Ali M., Allickson J.G., Sanberg C. D., Kuzmin-Nichols N., Sanberg P. R. 2010. Menstrual Blood Cells Display Stem Cell-Like Phenotypic Markers and Exert Neuroprotection Following Transplantation in Experimental Stroke. Stem Cells Dev. 19 : 439−452.

9. Cho N. H., Park Y. K., Kim Y. T., Yang, H., Kim,S. K. 2004. Lifetime expression of stem cell markers in the uterine endometrium. Fertil. Steril. 81 : 403-407.

10. De Coppi P., Bartsch G. Jr., Siddiqui M.M., Xu T., Santos C.C., Perin L., Mostoslavsky G., Serre A.C., Snyder E.Y., Yoo J.J., Furth M.E., Soker S., Atala A. 2007. Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy. Nat. Biotechnol. 25 : 100−106.

11. Gargett C. E. 2006. Identification and characterization of human endometrial stem/progenitor cells. Aust. NZ J. Obstet. Gynaecol. 46 : 250-253.

12. Harris D.T., Badowski M., Ahmad N., Gaballa M.A. 2007. The potential of cord blood stem cells for use in regenerative medicine. Expert. Opin. Biol. Ther. 7 : 1311−1322.

13. Hida N., Nishiyama N., Miyoshi S., Kira S., Segawa K., Uyama T., Mori T., Miyado K., Ikegami Y. 2008. Novel cardiac precursor-like cells from human menstrual blood-derived mesen-chymal cells. Stem Cells. 26 : 1695-1704.

14. Lee J.B., Lee J.E., Park J.H., Kim S.J., Kim M.K., Roh S.I., Yoon H.S. 2005. Establishment and maintenance of human embryonic stem cell lines on human feeder cells derived from uterine endometrium under serum-free condition. Biol. Reprod. 72 : 42−49.

15. Nagori C.B., Panchal S.Y. and Patel H. 2011. Endometrial regeneration using autologous adult stem cells followed by conception by in vitro fertilization in a patient of severe Asherman's syndrome. Journal of Human Reproductive Sciences. 4: 43-48.

16. Nieto A., Cabrera C.M., Catalina P., Cobo F., Barnie A., Corte´s J.L., Barroso del Jesus A., Montes R., Concha A. 2007 Effect of mitomycin-C on human foreskin fibroblasts used as feeders in human embryonic stem cells: Immunocytochemistry MIB1 score and DNA ploidy and apoptosis evaluated by flow cytometry Cell Biology International 31 (2007) 269-278.

17. Parker A.M., Katz A.J. 2006. Adipose-derived stem cells for the regeneration of damaged tissues. Expert. Opin. Bio. Ther. 6 : 567−578.

18. Røsland G.V., Svendsen A., Torsvik A., Sobala E., McCormack E., Immervoll H., Mysliwietz J., Tonn J.C., Goldbrunner R., Lønning P.E., Bjerkvig R., Schichor C. 2009. Long-term cultures of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells frequently undergo spontaneous malignant transformation. Cancer Res. 69:5331-5339.

19. Rubio D., Garcia-Castro J., Martín M. C., Fuente R., Cigudosa J.C., Lloyd A.C., Bernadet A. 2005. Spontaneous human adult stem cell transformation. Cancer Res. 65:3035-3039.

20. Sokolov M and Neumann R. 2013 Lessons learned about human stem cell responses to ionizing radiation exposures: a long road still ahead of us. IntJ. Mol. Sci., 14, 15695-15723.

21. Torsvik A., Røsland G.V., Bjerkvig R. 2012. Spontaneous Transformation of Stem Cells In Vitro and the Issue of Cross-Contamination. Int. J. Biol. Sci. 8:1051-1052.

22. Toyoda M., Cui C., Umezawa, A. 2007. Myogenic transdifferentiation of menstrual blood-derived cells. Acta. myol. 26 : 176-178.

23. Woodbury D., Reynolds A., Black I.B. 2002. Adult bone marrow stromal stem cells express germline, ectodermal, endodermal and mesodermal genes prior to neurogenesis. J. Neurosci. Res. 96 : 908-917.

24. Wolff E.F., Gao X.B., Yao K.V., Andrews Z.B., Du H., Elsworth J.D., Taylor H.S. 2011. Endometrial stem cell transplantation restores dopamine production in a Parkinson's disease model. J. Cell. Mol. Med. 15 : 747−755.

25. Wu W., He Q., Li X., Zhang X., Lu A., Ge R., Zhen H., Chang A. E., Li Q., Shen L. 2011. Long-term cultured human neural stem cells undergo spontaneous transformation to tumor-initiating cells. Int. J. Biol. Sci.7: 892-901.

Изобретение направлено на снижение травматичности, времени выполнения способа и на повышение онкогенной безопасности применения стволовых клеток. Поставленная цель достигается тем, что у самок крыс вызывали состояние псевдобеременности, затем в стенку матки имплантировали стволовые клетки, выделенные из эндометрия человека после обработки ионизирующей радиацией для остановки пролиферации. Предлагаемый способ предназначен для разработки клинического применения стволовых клеток для лечения невынашивания беременности и других заболеваний, связанных с нарушениями функцией эндометральной ткани и несостоятельностью децидуальной оболочки при беременности. 2 ил., 5 табл., 2 пр.

Способ получения эндометриальных мезенхимных стволовых клеток человека, предназначенных для регенерации ткани, включающий получение эндометриальной ткани человека из менструальной крови, культивирование клеток для получения адгезивной клеточной популяции, повторное культивирование для получения монослоя эндометриальных стволовых клеток, анализ стволовых свойств полученных клеточных культур, определение экспрессии специфичных для них поверхностных маркеров, последующую трансплантацию интактных стволовых клеток в стенку рога матки псевдобеременных крыс, серию морфологических исследований для оценки роста, целостности и дифференцировки децидуальных клеток эндометриальной ткани крыс, отличающийся тем, что интактные эндометриальные клетки человека обрабатывают ионизирующей радиацией, при которой эндометриальные мезенхимные стволовые клетки не пролиферируют, но сохраняют жизнеспособность, причем нелетальные дозы ионизирующей радиации устанавливают при обработке стволовых клеток в диапазоне допустимых доз ионизирующей радиации от 3.0 до 10.0 Гр, для этого оценивают пролиферативную активность и жизнеспособность клеток, причем оптимальная доза ионизирующей радиации составляет 4,5 Гр, при которой эндометриальные мезенхимные стволовые клетки не пролиферируют, но сохраняют жизнеспособность, затем такие клетки трансплантируют в стенку рога матки крыс и проводят морфологические исследования эндометриальной ткани крыс для установления стимулирующего действия стволовых клеток человека на образование децидуальной оболочки.