СПОСОБ ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ ЭНДОГЕННОЙ ИНТОКСИКАЦИИ Российский патент 2009 года по МПК G01N33/48 G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, а именно к хирургии и реаниматологии для оценки степени тяжести эндогенной интоксикации.

В современном понимании синдром эндогенной интоксикации - это совокупность симптомов, характеризующихся повреждением клеток и клеточных структур, вызванных избыточным содержанием в крови токсических продуктов и биологически активных веществ [Афанасьев А.Н., Одинцова И.Н., Удут В.В. Синдромы эндогенной интоксикации и системного воспалительного ответа: общность и различия // ж. Анестезиология и реаниматология, 2007, №4. С.67-71]. Содержащиеся в крови токсические продукты и биологически активные вещества оказывают свое повреждающее действие прежде всего на клетки крови, в том числе и на лейкоциты. Поэтому по увеличению относительного и абсолютного количества апоптотических, некротических и поврежденных лейкоцитов можно судит о степени тяжести интоксикации у больных. Своевременная и объективная оценка степени тяжести синдрома эндогенной интоксикации необходима для выбора стратегии и тактики детоксикационной терапии, включающей методы экстракорпоральной гемокоррекции и оценки эффективности проводимой терапии.

В настоящее время для оценки уровня интоксикации существуют различные методы, в частности, основанные на исследовании белков плазмы и клеток крови. По уровню среднемолекулярных пептидов, концентрации альбумина, С-реактивного белка в плазме крови судят о выраженности эндогенной интоксикации [Габриэлян Н.И., Дмитриева А.А., Севастьянова О.А. Средние молекулы и уровень эндогенной интоксикации у реанимационных больных // Анестезиология и реаниматология. - 1985. - №1. - С.36-38; Грызунов Ю.А. Проведение измерений параметров ЭКА и ОКА на анализаторе АКЛ-01. // В кн.: Альбумин сыворотки крови в клинической практике. - М.: Геотар, 1998. - С.104-107]. Эти методы, основанные на изучении гуморальной составляющей, имеют невысокую чувствительность и не позволяют оценить степень тяжести эндогенной интоксикации.

Известны методы оценки степени интоксикации, основанные на исследовании спектра клеток крови, в частности состава лейкоцитов периферической крови, который изменяется под действием токсических метаболитов. К таким методам относят: определение количества лейкоцитов периферической крови, подсчет процентного содержания форм лейкоцитов (лейкоцитарная формула), расчет лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ).

Наиболее близким техническим решением, принятым за прототип, является способ оценки степени интоксикации организма путем изучения и подсчета форменных элементов периферической крови, разработанный В.Н.Кидаловым и соавт. в 1997 году [RU 2082971 С1 (Кидалов В.Н. и др.), 27.06.1997].

При этом способе проводят морфологическое исследование мазков крови больного, анализируют эритроциты и определяют индекс интоксикации (ИИ) по формуле:

где Э - количество эхиноцитов, в %;

П - количество пойкилоцитов, в %;

Г - количество гемолизированных форм, в %;

Д - количество дискоцитов, в %;

Ст - количество стоматоцитов, в %.

При значениях индекса интоксикации 0,16-0,30 полагают наличие интоксикации легкой степени, 0,31-1,0 - средней, 1,01-1,6 - тяжелой и более 1,6 - крайне тяжелой степени.

Известный метод является субъективным, так как требует визуального подсчета и анализа клеток, трудоемким, и не позволяет проанализировать жизнеспособность форменных элементов крови.

Задачей изобретения является разработка способа оценки степени тяжести эндогенной интоксикации в зависимости от жизнеспособности лейкоцитов крови для выбора наиболее эффективной тактики лечения, а также повышения достоверности и снижения трудоемкости способа.

Поставленная задача решается тем, что в венозной крови больного определяют количество лейкоцитов с помощью моноклональных антител к рецептору CD45, а затем в автоматическом режиме на проточном цитометре с помощью ДНК-специфического красителя 0,005% раствора 7 амино-актиномицина D (7AAD), определяют количество погибших клеток, рассчитывают абсолютное число погибших лейкоцитов (А) в единице объема крови по формуле:

и при значениях погибших клеток от 68 до 110 на мкл диагностируют легкую степень тяжести эндогенной интоксикации, от 111 до 400 кл/мкл - среднюю степень тяжести, от 401 до 1000 - тяжелую, а при более 1000 кл/мкл - крайне тяжелую степень тяжести эндогенной интоксикации. Проведение исследования лейкоцитов в автоматическом режиме позволяет анализировать до 10000 клеток (в 100 раз больше чем в прототипе), что снижает трудоемкость способа и повышает его достоверность. Проведенная нами математическая обработка воспроизводимости результатов исследования лейкоцитов (от 8 до 15 тыс. клеток в образце) показала, что оптимальным является подсчет 10 тыс. клеток (р<0,001).

Способ осуществляется следующим образом. У пациента забирают кровь из вены в стандартную стерильную пробирку с антикоагулянтом (K₃EDTA, или ACD, или гепарином 5 ед. в мл) и с помощью гематологического анализаторе определяют содержание лейкоцитов в крови. Консервированный образец крови хранят в течение 30-60 минут при комнатной температуре (18-25°С). Затем проводят подготовку образца для исследования количества и жизнеспособности лейкоцитов. Для этого 100 мкл консервированной венозной крови помещают в отдельную пробирку, добавляют к ней 20 мкл 0,005% раствора 7AAD и 20 мкл моноклональных антител CD45, меченных флуорохромом FITC, осуществляют перемешивание на мешалке - вортекс. Смесь инкубируют в темноте в течение 20 минут при комнатной температуре (18-25°С). Далее осуществляют лизис эритроцитов химическим путем. К исследуемому образцу добавляют 100 мкл лизирующего раствора (OptiLyse®C), смешивают на вортексе в течение 5 с и инкубируют смесь еще 10 минут при комнатной температуре. После чего в пробирку вносят 1,0 мл фосфатного буфера (PBS: 0,01 М натрия фосфат, 0,145 М натрия хлорид, рН=7,2) и переносят полученную смесь в аппарат - проточный цитометр - для анализа. Нами были проведены исследования 10000 лейкоцитов в образце венозной крови донора (см. чертеж). Результаты исследования регистрировались в автоматическом режиме в графическом и табличном вариантах. Было определено, что количество жизнеспособных лейкоцитов (сектор Н) составило 9966 клеток (т.е. относительное количество жизнеспособных клеток составило 99,7%), количество нежизнеспособных, погибших лейкоцитов (сектор G) составило 34 клетки (т.е. относительное количество погибших лейкоцитов составило 0,34%). По данным гематологического анализа концентрация лейкоцитов в венозной крови у донора составила - 7200 кл/мкл (7,2·10%). Следовательно, абсолютное число жизнеспособных и погибших лейкоцитов в образце венозной крови донора составило 7175 кл/мкл и 25 кл/мкл, соответственно. Абсолютное содержание погибших лейкоцитов в образце венозной крови обследуемого рассчитывают по формуле:

Установлено, что у здоровых доноров абсолютное и относительное содержание погибших лейкоцитов в венозной крови варьирует от 16 до 67 кл/мкл (в среднем - 38,3±5,3 кл/мкл) и от 0,23 до 0,90% (в среднем 0,6±0,03%), соответственно.

Апробация предложенного способа оценки интоксикации проведена у 52 пациентов (15 женщин и 37 мужчин) в возрасте от 15 до 76 лет. Из них у 18 человек диагностирован тяжелый острый панкреатит, у 11 - медиастинит, у 4 - сепсис, развившийся на фоне сочетанной травмы, у 3 - перитонит, у 5 - изолированная травма опорно-двигательного аппарата, у 5 - диффузные заболевания печени, у 3 - дисфункциональное маточное кровотечение, 3 пациентов обследованы в 1-е сутки после плановых хирургических вмешательств. Установлено, что концентрация погибших клеток в венозной крови больных и пострадавших возрастает по сравнению с нормой (38,5±5,3 кл/мкл), варьирует от 68 до 2154 кл/мкл и, следовательно, отражает степень тяжести интоксикации.

Таблица 1
Содержание погибших лейкоцитов в венозной крови пациентов с эндогенной интоксикацией различной степени тяжести Градация степени тяжести эндогенной интоксикации Всего пациентов Содержание погибших лейкоцитов в венозной крови Исход заболевания кл/мкл % Количество умерших Летальность, % Легкая 18 48-110 0,9-1,5 1 5,5 Средней тяжести 18 111-400 1,6-2,5 4 22,2 Тяжелая 9 401-1000 2,6-5,0 4 44,4 Крайне тяжелая 7 >1000 >5,0 5 71,4

Полученные данные позволили нам регламентировать степень тяжести эндогенной интоксикации в зависимости от абсолютного или относительного содержания погибших лейкоцитов в венозной крови: легкая степень тяжести эндогенной интоксикации - содержание погибших клеток в венозной крови варьирует от 68 до 110 кл/мкл или 0,9-1,5%, средняя степень тяжести эндогенной интоксикации - от 111 до 400 кл/мкл или 1,6-2,5%, тяжелая степень эндогенной интоксикации - от 401 до 1000 кл/мкл или 2,6-5,0%, крайне тяжелая степень эндогенной интоксикации - более 1000 кл/мкл или более 5% (таблица 1).

Особо подчеркнем, что концентрация погибших лейкоцитов коррелирует с неблагоприятным исходом заболевания, так при легкой степени интоксикации (содержание погибших лейкоцитов 68-110 кл/мкл) летальность составила 5,5%, тогда как при тяжелой (401-1000 кл/мкл) и крайне тяжелой степени интоксикации (более 1000 кл/мкл) летальность была 44,4% и 71,4%, соответственно (таблица 1).

Таблица 2
Распределение пациентов по степени тяжести интоксикации на основании содержания погибших лейкоцитов в венозной крови Нозология Степень тяжести интоксикации легкая средняя тяжелая Крайне тяжелая 68-110 кл/мкл 111-400 кл/мкл 401-1000 кл/мкл >1000 кл/мкл Тяжелый острый панкреатит 1 7 5 5 Медиастинит 1 7 3   Перитонит 1   1 1 сепсис   3   1 Изолированная травма опорно-двигательного аппарата 5       Цирроз печени 4 1     Дисфункциональные маточные кровотечения 3       1-е сутки после плановых хирургических вмешательств 3       ВСЕГО 18 18 9 7

При этом отметим, что у больных в раннем послеоперационном периоде после плановых хирургических вмешательств, у пострадавших с изолированной травмой опорно-двигательного аппарата отмечалась легкая степень тяжести эндогенной интоксикации (таблица 2), у большинства больных с медиастинитом отмечалась интоксикация средней степени тяжести, у пациентов с тяжелым острым панкреатитом - средней и тяжелой степени, крайне тяжелая степень эндогенной интоксикации развивалась у больных, течение заболевания которых осложнилось развитием сепсиса и у пациентов с гнойно-деструктивными осложнениями тяжелого острого панкреатита.

Для лучшего понимания использования способа оценки степени тяжести эндогенной интоксикации приводим следующие примеры:

1. Больная Ч., 49 л. Диагноз: Цирроз печени (HCV), Класс «В». На момент исследования крови состояние средней тяжести, ЧДД - 19 в мин, АД - 110/70 мм рт.ст., ЧСС - 78 уд./мин, температура тела - 36,6°С. В анализах крови: лейкоциты - 5,7·10⁹ кл/л, общий белок - 70 г/л, альбумин - 30,8 г/л, С-реактивный белок - 11,5 мг/л (норма 0-5,5 мг/л). Число критериев ССВР - 0. Оценка тяжести по шкале APACHE II - 2 балла, SAPS II - 6 баллов, SOFA - 2 балла, ЛИИ - 1,8 усл.ед. Содержание погибших лейкоцитов в венозной крови - 84 кл/мкл (1,47%). Легкая степень тяжести эндогенной интоксикации. Больной проводилась консервативная детоксикационная и симптоматическая терапия. Исход - выписана с улучшением.

2. Больная М., 61 г. Диагноз: Спонтанный разрыв пищевода, гнойный медиастинит, двухсторонняя пневмония, двухсторонняя эмпиема плевры, тяжелый сепсис. На момент исследования крови состояние тяжелое. ИВЛ, ЧДД - 22 в мин, Sat О₂ - 96%, АД - 227/106 мм рт.ст., ЧСС - 94 уд./мин, температура тела - 38,3°С. В анализах крови: лейкоциты - 15,2·10⁹ кл/л, Hb - 90 г/л, общий белок - 52 г/л, альбумин - 24 г/л, С-реактивный белок - 103,7 мг/л. Число критериев ССВР - 3. Оценка тяжести по шкале APACHE II - 16 баллов, SAPS II - 38 баллов, SOFA - 6 баллов. ЛИИ - 7,3 усл.ед. Содержание погибших лейкоцитов в венозной крови - 339 кл/млк (2,2%). Средняя степень тяжести эндогенной интоксикации. Больной начата комплексная терапия, включающая экстракорпоральные методы гемокоррекции. Проведено 3 процедуры плазмофильтрации и 4 процедуры постоянной веновенозной гемофильтрации. На 3 сутки абсолютное и относительное содержание погибших лейкоцитов в венозной крови имело тенденцию к увеличению - 389 кл/млк (3,3%) (средняя степень тяжести эндогенной интоксикации), ЛИИ - 7,6 усл.ед, SOFA - 5 баллов, на 7 сутки на фоне терапии отмечалось снижение степени тяжести эндогенной интоксикации: абсолютное и относительное содержание погибших лейкоцитов в венозной крови составило 104 кл/млк (1%) (легкая степень тяжести эндогенной интоксикации), С-реактивный белок - 53,6 мг/л, ЛИИ - 7,9 усл.ед. SOFA - 5 баллов. Исход - выздоровление.

3. Больная Б. 55 лет. Диагноз: Перфорация глотки инородным телом. Флегмона окологлоточной и околопищеводной клетчатки. Задний медиастинит. Сепсис. На момент взятия клинического материала состояние больной тяжелое. В сознании ШКГ 15 баллов. Кожные покровы с сероватым оттенком. Дыхание спонтанное. ЧДД=36 в мин. Sat О₂=94% АД=180/100 мм рт.ст., ЧСС=130 уд/мин. Температура тела 35,9°С, в анализах крови выявлен лейкоцитоз - 13,5 10%. Отмечалось увеличение концентрации С-реактивного белка - 79,7 мг/л, гипергликемия - 22,7 ммоль/л, метаболический ацидоз рН - 7.223. Число критериев ССВР - 3. Оценка тяжести состояния больной по шкале APACHE II составила 14 баллов, SAPS II - 27 баллов, SOFA-4 балла, ЛИИ - 5,9 усл.ед. Содержание погибших лейкоцитов в венозной крови - 414 кл/млк, (3,1%). Тяжелая степень эндогенной интоксикации. Больной начата комплексная терапия, включающая экстракорпоральные методы гемокоррекции. Проведено 2 процедуры плазмофильтрации. На 5 сутки содержание погибших лейкоцитов в венозной крови - 119 кл/млк (1,6%), что соответствует средней степени тяжести эндогенной интоксикации, ЛИИ - 6,9 усл.ед, SOFA - 3 балла. На 7 сутки содержание погибших клеток - 97,3 кл/млк (1,1)%, легкая степень тяжести эндогенной интоксикации, ЛИИ - 3,9 усл.ед, SOFA - 2 балла. Исход - выздоровление

4. Больной М., 26 л. Диагноз: тяжелый острый панкреатит, субтотальный смешанный панкреонекроз, парапанкреатит, оментобурсит, мезоэнтерит, паранефрит слева, параколит слева, паранефральный абсцесс, абсцесс брыжейки тонкой кишки, абсцесс в области головки поджелудочной железы, абсцесс забрюшинной клетчатки, сепсис. На момент исследования крови состояние тяжелое, ИВЛ, ЧДД - 22 в мин, Sat O₂ - 93%, ФД - 102/56 мм рт.ст. на фоне введения вазопрессоров (дофамин 11 мкг/кг в мин), ЧСС - 119 уд./мин, температура тела - 39°С. В анализах крови - лейкоциты -

9,0·10⁹ кл/л, Hb - 89 г/л, общий белок - 69 г/л, альбумин - 37 г/л, С-реактивный белок -125 мг/л. Число критериев ССВР - 3. Оценка тяжести по шкале APACHE II - 11 баллов, SOFA - 7 баллов, ЛИИ - 3,1 усл.ед. Содержание погибших лейкоцитов в венозной крови - 1998 кл/млк (22,2%). Крайне тяжелая степень интоксикации. Больному проводилось комплексное лечение, включающее экстракорпоральные методы гемокоррекции. Проведено 6 процедур плазмофильтрации и 17 процедур постоянной веновенозной гемофильтрации. На фоне проводимой комплексной терапии отмечалось кратковременное улучшение состояния больного (средняя степень тяжести эндогенной интоксикации) содержание погибших лейкоцитов в венозной крови снизилось до 264 кл/мкл (2,4%), ЛИИ - 10 усл.ед, SOFA - 8 баллов. Однако, в дальнейшем, продолжался гнойно-септический процесс, отмечалось прогрессирование полиорганной недостаточности, содержание погибших клеток в венозной крови вновь возросло до 804 кл/мкл (5,3%) - тяжелая степень эндогенной интоксикации. Исход - смерть.

5. Больной Б. 31 года. Диагноз: Острый тяжелый панкреатит. Субтотальный геморрагический панкреонекроз в стадии гнойно-септических осложнений. На момент взятия клинического материала состояние больного тяжелое. В сознании. Кожные покровы бледные. Дыхание спонтанное, тахипноэ до 27 в мин. Гипертермия до 40°С, с потрясающими ознобами. АД 96/56 мм рт ст. ЧСС до 143 в мин. В анализах крови - лейкоцитоз до 19,2·10⁹/л, Нв 96 г/л, Ht 27%, общий белок 61 г/л, альбумин 27,9 г/л. Гипоксемия РО₂ - 64,3 мм рт.ст., гипокапния РСО₂ - 23,3 мм рт.ст., Sat. 95,6% на фоне дыхания атмосферным воздухом. Число критериев ССВР - 4, APACHE II 12 баллов, SOFA 1 балл, ЛИИ - 4,5 усл.ед. Содержание погибших лейкоцитов в венозной крови - 634 кл/млк (3,3%). Тяжелая степень эндогенной интоксикации. Больному проводилось комплексное лечение, включающее экстракорпоральные методы гемокоррекции. Проведено 4 процедуры плазмофильтрации и 6 процедур постоянной веновенозной гемофильтрации. Несмотря на проводимое лечение содержание погибших лейкоцитов в венозной крови не имело тенденции к снижению (621 кл/млк, 2,9%), ЛИИ - 6,6 усл.ед, SOFA - 12 баллов. Отмечалось прогрессирование полиорганной недостаточности на фоне тяжелого сепсиса. Исход - смерть.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет определить степень тяжести эндогенной интоксикации у больных, что влияет на выбор лечебной тактики, обосновывает использование того или иного метода экстракорпоральной гемокоррекции или их комплексного применения. Позволяет оценить эффективность проведенных процедур экстракорпоральной гемокоррекции и комплексного лечения больных. Кроме того, способ оценки степени тяжести эндогенной интоксикации может быть использован в реанимационных отделениях как скрининг-тест, позволяющий выделить контингент больных с неблагоприятным прогнозом течения и исхода заболевания. Таким образом, использование данного способа оценки степени тяжести эндогенной интоксикации приведет к улучшению результатов лечения больных.

Изобретение относится к области медицины, а именно к хирургии и реаниматологии, и касается способа оценки степени тяжести эндогенной интоксикации. Сущность способа: определяют количество лейкоцитов с помощью антител к рецептору CD 45 в венозной крови, затем определяют количество погибших клеток и рассчитывают абсолютное число погибших клеток в единице объема крови. Исходя из полученных значений диагностируют степень эндогенной интоксикации. Способ может быть использован в реанимационных отделениях как скрининг-тест. Использование способа повышает достоверность оценки степени тяжести эндогенной интоксикации. 2 табл., 1 ил.

Способ оценки степени тяжести эндогенной интоксикации путем исследования форменных элементов периферической крови, отличающийся тем, что в венозной крови больного определяют количество лейкоцитов с помощью моноклональных антител к рецептору CD45, а затем в автоматическом режиме на проточном цитометре с помощью ДНК-специфического красителя 0,005%-ного раствора 7 амино-актиномицина D (7AAD) определяют количество погибших клеток, рассчитывают абсолютное число погибших лейкоцитов (А) в единице объема крови по формуле

и при значениях погибших клеток от 68 до 110 кл/мкл диагностируют легкую степень тяжести эндогенной интоксикации, от 111 до 400 кл/мкл - среднюю степень тяжести, от 401 до 1000 кл/мкл - тяжелую, а при более 1000 кл/мкл - крайне тяжелую степень тяжести эндогенной интоксикации.