СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ МИТОХОНДРИЙ В КЛЕТКАХ Российский патент 2012 года по МПК C12N5/71 A61K31/66 A61P3/00 

Область техники

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к проблеме адаптации организма к эндогенным и экзогенным неблагоприятным воздействиям, к функциональной недостаточности клеток тканей организма. Изобретение может быть наиболее эффективно использовано при исследованиях in vitro, проводимых в культуре клеток, а также in vivo в комплексе лечения болезней с нарушениями энергообмена.

Уровень техники

Известно применение различных адаптогенов in vivo: витаминов, антигипоксантов, антиоксидантов и др. (Воронина Т.А. и соавт. 4 Международная конференция «Биоантиоксидант», с.91-92, М., 2002, Бурлакова Е.Б. и соавт. 4 Международная конференция «Биоантиоксидант», с.70-71, М., 2002, Панкин В.З. 4 Международная конференция «Биоантиоксидант», с.341-343, М., 2002, Игнатьева С.Н. и соавт. Клиническая лабораторная диагностика 2009, №1, с.36-39, Меерсон Ф.З. «Физиология адаптивных процессов», с.573-622, М.: Наука, 1986). Недостатком указанных способов является отсутствие коррекции биоэнергетических процессов, которые в значительной степени снижаются (истощаются) в экстремальных и неблагоприятных условиях.

Прототипом данного изобретения является способ коррекции биоэнергетической недостаточности клеток препаратом ловастатин, применяемым при гиперхолестеринемии (атеросклерозе), который усиливал пролиферацию митохондрий на 7,6-8,3% (J.S.Amstrong. Mitochondria: a target for cancer therapy.// Br.J. Pharm. 2006, v.147, 239-248; H-Ch. Lee et al. Increase of mitochondria and mitochondrial DNA in response to oxidative stress in human cells. // Biochem. J., 2000, v.348, 425-432; M-A. Shibata et al. Lovastatin inhibits tumor growth and lung metastasis in mouse mammary carcinoma model.// Cancerogenesis, 2004, v.25(10), 1887-1898).

Однако применение этих препаратов ограничено из-за выраженных побочных эффектов (анемия, аллергия, миопатия, угнетение гемопоэза, лейкопения, тромбоцитопения, диспепсия, лактатацидоз и др. G.Bartlett. Antimicrob Agens Chemoter., 2007, v.51, 137-140)). Нами было обнаружено, что бисфосфонаты также способны усиливать пролиферацию митохондрий в клетках, в дополнение к кальцийрегулирующему и мембраностабилизирующему действию при использовании в микродозах (наноконцентрациях), усиливая пролиферацию митохондрий, бисфосфонаты не оказывают побочного действия в терапевтических дозах, экономически доступны.

Целью изобретения является повышение пролиферативной активности митохондрий в клетках с помощью бисфосфонатов для улучшения энергообеспечения клеток и снижения риска побочных явлений, повышения адаптации клеток к функциональной недостаточности тканей органов и систем.

Эта цель достигается с помощью применения различных соединений 1-гидрокси-бис-фосфоновой кислоты, стимулирующих пролиферацию митохондрий.

Раскрытие изобретения

Способ осуществляется с помощью воздействия соединений-1-гидрокси-бис-фосфонового ряда на митохондрии культивированных лимфоцитов человека in vitro в культуре ткани и на митохондрии лимфоцитов человека in vivo.

Доказательство усиления пролиферации митохондрий с помощью бисфосфонатов осуществляется на примерах: 1) 24 часовой культуре клеток крови на лимфоцитах в присутствии бисфосфонатов и 2) через 24 часа после трансдермального введения препаратов ксидифона (ООО Мосхимфармпрепараты, Peг номер 001642/01) и медифона (сертификат №РОСС RU ПР73 В33974 с 04.03.2009 по 27.03.2011, производства Института РЕФАРМ, Москва). Контроль за пролиферацией митохондрий в лимфоцитах в последующем определяют по количеству гранул формазана, образующихся в результате цитохимической реакции по методу Р.П.Нарциссова (Нарциссов Р.П. Анализ изображения клеток - следующий этап развития клинической цитохимии в педиатрии // Педиатрия, 1998, №4, 101-105), выявляющей активность жестко связанного с митохондриями фермента биоэнергетического обмена - сукцинатдегидрогеназы.

Бисфосфонаты являются синтетическими аналогами неорганических пирофосфатов. Неорганический пирофосфат образуется в процессе биоэнергетического обмена и присутствует в биологических жидкостях человека. Бисфосфонаты могут воздействовать на активность многих энзиматических процессов, на кальциевый и гормональный обмен, на образование простагландина. В их присутствии интенсифицируются процессы окисления жирных и аминокислот, возрастает скорость цикла трикарбоновых кислот. Кроме того, они обладают противовоспалительным действием и влияют на биосинтез коллагена (Щербаков Б.К. и др. //Известия АН, серия Химия, 1998, №9, стр.1780-1783; Матковская Т.А., Попов К.И., Юрьева Э.А. «Бисфосфонаты»//М.: «Химия», 2001, 222 с.).

Осуществление изобретения

1. Для исследования in vitro в качестве материала исследования используется цельная венозная кровь. Объектом исследования являются лимфоциты. Реактивы для исследования ин витро - используется следующая среда инкубации:

- среда Игла - 20 мл;

- 1% телячья сыворотка - 0,2 мл;

- 4 мМоль L-глютаминовая кислота (12 мг на 20 мл);

- 0,45% глюкоза (95 мг на 20 мл);

- 6 xg/ml канамицин (0,2).

Условия инкубации (стерильно)

Инкубация проводится в стандартных плашках (по 0,5 мл) в течение 24 часов при температуре 37°C. В каждую ячейку вносят 0,1 мл гепаринизированной крови (0,5 мл гепарина и 5 мл венозной крови), также вносят 0,1 мл инкубационной смеси и 15 мкл 1 ммоль/л раствора исследуемых соединений (15 нмоль конечная концентрация в ячейке). В качестве исследуемых соединений были использованы отечественные бисфосфонаты - производные 1-гидрокси-бисфосфоновой кислоты общей формулы:

R-C(OH)(PO3H2)2

где

R3=СН3-ксидифон

R6=(CH3)2N-CH2-CH2 - медифон

Для приготовления контрольного препарата в ячейку вносят 0,1 мл гепаринизированной крови, также 0,1 мл инкубационной смеси и 15 мкл физиологического раствора.

2. Проведение гистохимического исследования. На чистые обезжиренные предметные стекла (из расчета по 1 стеклу для оценки активности СДГ по каждой пробе) делают тонкие мазки проинкубированной смеси, маркируют и высушивают на воздухе при комнатной температуре в течение 5 минут, после чего фиксируют.

Приготовление фиксирующего раствора

250 мг трилона Б высыпать в сухую колбу на 100 мл; 60 мл ацетона довести дистиллированной водой до 100 мл; смесь вылить в колбу с трилоном Б; перемешать; поставить на сутки в темное место при комнатной температуре; использовать надосадочную жидкость; хранить в темноте при комнатной температуре.

Фиксацию осуществляют, погружая промаркированные предметные стекла с мазками в фиксирующий раствор на 30 секунд (не следует оставлять мазок в растворе более 60 секунд). Затем стекла споласкивают в двух порциях дистиллированной воды, подсушивают на воздухе.

Цитохимическое выявление активности СДГ проводится по методу Нарциссова Р.П. (1998). Подготовку реактива осуществляют в соответствии с инструкцией производителя, прилагаемой к набору реактивов (ООО МНПК «Химтехмаш» ГосНИИ «ИРЕА» (сертификат №27 от 4.10.2004 для количественного цитохимического определения ферментов)).

Погружают стекла в стакан с раствором, содержащим реактив для определения фермента, подогретый до 37°C. Инкубируют в течение 60 минут на водяной бане или в термостате при температуре 37°C. По окончании инкубации вынимают стекла из раствора, промывают водопроводной водой и высушивают при комнатной температуре.

Оценка результатов проводится под светооптическим микроскопом (увеличение 10-15×40, водная иммерсия). Ферментативная активность при визуальной морфометрии выражается в условных единицах, соответствующих среднему числу гранул формазана (то есть фактически числу митохондрий), являющегося продуктом цитохимической реакции. Для определения активности фермента в популяции лимфоцитов подсчитывается среднее количество гранул в 30 клетках.

Пример 1, in vitro. В стандартные плашки вносят 0,1 мл среды инкубации и 0,1 мл гепаринизорованной венозной крови, а также 15 мкл 1 ммоль/л раствора соответствующего бисфосфоната (15 нмоль на ячейку). Цитохимический анализ количества митохондрий в лимфоцитах проводится в мазках клеток из инкубационной смеси через 24 часа после инкубации при 37°C и гистохимической окраски.

После проведения со всеми пробами цитохимического анализа по выявлению активности СДГ были получены следующие результаты:

1. Количество митохондрий на 1 лимфоцит в контрольной пробе составило 7,5-8,4 ед.

2. Количество митохондрий на 1 лимфоцит в пробе с пиперидином составило 13,6 ед. (+70%).

3. Количество митохондрий на 1 лимфоцит в пробе с морфолином составило 15,6 ед. (+95%).

4. Количество митохондрий на 1 лимфоцит в пробе с ксидифоном составило 9,3 ед. (+11,6%).

5. Количество митохондрий на 1 лимфоцит в пробе с пиридином составило 6,5 ед. (-).

6. Количество митохондрий на 1 лимфоцит в пробе с пиперидином-2 составило 10,8 (+35%).

7. Количество митохондрий на 1 лимфоцит в пробе с медифоном составило 11,7 ед. (+41%).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что положительным пролиферативным эффектом для митохондрий лимфоцитов в культуре клеток крови обладают такие соединения -1-гидрокси-бис-фосфоновой кислоты, как пиперидин (стимулирующий эффект составил 170%), морфолин (190%), ксидифон (116%), пиперидин-2 (135%) и медифон (146%).

Пример 2, in vivo. Для исследования in vivo пролиферативное действие двух исследуемых отечественных бисфосфонатов, используемых в настоящее время для лечения нарушений обмена кальция (ксидифона и медифона), определяется через 24 часа после трансдермального введения препаратов.

2% Ксидифон и 0,5% медифон в виде кремов (Ксикрем, Медифон, РЕФАРМ) в количестве 8-12 г (в среднем 200±20 мг и 50±5 мг ксидифона и медифона, соответственно) наносят на кожу спины (воротниковая зона, грудная клетка) путем втирания до полного впитывания в течение 7-8 минут. Пролиферация митохондрий оценивается в мазках крови тем же способом, как в Примере 1. При таком способе введения препаратов их пролиферативная терапевтическая доза сохраняется в организме в течение 48-72 часов, что позволяет рекомендовать прерывистую схему трансдермального применения препаратов в связи с сохранением их в виде депо в месте введения и постепенным попаданием в кровь.

Указанный способ повышения пролиферации митохондрий исследовался на 4 здоровых женщинах в возрасте 25-35 лет: у 2-х женщин на кожу спины наносили 2% крем с ксидифоном (Ксикрем) и у 2-х - 0,5% крем с медифоном. Оценка пролиферации митохондрий проводится на лимфоцитах периферической крови до и после 24 часов (после нанесения кремов) после гистохимическй окраски мазков крови и оценки количества митохондрий в лимфоцитах (п.2).

Получены следующие результаты:

1. Ксидифон:

1) до и после опыта - 21,47 (а) и 23,91 (б) (количество митохондрий увеличилось на 11,4%);

2) до и после опыта - 21,35 (а) и 24,0 (б) (количество митохондрий увеличилось на 12,4%),

2. Медифон:

1) до и после опыта - 22,8 (в) и 26,05 (г) (увеличение на 14,25%)

2) до и после опыта - 21,8 (в) и 25,1 (г) (увеличение на 15,1%).

Таким образом, при действии бисфосфонатов в организме человека пролиферация митохондрий увеличивается: под действием ксидифона на 11-12%, а под действием медифона на 14-15%, хотя количество медифона в креме было в 4 раза меньше, чем ксидифона.

Исследования адаптационных реакций клеточной системы, их причин, проявлений, молекулярных механизмов относятся к фундаментальным проблемам биологии и медицины. Адаптационные реакции являются необходимым звеном любого патологического процесса, а возможность повышения их интенсивности является одной из фундаментальных задач медицины.

Пролиферация митохондрий представляет собой процесс, являющийся по своей сути адаптационным. Митохондрии - универсальная и обязательная для всех тканей органелла цитоплазмы. Митохондрии являются важнейшим центром общего и энергетического метаболизма клетки. Увеличение абсолютного числа этих органелл, в частности феномен «рваных красных волокон» (RRF) в скелетных мышцах, является проявлением компенсаторных способностей организма, позволяющих справиться с тем или иным функциональным дефектом (патент №2357247 от 27.05.2009).

Для повышения пролиферативной активности митохондрий могут использоваться медицинские препараты, приготовленные на основе бисфосфонатов, так как они отличаются высокой эффективностью в качестве регуляторов митохондриального метаболизма (в частности, кальциевого обмена), хорошей биодоступностью и низким уровнем побочных эффектов.

Изобретение относится к биологии и медицине. Способ повышения пролиферативной активности митохондрий в клетках с помощью стимулирующего препарата заключается в том, что в качестве стимулирующего препарата используют производные 1-гидрокси-бисфосфоновой кислоты - пиперидин, или морфолин, или ксидифон, или пиперидин-2, или медифон. Изобретение позволяет скорректировать лечение и повысить адаптацию клеток у пациентов с системной митохондриальной недостаточностью (снижение функции энергообмена клеток). 2 пр.

Способ повышения пролиферативной активности митохондрий в клетках с помощью стимулирующего препарата, отличающийся тем, что в качестве стимулирующего препарата используют производные 1-гидрокси-бисфосфоновой кислоты - пиперидин, или морфолин, или ксидифон, или пиперидин-2, или медифон.