КУЛЬТУРА МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ЖИРОВОЙ ТКАНИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (Textus adiposus Bos taurus), ДЛЯ ВЕТЕРИНАРИИ, КЛЕТОЧНОЙ И ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ Российский патент 2013 года по МПК C12N5/775 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной и сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к получению культуры мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) жировой ткани (ЖТ) крупного рогатого скота (крс).

В биотехнологии промышленного производства до сих пор остается острая необходимость в разработке эффективных способов культивирования и наращивания патогенов in vitro на чувствительных биологических объектах. Известно, что для многих вирусов, например коронавирусов, существует ряд проблем, связанных с отсутствием культур клеток, эффективно обеспечивающих их размножение in vitro. Отсутствие адекватных модельных клеточных систем существенно сдерживает исследования по производству антигенов, диагностических препаратов и вакцин. Перевиваемые культуры клеток, которые используются в этих целях, как правило, иммортализированы и в результате длительного культивирования теряют свою не только тканевую, но и видовую специфичность. Диплоидные культуры клеток, полученные из тканей и органов млекопитающих, сохраняют свою видовую и тканевую специфичность, однако имеют ограниченный период пролиферации in vitro вследствие старения. Известно, что такие клетки не могут in vitro преодолеть более 50 цитогенераций. В связи с этим использование для этих целей стволовых клеток (СК), выделенных из тканей и органов взрослой особи, является актуальным. Особенно перспективными в данном направлении являются ММСК. Эти клетки, как известно, являются структурными и функциональными стержнями различных видов тканей. Известно, что такие клетки способны к самообновлению. ММСК доступны, просты в культивировании, при определенных условиях способны дифференцироваться в различные типы и виды тканей и органов и самое главное не вызывают реакцию иммунного отторжения. Стоит особо отметить еще одно достоинство ММСК - возможность их культивирования в трехмерной структуре. Они могут заселять матрицу-носитель, дифференцироваться в заданном направлении и формировать трехмерные структуры, которые позволяют моделировать ту или иную ткань in vitro. Поэтому ММСК являются перспективным материалом для понимания сложных инфекционных механизмов, происходящих на клеточном и тканевом уровнях in vitro. Также это делает их уникальным материалом для создания новых клеточных систем в сельскохозяйственной биотехнологии и ветеринарии.

В настоящий момент ведутся разработки по созданию альтернативного источника мяса. Одним из таких подходов является создание пищевых продуктов животного происхождения на основе культивируемой in vitro мышечной ткани при помощи технологий клеточной инженерии, результатов исследований в области культур стволовых клеток, в частности ММСК, а также стремительное развитие нанотехнологий. Имеющиеся и полученные знания и опыт позволят культивировать клетки сельскохозяйственных животных in vitro с возможностью влияния на конечный физико-химический состав получаемой биомассы из данных клеток. Стоит также отметить, что несомненными преимуществами клеток животных, выращенных in vitro, являются отсутствие в их составе патогенных инфекционных агентов, что особенно актуально в современных условиях. Поэтому ММСК являются перспективным биологическим материалом для создания новых клеточных продуктов in vitro для пищевой биотехнологии.

Согласно общепринятому мнению КМ является самым подходящим источником для выделения ММСК. Однако использование ММСК КМ ограничено из-за сложности и болезненности забора костного мозга. Прижизненное взятие KM у взрослых особей крс технически сложно осуществить в условиях сельскохозяйственных предприятий. Послеубойное взятие КМ в сравнении с ЖТ также сложно осуществить технически в связи с требованиями ветеринарно-санитарной службы. В последние годы появились сообщения, что ЖТ взрослого организма содержит популяцию клеток с характеристиками, подобными ММСК КМ, которые способны при определенных условиях дифференцироваться в клетки других тканей и органов (Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H., Huang J.I. Futrell W.J., Katz A.J., Benhaim P., Lorenz H.P., Hedric M.H. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies // Tissue. Eng. 2001. V.7. P.211-226; Zuk P.A., Zhu M., Ashijian P., De Ugarte D.A., Huang J.I., Mizuno H., Alfonso Z.C., Fraser J.K., Benhaim P., Hedrick M.H. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells // Mol. Biol. Cell. 2002. V.13. P.4279-4295; Тепляшин А.С., Коржикова С.В., Шарифуллина С.З., Чупикова Н.И., Ростовская М.С., Савченкова И.П. Характеристика мезенхимальных стволовых клеток человека, выделенных из костного мозга и жировой ткани. // Цитология. 2005. Т.47 (2): с.130-135; Тепляшин А.С., Чупикова Н.И., Коржикова С.В., Шарифуллина С.З., Ростовская М.С., Топчиашвили З.А., Савченкова И.П. Сравнительный анализ двух клеточных популяций с фенотипом, подобным мезенхимным стволовым клеткам, выделенны из разных участков подкожно-жировой клетчатки. // Цитология. 2005. Т.47 (7): с.637-643; Савченкова И.П., Ростовская М.С., Чупикова Н.И., Шарифуллина С.З., Тепляшин А.С. Дифференцировка мультипотентных мезенхимных стромальных клеток, выделенных из костного мозга и подкожно-жировой клетчатки человека, в клетки костной ткани. // Цитология. 2008. Т.50 (10): с.855-860; Williams KJ, Picou AA, Kish SL, Giraldo AM, Godke RA, Bondioli KR. Isolation and characterization of porcine adipose tissue-derived adult stem cells. Cells Tissues Organs. 2008; 188(3): 251-8; Vidal MA, Kilroy GE, Lopez MJ, Johnson JR, Moore RM, Gimble JM. Characterization of equine adipose tissue-derived stromal cells: adipogenic and osteogenic capacity and comparison with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells // Vet Surg. 2007 Oct; 36 (7): 613-22; Cheung WK, Working DM, Galuppo LD, Leach JK. Osteogenic comparison of expanded and uncultured adipose stromal cells // Cytotherapy. 2010 Jul; 12(4): 554-62; Alicia A. Picou. The isilation AND CHARACTERIZATION OF BOVINE ADULT DERIVED ADIPOSE STEM CELLS FOR THE USE IN NUCLEAR TRANSFER. A Thesis Submitted to the Graduate Faculty of the Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master of Science In The Interdepartmental Program of the School of Animal Sciences. Louisiana State University, August 2009).

Перспективность использования стволовых клеток ЖТ обусловлена, в первую очередь, доступностью биологического материала и легкостью наращивания в условиях культивирования in vitro. ЖТ, которую технически просто отобрать в первые минуты после убоя животного, представляет собой ценный материал для получения ММСК. Анализ литературных данных показал, что во всех анализированных работах получены клетки, имеющие разные морфофункциональные характеристики и принципиальные отличия по экспрессии поверхностных антигенов в зависимости от условий выделения и культивирования.

В настоящее время в России ни в одной коллекции клеточных культур не имеются в доступе культуры клеток со свойствами и признаками ММСК, выделенные из жировой ткани взрослых особей крупного рогатого скота. Анализ литературных данных показал, что на сегодняшний момент существует единственная работа, в которой описывается выделение из ЖТ крс ММСК и изучены некоторые их свойства и признаки. Эту работу мы взяли в качестве прототипа.

В связи с этим в задачу наших исследований входило получить клетки с фенотипом, подобным ММСК ЖТ крс.

ММСК ЖТ получили из послеубойного материала крс (трех животных в возрасте трех лет) в течение 30 минут после убоя на мясокомбинате. Для выделения использовали методические наставления, разработанные нами ранее (Савченкова И.П., Эрнст Л.К., Гулюкин М.И., Викторова Е.В. Методические наставления по выделению мультипотентных мезенхимных стволовых клеток из тканей взрослых особей млекопитающих, изучению их свойств и признаков. // М.: Издательство «Спутник+», 2010).

В качестве прототипа мы взяли ММСК, выделенные из ЖТ 9 взрослых особей крупного рогатого скота. Данная работа представляет собой кандидатскую диссертацию на соискание ученой степени магистра и была выполнена в Луизианском Государственном Университете, США (Alicia A. Picou. The isolation and characterization of bovine adult derived adipose stem cells for the use in nuclear transfer. A Thesis Submitted to the Graduate Faculty of the Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master of Science In The Interdepartmental Program of the School of Animal Sciences. Louisiana State University, August 2009).

Клетки прототипа имели следующие свойства и признаки:

Выделение: Клетки с фенотипом ММСК были выделены у девяти взрослых особей крупного рогатого скота. На скотобойне: у послеубойного и прижизненного материала.

Морфологические признаки. Автором было показано, что ММСК адгезивны к пластику. Выделенные популяции клеток в течение первых пассажей имели гетерогенную морфологию, представленную двумя типами клеток. Первый тип клеток - это мелкие веретеновидной формы клетки с четко видимым ядром и гомогенной цитоплазмой. Второй, доминирующий, тип клеток был представлен более крупными клетками с фибробластоподобной морфологией. С длительностью культивирования и старения клеточной культуры все клетки приобретали фибробластоподобную морфологию.

Культуральные свойства. Основными средами для культивирования клеток, выделенных из ЖТ крс, являлась среда ДМЕМ с высоким содержанием глюкозы и смесь сред 1:1 ДМЕМ+HAMS F 12, дополненные 10% фетальной сыворотки плода коров (ФСПК), 1% раствором пенициллина, стрептомицина (P/S) и 1% раствором фунгизона. В результате исследований автор выявил, что при культивировании клеток в культуральной среде ДМЕМ с повышенным содержанием глюкозы клетки размножались лучше. Время удвоения клеток составляло 48 часа.

Иммунофенотипирование. Не проводилось.

Потенциал к дифференцировке. Автор показал, что выделенные из ЖТ клетки обладали мультипотентностью. При индукции к дифференцировке in vitro они показали способность формировать клетки костной, жировой и хрящевой тканей (таблица).

Предложенная нами клеточная культура клеток с фенотипом, подобным ММСК, выделенная из ЖТ взрослой особи крупного рогатого скота, имеет ряд отличий от прототипа и обладает следующими свойствами и признаками: в отличие от прототипа ЖТ получали только из послеубойного материала крс (трех животных в возрасте трех лет) в течение 30 минут после убоя на мясокомбинате.

Морфологические признаки. В отличие от прототипа клеточная популяция, выделенная нами из послеубойной ЖТ, состоит из 3-х сильно отличающихся друг от друга по морфологии клеток. Доминирующее положение занимали крупные распластанные клетки (до 60 мкм в диаметре) с фибробластоподобной морфологией, с повышенной гранулярностью, а также многочисленными вакуолями и выростами цитоплазмы. Небольшая популяция клеток была представлена клетками округлой формы с вытянутым с одной стороны плоским выростом цитоплазмы. Размер клеток достигал 40 мкм; отмечалось темное ядро, смещенное к одному краю, гетерогенная цитоплазма и повышенная гранулярность в ядерной области. Самая маленькая по численности популяция клеток была представлена субпопуляцией малых веретеновидных клеток диаметром 10-15 мкм, четко выделенным ядром и гомогенной цитоплазмой.

Культуральные свойства. Основной средой для культивирования клеток, выделенных из ЖТ, является среда Игла в модификации Дюльбекко (ДМЕМ) с низким содержанием глюкозы (1 г/л) фирмы Пан Эко, Россия, дополненная 10% сыворотки плода коров (СПК) фирмы Gibco, Hayclon, США, антибиотиками (Пан Эко, Россия). Конечная концентрация стрептомицина - 100 мкг/мл, а пенициллина - 100 ед./мл. Время удвоения клеток составляло 36 час, что свидетельствует о более быстром размножении клеток in vitro по сравнению с прототипом. Митотический индекс - 34%, эффективность клонообразования составила 88%, данные характеристики у прототипа не проводились.

Иммунофенотипирование. Полученная культура не имеет примеси гематопоэтических CD34 (3,2%), CD45 (0,2%) и эндотелиальных клеток - CD31 (0.3%). Иммунофенотипирование прототипа не проводилось.

Экспрессия коллагена 1-го типа. В выделенной клеточной популяции с помощью РТ ПЦР обнаружен продукт мРНК гена коллагена 1-го типа, который является маркером ММСК. Данный параметр является одним из основных в характеристике ММСК. В описании прототипа данные по экспрессии данного маркера отсутствуют.

Потенции к дифференцировке. Также как и прототип, полученная нами популяция обладала высокой эффективностью к направленной дифференцировке в клетки костной и жировой тканей. В отличие от прототипа мы также направили наши клетки по пути дифференцировки в клетки мышечной ткани (таблица 1).

Так, при культивировании в среде, индуцирующей дифференцировку в клетки костной ткани, как наших клеток, так и прототипа на 12-14 сут были обнаружены клетки, положительно окрашенные на щелочную фосфатазу. В качестве основных индукторов мы использовали дексаметазон и аскорбиновую кислоту. При более продолжительном культивировании в этой же среде ММСК КМ формировали минеральные комплексы, которые подтверждались окраской экспериментальных образцов по von Kossa.

При индукции к дифференцировке в клетки жировой ткани (индуктор - дексаметазон и инсулин) у наших клеток на 21 сут наблюдали формирование кластеров адипоцитов с одинаковой эффективностью. Индукционная среда, используемая у прототипа, отличалась от нашей индукционной среды. Морфологическая оценка подтверждалась при окраске экспериментальных образцов специальными красителями (Oil-red-O).

Для индукции ММСК КМ крс в клетки мышечной ткани in vitro использовали среды, дополненные 5-азацитидином, 5-аза-2'-деоксицитидином и ретиноевой кислотой. На 30 сут наблюдали образование в экспериментальных культурах клеток мышечной ткани, в которых был обнаружен продукт мРНК экспрессии генов маркеров миогенеза: MyoD1 и миозин НС.

Сравнительный анализ эффективности дифференцировки ММСК при индукции в клетки жировой, костной и мышечной тканей Культура клеток Эффективность дифференцировки клеток при индукции остеогенеза адипогенеза хондрогенеза миогенеза Прототип +++ +++ ++ Нет данных Предложенный +++ +++ Нет данных +++

Чувствительность к вирусам. Предложенная нами культура ММСК, выделенная из ЖТ крс, чувствительна в вирусам: инфекционный ринотрахеит крс, герпес типа 4 крупного рогатого скота (ВПГ-4) и ринопневмония лошадей.

Сектором «Стволовая клетка» ГНУ ВИЭВ им.Я.Р.Коваленко в лице зав. сектором д.б.н. профессором И.П.Савченковой была депонирована в Специализированную Коллекцию постоянных соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко (СХЖ РАСХН) под №80. Следующая культура клеток хранится в жидком азоте (-196°С): мультипотентные мезенхимные стволовые клетки крупного рогатого скота, выделенные из жировой ткани - ММСК крс ЖТ (четырнадцать ампул). Одновременно передан паспорт на указанную культуру клеток и протокол №3 от 06.06.2011 г.

Технико-экономическая эффективность. Таким образом было установлено, что в жировой ткани взрослых особей крупного рогатого скота содержится популяция клеток с фенотипом, подобным ММСК, которые можно выделить и культивировать in vitro.

Предложенная культура ММСК, выделенная из ЖТ крс, найдет применение в лабораториях, занимающихся новыми клеточными технологиями с целью регенерации и репарации тканей и органов сельскохозяйственных животных. ММСК, выделенные из ЖТ, являются перспективным материалом для создания моделей с целью изучения сложных инфекционных механизмов, происходящих на клеточном и тканевом уровнях in vitro. Предложенная культура ММСК крс из ЖТ найдет применение для наращивания патогенов in vitro. Эти клетки способны под действием индукторов формировать в культуре клетки мышечной ткани, что даст возможность получать из них в перспективе биомассу, по составу близкую к мышечной ткани животных, с целью создания альтернативных источников продуктов питания. Кроме того, наличие в Коллекции культур стволовых клеток сельскохозяйственных животных даст возможность сохранить генетические ресурсы в экстремальных условиях.

Изобретение относится к области ветеринарной медицины и биотехнологии и касается культуры мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) крупного рогатого скота. Предложенная культура выделена из жировой ткани крупного рогатого скота, обладает свойствами и признаками мультипотентных мезенхимных стволовых клеток млекопитающих, не имеет примеси гематопоэтических и эндотелиальных клеток, способна в культуре поддерживаться длительное время и при индукции in vitro формировать клетки других тканей: костной, мышечной и жировой. Описанная культура клеток депонирована в Специализированную Коллекцию перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко (СХЖ РАСХН) под №80. Представленная культура может быть использована при регенерации и репарации тканей и органов сельскохозяйственных животных, при исследовании инфекционных механизмов, происходящих на клеточном и тканевом уровнях in vitro, также представленная культура может быть использована для наращивания патогенов in vitro. 1 табл.

Культура мультипотентных мезенхимных стволовых клеток крупного рогатого скота, выделенных из жировой ткани (texstus adiposus Bos taurus), депонированная в Специализированную Коллекцию постоянных соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных при ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко (СХЖ РАСХН) под № 80 для ветеринарии, клеточной и тканевой инженерии.