ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica - ПРОДУЦЕНТ ЛИПАЗЫ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/19 C12N15/55 C12R1/645 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается штамма продуцента фермента липазы.

Липазы катализируют гидролиз триацилглицеридов с образованием жирных кислот и глицерина. Они находят применение в пищевой промышленности, бытовой химии, косметике. Специально очищенные препараты липаз применяют в медицине.

Значительный интерес к практическому использованию ферментов в медицине обусловлен важной ролью, которую они играют в биологических процессах, в частности в процессах пищеварения у человека и животных.

Применение ферментных препаратов из различных источников для компенсации собственной недостаточности пищеварительных ферментов у человека получило название заместительной терапии.

Липазы из разных источников различаются по ряду параметров (позиционная, жирно-кислотная специфичность, стереоспецифичность, термостабильность и т.д.), поэтому при определении возможности использования конкретного фермента в заместительной терапии необходимо учитывать дополнительные критерии оценки.

Основные требования к липазам, используемым в практике заместительной терапии, сформулированы, например, в (Pancreas, 1992, vol.7, pp.311-319).

Предпочтительное распространение в препаратах, используемых в заместительной терапии, в первую очередь, могут получить липазы, продуцируемые представителями родов Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, Mucor, Candida, Yarrowia (WO 9638170, Pancreas, 1992, vol.7, pp.311-319).

В последние годы в качестве одного из наиболее перспективных микробных продуцентов липазы рассматривают дрожжи Yarrowia lipolytica, у которых выявлено несколько внутриклеточных и секретируемых липаз. В первую очередь это кислотоустойчивая внеклеточная липаза Lip2 - продукт гена LIP2, соответствующая основным требованиям, предъявляемым к липазам, предназначенным для использования в практике заместительной терапии (ВВА 1771 (2007) 228-237).

Повышенный интерес к созданию высокоэффективных продуцентов липаз на основе Yarrowia lipolytica связан также с достаточно хорошей генетической изученностью этого объекта и тем, что данный вид дрожжей удобен для промышленной ферментации (FEMS Microbiology Reviews, 1997, vol.19, pp.219-237).

Известен дикий штамм Yarrowia lipolytica W29 (АТСС 20460), на основе которого получен (J.Biotechnol., 2004, vol.109 pp.63-81) ряд штаммов реципиентов, в том числе Yarrowia lipolytica Pold (CLIB 139) и Yarrowia lipolytica Polf (АТСС MYA-2613), широко используемых для конструирования продуцентов секретируемых белков. Штамм W29 и производные реципиенты Pold и Polf имеют низкий уровень продукции липазы (не более 28 ед./мл), однако последние хорошо охарактеризованы биохимически и генетически и неоднократно использовались как высокоэффективные системы для гомо- и гетерологичной экспрессии, обеспечивая высокий уровень накопления целевого белка и его стабильность благодаря инактивации протеаз.

Так на основе штамма Yarrowia lipolytica Pold получен генно-инженерный штамм Yarrowia lipolytica YPL 280 (FEMS Yeast Reseach, 2002, vol.2, pp.371-379), который при культивировании в колбах позволяет получить продукцию липазы около 2000 ед./мл.

Однако ассортимент штаммов Yarrowia lipolytica, которые могут быть использованы в промышленных условиях, ограничен, поэтому создание новых дрожжевых штаммов - продуцентов липазы является актуальной задачей.

Технической задачей настоящего изобретения является расширение арсенала штаммов продуцентов липазы, относящихся к виду Yarrowia lipolytica.

Задача решена путем конструирования рекомбинантного штамма дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3260 - продуцента липазы.

Под рекомбинантным штаммом дрожжей понимается линия микроорганизмов производных Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3260, сохраняющих основные мутации и генно-инженерные модификации, обеспечивающие высокую продукцию фермента липазы.

Рекомбинантный штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3260 сконструирован путем трансформации штамма Yarrowia lipolytica Polf (АТСС MYA-2613) интегративной плазмидой pZ-ura3d4-hp4d-LIP2.

Выбор в качестве реципиента при конструировании заявляемого штамма именно штамма Yarrowia lipolytica Polf связан с тем, что несмотря на низкий уровень продукции липазы он соответствует большинству требований, предъявляемых реципиентам для экспрессии секретируемых белков, т.е. генетически маркирован, позволяет получить высокую эффективность при трансформации и не секретирует избытка протеаз (J. Biotechnol, 2004, vol.109 pp.63-81).

Штамм Yarrowia lipolytica Polf(ATCC MYA-2613) получен (J.Biotechnol, 2004, vol.109 pp.63-81) из дикого штамма W29 посредством инактивации гена URA3 геном Saccharomyces cerevisiae SUC2 (аллель ura3-302), деления в гене LEU2 (аллель leu2-270), а также инактивации основных протеаз - кислой и щелочной (аллели ахр-2, xpr2-322) и имеет, таким образом, фенотип - Leu^-, Ura^-, ΔАЕР, ΔАХР, Suc⁺.

При создании заявляемого штамма штамм Yarrowia lipolytica Polf ауксотрофный по лейцину комплементировали с помощью интегративного вектора pNB268 (ATCC 69355) и затем трансформировали интегративной плазмидой pZ-ura3d4-hp4d-LIP2.

Плазмида pZ-ura3d4-hp4d-LIP2 получена на основе вектора pUC19 и содержит дефектный маркер ura3d4, способствующий отбору клонов с множественной интеграцией вектора в хромосому, участки для негомологичной интеграции Zeta, различные транскрипционные элементы, в том числе сильный синтетический конститутивный промотор hp4d, и ген липазы Yarrowia lipolytica LIP2. Повышенная копийность гена LIP2 и его измененная регуляция обусловливают способность заявляемого штамма накапливать более высокие количества липазы.

Полученный штамм Yarrowia lipolytica депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (117545 Москва, 1-ый Дорожный пр-д, д.1) и имеет регистрационный номер ВКПМ Y-3260.

Штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3260 характеризуется следующими признаками:

Культурально-морфологические признаки. Суточная культура в жидкой глюкозопептонной среде представлена овальными, удлиненно-овальными, округлыми клетками размером 4,6-6,0×4,5-12,5 мкм. Почкование полярное или латеральное, на узком основании. К третьим суткам большинство клеток почкуются и образуют псевдомицелий.

Клетки хорошо растут на простых питательных средах. Колонии на мальто-агаре (J.A.Bamett et al. "Yeasts characteristics and identification", Cambridge, 1983) (возраст 1 неделя) кремового цвета, пастообразные, слегка приподнятые в центре, морщинистые, с фестончатым краем. Штрих на мальто-агаре непрерывный, плоский, блестящий, кремово-белого цвета, пастообразный, края ровные, со временем становится складчатым. Спор не образует.

Физиолого-биохимические признаки. Облигатный аэроб. Сахара не сбраживает. Ассимилирует: сахарозу, глюкозу, D-галактозу (медленно), L-сорбозу, D-рибозу, этанол, глицерин, эритрит, адонит, D-маннит, сорбит и молочную, янтарную, лимонную, глюконовую кислоты. Не ассимилирует: мальтозу, лактозу, целлобиозу, трегалозу, мелибиозу, раффинозу, мелицитозу, инулин, крахмал, D-ксилозу, L- и D-арабинозу, раммозу, дульцит, инозит, D-глюкозамин и глюкуроновую, 2-кетоглюконовую, 5-кетоглюконовую кислоты. Не ассимилирует нитраты. Не растет в безвитаминной среде, требует тиамин, не требует биотин.

Оптимальное значение рН для роста 5,5-7,0. Не растет при 37°С. Максимальная температура роста 35°С. Разжижает желатин. Растет на алканах. Гидролизует мочевину.

Заявляемый штамм при выращивании в колбах способен продуцировать липазу в количестве до 1200 ед./мл культуральной жидкости.

Изобретение проиллюстрировано следующими четежами:

Фиг.1 - Схема плазмиды pZ-ura3d4-hp4d-LIP2.

Фиг.2. - График продукции липазы штаммом Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3260.

Получение и культивирование штамма Yarrowia lipotytica ВКПМ Y-3260 подтверждено следующими примерами конкретного исполнения.

Пример 1: Получение плазмиды pZ-ura3d4

Для получения плазмиды pZ-ura3d4 используют последовательность Zeta, представляющую собой длинный концевой повтор ретротранспозона YLtl (US6582951).

Модифицированную последовательность Zeta, содержащую в центре сайты рестрикции Bsu15I, NheI, XmaJI, получают методом ПЦР, используя в качестве матрицы геномную ДНК, выделенную из штамма Yarrowia lipotytica CLIB 122.

Геномную ДНК выделяют по методу, описанному в (Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1994).

ПЦР продукт получают с помощью приведенной ниже сшивки двух фрагментов, полученных по двум парам праймеров:

Zeta-F1 5'-TGCCTAGGCGCTAGCCATCGATAAAGTGCTTTGTGCGTACC-3',

Zeta-R1 5'-GCGGCCGCTGTCGGGAACCGCGTT-3' и

Zeta-F2 5'-GCGGCCGCACTGAAGGGCTTTGTGAGG-3',

Zeta-R2 5'-ATCGATGGCTAGCGCCTAGGCATGTGTAACACTCGCTCTGGAG-3'.

Фрагменты ДНК размером 333 и 422 п.о. получают с использованием Pfu-полимеразы.

В работе использованы праймеры для ПЦР, синтезированые фирмой Syntol (Москва), и ферменты для молекулярной биологии фирмы Fermentas Inc.

Для реакции амплификации используют приблизительно 100 нмолей каждого праймера. Оба фрагмента амплифицированной ДНК после электрофореза в 1% агарозном геле очищают методом экстракции ДНК. Очищенные фрагменты ДНК в количестве по 0,05 мкг используют в качестве матрицы для ПЦР по праймерам Zeta-R1 и Zeta-F2 с использованием Pfu-полимеразы. Около 0,5 мкг конечной амплифицированной ДНК размером 733 п.о. после экстракции из агарозы (Kit #К0513, Fermentas Inc.) лигируют с 0,2 мкг ДНК плазмиды pUC19, расщепленной эндонуклеазами PaeI и HindIII и обработанной полимеразой Pfu для получения тупых концов. Полученную плазмиду трансформируют в Е.coli XL1 (Blue) методом электропорации согласно методике, описанной в (Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y. (1989)). Клоны, содержащие необходимую вставку амплифицированной ДНК, отбирают на чашках с агаризованной средой LB по устойчивости к ампициллину и стандартному тесту на отсутствие активности В-галактозидазы. Плазмидную ДНК, выделенную из отобранных клонов, проверяют рестрикционным анализом. Полученная плазмида размером 3413 п.о. названа pUC-Zeta.

Для уменьшения pUC-Zeta 0,5 мкг плазмиды последовательно обрабатывают эндонуклеазой SdaI, и в условиях неполной рестрикции эндонуклеазой AatII. Затем, после переосаждения этиловым спиртом (Sambrook et al., Molecular Cloning, second edition Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y. (1989)) обрабатывают Pfu-полимеразой для получения тупых концов. ДНК-фрагмент размером 2905 п.о. после электрофореза в 1% агарозном геле очищают методом экстракции и лигируют лигазой фага Т4. Полученную плазмиду трансформируют в Е.coli XL1 (Blue) методом электропорации. Клоны отбирают на чашках с агаризованной средой LB (мас. %) триптон - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, NaCl - 0,5, вода - остальное по устойчивости к ампициллину. Плазмидную ДНК, выделенную из отобранных клонов, проверяют рестрикционным анализом. Полученная плазмида размером 2905 п.о. названа pZ.

ПЦР продукт, содержащий дефектный ura3d4 ген, амплифицируют с использованием Taq-полимеразы по праймерам ura3d4-F 5'-TTGCTAGCTTGATACCAAAATGCCCTCCTACG-3' и URA3-R 5'-ATCGATCGACAAAGGCCTGTTTCTC-3'. Матрицей для ПЦР служит тотальная геномная ДНК Yarowia lipolytica W29. ДНК-фрагмент размером 1339 п.о. после электрофореза в 1% агарозном геле очищают методом экстракции и обрабатывают рестриктазами Bsu15I и NheI. Далее 0,5 мкг фрагмента лигируют с 0,2 мкг ДНК плазмиды pZ, обработанной сходным образом и дополнительно дефосфорилированой щелочной фосфатазой (CIAP). Полученную плазмиду трансформируют в Е.coli XL1 (Blue) методом электропорации. Клоны отбирают на чашках с агаризованной средой LB по устойчивости к ампициллину. Плазмидную ДНК, выделенную из отобранных клонов, проверяют рестрикционным анализом на наличие необходимой вставки амплифицированной ДНК. Полученная плазмида размером 4229 п.о. названа pZ-ura3d4 и содержит селективный маркер ura3d4, фланкированный фрагментами последовательности Zeta, отделенными от последовательности pUC19 сайгами NotI.

Пример 2: Получение плазмиды pZ-ura3d4-hp4d-LIP2

Гибридный промотор hp4d конструируют, как описано в патенте (US 6083717). В результате получают плазмиду pUC-hp4d, в которой промотор фланкирован сайтами NheI и XmaJI. Плазмиду pUC-hp4d обрабатывают рестриктазами NheI и XmaJI. Фрагмент, содержащий hp4d промотор, размером 558 п.о. после электрофореза в 1% агарозном геле очищают методом экстракции и 0,5 мкг его лигируют с 0,2 мкг ДНК плазмиды pZ-ura3d4, обработанной сходным образом и дополнительно дефосфорилированой щелочной фосфатазой (CIAP). Полученную плазмиду трансформируют в Е.coli XL1 (Blue) методом электропорации. Клоны отбирают на чашках с агаризованной средой LB по устойчивости к ампициллину. Плазмидную ДНК, выделенную из отобранных клонов, проверяют рестрикционным анализом на наличие необходимой вставки амплифицированной ДНК. Полученная плазмида размером 4780 п.о. названа pZ-ura3d4-hp4d.

ПЦР продукт, содержащий терминатор гена XPR2 Yarowia lipotytica, амплифицируют с использованием Taq-полимеразы по праймерам xprT-F 5'-ATCCTAGGTAGGCAATTAACAG-3' и xprT-R 5'-TATCTAGAGCCACCTACAAGCCAG-3'. Матрицей для ПЦР служит тотальная геномная ДНК Yarowia lipotytica W29. ДНК-фрагмент размером 150 п.о. после электрофореза в 1% агарозном геле очищают методом экстракции и обрабатывают рестриктазами XbaI и XmaJI. Далее 0,5 мкг фрагмента лигируют с 0,2 мкг ДНК плазмиды pZ-ura3d4-hp4d, обработанной сходным образом и дополнительно дефосфорилированой щелочной фосфатазой (CIAP). Полученную плазмиду трансформируют в Е.coli XL1 (Blue) методом электропорации. Клоны отбирают на чашках с агаризованной средой LB по устойчивости к ампициллину. Плазмидную ДНК, выделенную из отобранных клонов, проверяют рестрикционным анализом на наличие необходимой вставки амплифицированной ДНК. Полученная плазмида размером 4919 п.о. названа pZ-ura3d4-hp4d-Txpr.

ПЦР продукт, содержащий ген LIP2, амплифицируют с использованием Pfu-полимеразы по праймерам

LIP2-F 5'-GAAGACACAATGAAGCTTTCCACCATCCT-3' и

LIP2-R 5'-CCTAGGCCATTCGATCGCATGCTG-3'.

Матрицей для ПЦР служит тотальная геномная ДНК Yarrowia lipolytica W29. ДНК-фрагмент размером 447 п.о. после электрофореза в 1% агарозном геле очищают методом экстракции и обрабатывают рестриктазами BpiI и XmaJI. Далее 0,5 мкг фрагмента лигируют с 0,2 мкг ДНК плазмиды pZ-ura3d4-hp4d-Txpr, обработанной сходным образом и дополнительно дефосфорилированой щелочной фосфатазой (CIAP). Полученную плазмиду трансформируют в Е.coli XL1 (Blue) методом электропорации. Клоны отбирают на чашках с агаризованной средой LB по устойчивости к ампициллину. Плазмидную ДНК, выделенную из отобранных клонов, проверяют рестрикционным анализом на наличие необходимой вставки амплифицированной ДНК. Также последовательность гена LIP2 подтверждают методом секвенирования. Полученная плазмида размером 6038 п.о. названа pZ-ura3d4-hp4d-LIP2 (фиг.1).

Пример 3: Получение штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3260

Штамм Yarrowia lipotytica Polf (ATCC MYA-2613), используемый для трансформации, предварительно комплементируют по гену LEU2. Для этого штамм Polf трансформируют плазмидой pNB268 (ATCC 69355) линеаризованной эндонуклеазой Mlul. Трансформацию Yarrowia lipolytica осуществляют литийацетатным методом (Current Genetic, 1989, vol 16, pp.253-260). Трансформанты отбирают на минимальной среде YNB (Himedia, каталог M1 39) с добавлением глюкозы (2 мас.%) и урацила (0,01 мас.%). Фенотип трансформантов подтверждают рассевом на той же среде.

В качестве ДНК при трансформации полученного штамма Yarrowia lipotytica Polf (leu+) используют 1 мкг ДНК полученной после экстракции из агарозного геля большего из фрагментов, образованных при обработке плазмиды pZ-ura3d4-hp4d-LIP2 эндонуклеазой NotI. Селекцию трансформантов ведут по комплементации ауксотрофности по урацилу на агаризованной минимальной среде YNB с добавлением глюкозы (2 мас.%).

Липазную активность трансформантов первоначально оценивают в чашечном тесте с трибутиратом по зонам прояснения. В тесте используют минимальную среду YNB с добавлением глюкозы (5 мас.%) и трибутирата (2 мас.%). В качестве контроля используют штамм Yarrowia lipotytica Polf с комплементированной ауксотрофностью по урацилу и лейцину.

Для получения контрольного штамма Yarrowia lipolytica Polf (leu+; ura+), штамм Yarrowia lipolytica Polf (leu+) трансформируют ПЦР-продуктом размером 2341 п.о., полученным при амплификации с геномной ДНК штамма W29 по праймерам dura-suc-F-NEW 5'-GAGTATACCTGTACAGAC-3' и dura-suc-R-NEW 5'-AGAATTCGATTTGGCCAG-3'. Селекцию трансформантов ведут по комплементации ауксотрофности по урацилу на агаризованной минимальной среде YNB с добавлением глюкозы (2 мас.%). Фенотип трансформантов подтверждают рассевом на той же среде.

20 клонов, показавших наибольшее соотношение диаметра зоны к диаметру колонии на чашках с трибутиратом, культивируют в жидкой среде в пробирках. Ферментацию проводят при 30°С на качалке в минимальной среде YNB с добавлением оливкового масла (5 мас.%), мела (5 мас.%) и глюкозы (5 мас.%) в пробирках (50 мл) с рабочим объемом 10 мл. Посев осуществляют бактериологической петлей. Ферментацию продолжают 5 дней.

Липазную активность измеряют методом, основанном на гидролизе п-нитрофенилбутирата с образованием бутирата и п-нитрофенола (Appl. Microbiol. Biotechnol., 2003, vol.63, pp.136-142). Единица липазной активности соответствует количеству фермента, которое высвобождает 1 мкмоль п-нитрофенола за минуту в 1 мл рабочего раствора.

По результатам ферментации отобрали заявляемый штамм ВКПМ Y-3260, который является трансформантом №71 Yarrowia lipolytica Polf(leu+;pZ-URA3d4-hp4d-LIP2) и при культивировании в пробирках позволяет получать продукцию 1000 ед./мл.

Пример 4: Культивирование штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3260

Посевной материал предварительно выращивают при 30°С в течение 22 часов на агаризованной среде YPD следующего состава (мас.%): пептон - 1, дрожжевой экстракт - 1, глюкоза - 2, вода - остальное.

Свежую культуру пересевают с чашек бактериологической петлей в пробирки (50 мл) с 10 мл жидкой среды YPD и культивируют на качалке (280 об/мин) при 30°С в течение 20 ч.

Колбы (750 мл) со средой для ферментации (50 мл) засевают посевной культурой до титра 5·10⁵ кл/мл. Для ферментации используют среду YNB с добавлением оливкового масла (5 мас.%), мела (5 мас. %) и глюкозы (5 мас.%). Колбы инкубируют на качалке (250 об/мин) при 30°С. Ферментацию продолжают 5 дней.

Липазную активность в культуральной жидкости измеряют с интервалом в одни сутки методом гидролиза п-нитрофенилбутирата. В качестве контроля используют штамм Yarrowia lipolytica Polf с комплементированной ауксотрофностью по урацилу и лейцину.

При культивировании штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3260 в колбах продукция липазы составляет 1200 ед./мл (фиг.2).

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Получен рекомбинантный штамм Yarrowia lipolytica - продуцент липазы, сконструированый путем трансформации штамма Yarrowia lipolytica Polf интегративной плазмидой pZ-ura3d4-hp4d-LIP2. Полученный штамм Yarrowia lipolytica может быть использован для получения липазы в промышленных масштабах. 2 ил.

Рекомбинантный штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y- 3260 продуцент липазы.