АНТИНЕОПЛАСТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2009 года по МПК A61K31/191 A61K31/00 A61P35/00 A61K31/197 

Область техники

Изобретение относится к составу таких антинеопластических препаратов на основе глюконовой кислоты, которые проявляют проапоптозный и антипролиферативный эффект.

Уровень техники

Онкологические заболевания как причина инвалидизации и смертности людей занимают второе место после сердечно-сосудистых заболеваний (Лутай М.I., Дорогий А.П. Захворюванiсть i смертнiсть вiд хвороб системи кровообiгу в Украïнi // Нова медицина - 2002, №3; по-русски: Лутай М.И., Дорогий А.П Заболеваемость и смертность от болезней системы кровообращения в Украине. // Новая медицина. - 2002, №3).

Уже общепризнано, что предпосылкой малигнизации клеток служит нарушение функционирования генома под влиянием различных химических, физических и биологических мутагенных факторов. Ежедневно в организме взрослого человека возникает до 10⁶ клеток-мутантов (Передерний В.Г., Бычкова Н.Г. Популярная иммунология. - Киев: «Наукова думка», 1990).

В здоровом организме такие клетки практически полностью погибают (обычно вследствие апоптоза, аутоинициирование которого ныне довольно хорошо изучено). Основную роль в нем играет иммунная система. Ее клетки после распознавания чужеродных (в частности, мутировавших) клеток вырабатывают химические агенты-цитокины, которые «запускают» многоступенчатый процесс апоптоза.

Однако нередко организм не распознает опасность вследствие иммунодефицита, возникающего, в частности, под влиянием факторов, вырабатываемых раковыми клетками. Поэтому в клинической практике все чаще применяют такие антинеопластические препараты, которые сами по себе способны вызывать апоптоз.

К ним относятся (см. CD Mosby's, 2003) антибиотики группы антрациклинов:

доксорубицин, иначе именуемый адриамицин (A.Skadanowski & J.Konopa. Adriamycin and daunomycin induce programmed cell death (apoptosis) in tumour cells. // Biochem. Pharmacol. - 1993, 46, 375)), и

сходные с ним блеомицин, дактиномицин, даунорубицин, идарубицин и пр.

По мнению многих исследователей, доксорубицин и его аналоги индуцируют апоптоз, ингибируя топоизомеразу (фермент, ответственный за малигнизацию клеток).

К сожалению, лечебные средства такого рода могут индуцировать апоптоз и у здоровых клеток. Так, цитотоксический эффект доксорубицина для человеческого организма в целом возникает при кумулятивной дозе более 20 мг/кг. На фоне цитотоксикоза развиваются сопутствующие органические поражения (нередко с летальным исходом). Главными из них являются тромбоцитопения, нейтропения, анемия и кардиопатия, приводящая к смерти 5-20% пациентов, леченных доксорубицином (CD Mosby's, 2003) и иными известными препаратами того же класса (Ez-access kup oncology. Korea united pharm, 2004, p.107).

Естественно, что поиск и введение в клиническую практику менее опасных индукторов апоптоза остается актуальной задачей. Уже известно, что апоптоз вызывают:

бетулиновая кислота (Betulinic acid induces apoptosis in human neuroblastoma cell lines. M.L.Schmidt, et al; Eur. J.Cancer 33, 2007, 1997),

тиурамдисульфид («дисульфирам») (Induction of apoptosis by thiuramdisulfides, the reactive metabolites of dithiocarbamates, through coordinative modulation of NFkappaB, с fos/c-jun, and p53 proteins: G.Y. Liu, et al.; Mol. Carcinog. 22, 235, 1998),

галловая кислота (Induction of apoptosis by gallic acid in lung cancer cells: Y.Ohno, et al.; Anticancer Drugs 10, 845, 1999),

эпигалловая кислота и ее производные (1. A new tumor promotion pathway and its inhibitors: H.Fujiki, et al.; Cancer Detect. Prev. 189, 1 (1994); 2. Inhibition of tumor promoter-induced activator protein 1 activation and cell transformation by tea polyphenols, (-)-epigallocatechin gallate and theaflavins. Z.Dong, et al.; Cancer Res. 57, 4414, 1997) и

галактозамин (D-galactosamine-induced mouse hepatic apoptosis: possible involvement with tumor necrosis factor, but not with caspase-3 activity Y.Itokazu, et al.; Biol. Pharm. Bull. 22, p.1127, 1999).

Все они токсичны для организма в целом и в клиническую практику не введены.

Менее опасны цитостатические антинеопластические препараты, которые замедляют, а нередко и полностью подавляют пролиферацию (рост) раковых опухолей (op cit Ez-access kup oncology, р.3). Наиболее известны из них:

препараты платины (цис-платина, оксиплатина, карбоплатина);

алкилирующие агенты (циклосросфамид, бусульфан, дакарбазин, тиотепа и др.);

антиметаболиты (цитарабин, фторурацил, метотрексат, меркаптопурин и др.);

растительные препараты (доцетаксел, паклитаксел, винкристин, винбластин и др.);

гормональные средства (хлормадинон, диэтилстильбестрол, флутамид и др.).

Однако практически все цитостатики тормозят созревание клеток крови, вызывая анемию, тромбоцитопению и нейтропению, что ухудшает состояние пациентов.

Поэтому ощущается острая потребность в таких антинеопластических препаратах, которые были бы практически нетоксичны для здоровых клеток.

Так, известны препараты на основе интерферона и специфического белка ТНФ (туморнекротический фактор) (Возианов А.Ф., Бутенко А.К., Зак К.П. Цитокины. Биологические и противоопухолевые свойства. - Киев: Наукова думка, 1998).

Однако ТНФ действует через специфические рецепторы, которые у раковых клеток нередко работают иначе, чем у нормальных клеток. Поэтому практическое применение ТНФ ограничено случаями, когда опухоли заведомо чувствительны к его действию (op cit). Мало того, технология получения ТНФ весьма трудоемка. И, наконец, некоторые цитокины проявляют заметные побочные эффекты, что ограничивает их применение (op cit).

Таким образом, задача разработки общедоступных нетоксичных антинеопластических препаратов широкого спектра действия, способных индуцировать апоптоз и угнетать пролиферацию раковых клеток, остается актуальной.

В частности, известен наиболее близкий к изобретению по технической сущности препарат на основе глюконовой кислоты, а именно глюконат кальция. Установлено, что он полезен при химиотерапии злокачественных новообразований (Богуш Т.А., Смирнова Г.Б., Вихлянцева Н.О., Сыркин А.Б. Влияние глюконата кальция на токсичность и противоопухолевую активность доксорубицина у мышей. Антибиотики и химиотерапия, 2002).

Однако глюконат кальция, взятый сам по себе, слабо тормозит рост раковых опухолей.

Сущность изобретения

В основу изобретения положена задача путем изменения состава создать такой препарат на основе глюконовой кислоты, который при введении в человеческий организм проявлял бы выраженный антинеопластический эффект на фоне сохранности здоровых клеток.

Поставленная задача в первом варианте решена тем, что антинеопластический препарат на основе глюконовой кислоты согласно изобретению представляет собой по меньшей мере одну такую ее соль, в которой солеобразующий агент выбран из группы, состоящей из магния, натрия, калия, γ-аминомасляной кислоты (далее ГАМК), этилендиамина или их смесей.

Действительно, как будет показано далее на примерах, практическое применение любого из возможных сочетаний глюконат-анионов с указанными веществами, которые обладают свойствами оснований, одновременно обеспечивает апоптозный и антипролиферативный эффект.

Первое и второе дополнительные отличия соответственно состоят в том, что антинеопластический препарат представляет собой глюконат магния или глюконат калия. Этот препарат предпочтительно применять при онкологических заболеваниях произвольной этиологии на фоне дефицита в организме ионов калия или магния.

Поставленная задача во втором варианте решена тем, что антинеопластический препарат на основе глюконовой кислоты согласно изобретению представляет собой координационное соединение на основе глюконата магния, в котором лиганды выбраны из группы, состоящей из ГАМК, 3-гидрокси-ГАМК, этилендиаминтетрауксусной кислоты (далее ЭДТА) и этиленгликольтетрауксусной кислоты (далее ЭГТА). Эти препараты предпочтительны при неопластических изменениях эпителиальной ткани, особенно на фоне дефицита в организме ионов магния.

Дополнительное отличие состоит в том, что антинеопластический препарат представляет собой координационное соединение диГАМК-Mg-глюконат. Этот препарат предпочтительно применять при онкологических заболеваниях органов дыхания, головного мозга и кишечника.

Поставленная задача в третьем варианте решена тем, что антинеопластический препарат представляет собой двойную соль, выбранную из группы, состоящей из бутиратоглюконата магния, оксибутиратоглюконата магния, глюкаратоглюконата магния, бутиратоглюконата кальция, оксибутиратоглюконата кальция, глюкаратоглюконата кальция и их комбинаций. Эти препараты предпочтительно применять при неопластических процессах на фоне дефицита в организме ионов магния или кальция.

Дополнительное отличие состоит в том, что антинеопластический препарат представляет собой глюкаратоглюконат магния, который предпочтителен при онкологических заболеваниях произвольной этиологии на фоне дефицита в организме ионов магния.

Наилучшие варианты осуществления изобретения

Далее сущность изобретения поясняется:

описанием способов получения препаратов на основе глюконовой кислоты согласно изобретению и их экспериментальных лекарственных форм;

описанием экспериментов на моделях in vitro и полученных результатов в сравнении с результатами действия общепринятых антинеопластических препаратов;

предварительными методическими рекомендациями по применению препаратов согласно изобретению для лечения онкологических заболеваний.

1) Способы получения препаратов согласно изобретению

Глюконовая кислота (эмпирическая формула С₆Н₁₂О₇) как таковая, глюконат магния (эмпирическая формула дигидрата С₁₂Н₂₂MgO₁₁·2Н₂О), ГАМК (эмпирическая формула C₄H₉NO₂), 3-гидрокси-ГАМК (эмпирическая формула C₄H₉NO₃), ЭДТА (эмпирическая формула C₁₀H₂₀O₁₀N₂), ЭГТА (эмпирическая формула C₁₄H₂₄N₂O₁₀) и глюкаровая кислота (эмпирическая формула С₆Н₈О₈) доступны на рынке как химические реактивы, которые для осуществления изобретения должны иметь качество не ниже «хч» (химически чистые).

По желанию глюконат магния можно получить нейтрализацией глюконовой кислоты (обычно взятой в виде водного раствора легкогидролизуемого d-глюконолактона) практически эквимолярным количеством оксида (или гидроксида) магния.

Нормальные соли глюконовой кислоты получают реакцией нейтрализации, в частности внесением расчетного количества основания (или амфотерного соединения) в (обычно водный) раствор кислоты. Целевые продукты выделяют, как правило, выпариванием растворителя и сушкой остатка до постоянной массы (и, по желанию, дополнительной перекристаллизацией).

Координационные соединения глюконата магния получают из глюконата магния и источника выбранного лиганда следующим образом. Вначале в дистиллированной воде при перемешивании и нагревании на водяной бане медленно растворяют определенное количество (например, 0,1 моля) глюконата магния. Раствор охлаждают до температуры 35-40°С и постепенно при перемешивании вводят расчетное количество лиганда в мольном отношении к глюконату магния 2:1. Готовый продукт выделяют из раствора распылительной сушкой

В синтезе координационных соединений глюконата магния с ЭДТА или ЭГТА используют растворы кислот в мольном соотношении 1:2 или 1:3 по отношению к глюконовой кислоте с добавлением в реакционную смесь расчетного количества соли магния. Соединения выделяют перекристаллизацией из спирта. Так были получены соединения следующего состава:

Mg₂(С₁₀Н₂₀О₁₀N₂)(С₆Н₁₂О₇)₂

(Mg₃(С₁₀Н₂₀О₁₀N₂)(С₆Н₁₂О₇)₃ОН),

Mg₂(С₁₄Н₂₄N₂О₁₀)(С₆Н₁₂О₇)₂ и

(Mg₃(С₁₄Н₂₄N₂О₁₀)(С₆Н₁₂О₇)₃ОН).

Эти соединения в качестве противоиона могут содержать ионы натрия или калия.

ДиГАМК-Mg-глюконат (эмпирическая формула дигидрата С₂₀Н₃₈MgN₂О₁₈·2Н₂О) получают растворением глюконата магния в воде при нагревании на водяной бане. После охлаждения раствора до 35-40°С добавляют при перемешивании расчетное количество ГАМК в мольном отношении к глюконату магния 2:1. Целевой продукт выделяют распылительной сушкой.

Координационные соединения глюконата кальция получают из глюконата кальция и соответствующего лиганда по схеме, которая аналогична приведенной выше.

Для синтеза координационных соединений глюконата кальция с ЭДТА или ЭГТА используют растворы этих кислот в мольном соотношении 1:2 или 1:3 в расчете на глюконат-анион и добавляют в такой раствор расчетное количество глюконата кальция. Продукты выделяют перекристаллизацией из этанола. Так были получены соединения следующего состава:

Са₂(С₁₀Н₂₀О₁₀N₂)(С₆Н₁₂О₇)₂

(Са₃(С₁₀Н₂₀О₁₀N₂)(С₆Н₁₂О₇)₃ОН)

Са₂(С₁₄Н₂₄N₂О₁₀)(С₆Н₁₂О₇)₂ и

(Са₃(С₁₄Н₂₄N₂О₁₀)(С₆Н₁₂О₇)₃ОН).

Эти соединения как противоион могут содержать ионы натрия или калия.

Двойные соли магния получают таким образом. Вначале готовят практически 50% водный раствор эквимолярной (в расчете на катион) смеси глюконовой и одной из указанных выше (масляной, или оксимасляной, или глюкаровой) кислот. Затем в такой раствор при интенсивном перемешивании постепенно вводят эквимолярное количество оксида (или гидроксида) магния. После усвоения источника магния реакционную смесь охлаждают на ледяной бане, остатки воды отделяют на фильтре Шота, а осадок сушат до постоянной массы.

Двойные соли глюконата кальция получают по аналогичной схеме.

Экспериментальные лекарственные формы изготовляют растворением указанных соединений в изотоническом водном растворе хлорида натрия или глюкозы.

2) Эксперименты на лабораторных моделях раковых культур.

Эффективность антинеопластических препаратов согласно изобретению исследовали на культурах (лабораторных линиях) опухолевых клеток трех видов: А-549 (клетки, полученные биопсией крупноклеточной раковой опухоли легких человека), А-549-R (клетки того же типа, резистентные к интерферону в концентрации 10000 МЕ/мл) и U-937 (клетки, чувствительные к известным индукторам апоптоза). Контролем служили здоровые клетки тех же тканей, не подвергнутые действию антинеопластических препаратов.

Клетки каждой указанной линии и соответствующие здоровые клетки культивировали при 37°С в полной питательной среде RPMI-1640 (фирма SIGMA, США) с добавками 2 мМ L-глютамина, 10% эмбриональной сыворотки и 40 мкг/мл гентамицина в увлажненной атмосфере с объемной концентрацией СО₂ 5%. Указанную среду заменяли каждые 2-3 суток. После формирования плотного монослоя клеток на субстрате (4-5 сутки роста) готовили клеточные суспензии и засевали ими 24-луночные планшеты в концентрации 3·10⁴ клеток на одну лунку.

Контрольный препарат доксорубицин и препараты согласно изобретению, указанные в приложенной в конце текста таблице, применяли в виде добавок к жидким питательным средам в одинаковой концентрации 10^-3 мМ/л. В ходе экспериментов питательную среду заменяли ежесуточно.

Для визуального различения живых и мертвых клеток их окрашивали трипановым синим. Отсчеты выживших клеток проводили на гемоцитометре через 24 часа, 48 часов и 72 часа исходя из фактического количества живых клеток в начале соответствующих суток.

Установлено, что все испытанные соединения на основе глюконовой кислоты в принципе (хотя и разной степени) пригодны для лечения и профилактики онкологических заболеваний. Действительно, из таблицы следует, что эти соединения одновременно проявляют в отношении культур раковых клеток антипролиферативную активность и проапоптотозную активность, но не затрагивают здоровые клетки.

Естественно, что часть препаратов согласно изобретению проявляет либо преимущественно антипролиферативную активность, либо преимущественно проапоптотозную активность и что совокупный антинеопластический эффект зависит как от вида опухоли, так и от состава и строения препарата и от его концентрации и/или длительности действия на опухолевые клетки.

Однако диГАМК-Mg-глюконат, ди-3-гидроксиГАМК-Mg-глюконат, диГАМК-Са-глюконат, ди-3-гидроксиГАМК-Са-глюконат, бутиратоглюконат магния и бутиратоглюконат кальция проявили довольно уравновешенную и явно выраженную антипролиферативную и проапоптотозную активность. Эти же соединения малотоксичны. Так, в ходе стандартных экспериментов на крысах было установлено, что их LD₅₀ составляет не менее 700 мг/кг (а для диГАМК-Mg-глюконата - примерно 3000 мг/кг).

Поэтому их можно применять в очень высоких разовых, суточных и курсовых дозах до успеха без заметного риска осложнений.

Наряду с описанными выше и учтенными в таблице серийными экспериментами на двух линиях раковых клеток А-549 и U-937 была изучена зависимость антинеопластической эффективности диГАМК-Mg-глюконата от его концентрации в клеточной суспензии. Типичные примеры таких исследований кратко описаны ниже.

Пример 1. Клеточные суспензии на базе линии А-549 были получены и посеяны в четыре 24-луночных планшета в концентрации 3·10⁴ клеток на одну лунку, как описано выше. ДиГАМК-Mg-глюконат вносили в питательные среды в разведениях 10^-1, 10^-2, 10^-3 и 10^-4 мМ/л.

Этот препарат в разведении 10^-1 мМ/л уже через 24 часа вызывал гибель 85% раковых клеток, а в минимальном разведении 10^-4 мМ/л обеспечивал в течение 72 часов гибель 50% раковых клеток от их первоначального количества.

Пример 2. Клеточные суспензии на базе линии U-937 были получены и посеяны в четыре 24-луночных планшета в концентрации 3_*10⁴ клеток на одну лунку, как описано выше. ДиГАМК-Mg-глюконат вносили в питательные среды в разведениях от 10^-1 до 10^-4 мМ/л.

Этот препарат в разведении 10^-1 мМ/л уже через 24 часа вызывал гибель 95% раковых клеток, а в минимальном разведении 10^-4 мМ/л обеспечивал в течение 72 часов гибель 60% раковых клеток от их первоначального количества.

В контроле на суспензиях здоровых клеток было установлено, что их гибель под действием диГАМК-Mg-глюконата в разведении 10^-1 мМ/л в течение 72 часов не превысила 7%, то есть на уровне допустимой погрешности оценки.

3) Предварительные методические рекомендации по применению препаратов согласно изобретению для лечения онкологических заболеваний.

Предложенные препараты на основе глюконовой кислоты можно применять для профилактики и лечения неопластических процессов. Профилактическое применение препаратов особенно оправдано на фоне иммунодефицита произвольной этиологии.

Можно предположить, что эти препараты будут наиболее эффективны при раковых заболеваниях легких, головного мозга, почек и желудочно-кишечного тракта (особенно при парентеральном или пероральном применении).

В случае раковых заболеваний кожи возможно их местное (локальное) применение (в частности, в виде аппликаций растворов, мазей или линиментов либо трансдермально).

Применение препаратов согласно изобретению в клинической практике может сочетаться с общепринятой химио- или интерферонотерапией. Такое сочетание особенно полезно на фоне развития резистентности опухолевой ткани к интерферонам.

Промышленная применимость

Антинеопластические препараты согласно изобретению могут быть легко изготовлены промышленным путем и использованы для профилактики и амбулаторного или клинического лечения онкологических заболеваний. Они легко усваиваются и практически безвредны для человеческого организма даже в таких разовых дозах, которые существенно превышают терапевтически необходимые дозы.

АНТИПРОЛИФЕРАТИВНАЯ И ПРОАПОПТОЗНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТОВ НА КУЛЬТУРАХ РАКОВЫХ КЛЕТОК in vitro (указано количество жизнеспособных клеток в %) Экспозиция, часы Тип культуры раковых клеток А-549 А-549-R U-937 Испытуемые препараты 24 48 72 24 48 72 24 48 72 Контроль 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Доксорубицин 60 50 40 60 50 50 40 50 50 Глюконовая кислота 80 80 70 80 80 70 80 80 70 Глюконат магния 50 50 60 50 50 60 50 50 60 Глюконат калия 60 60 70 60 60 70 60 60 70 Этилендиаминглюконат 40 50 50 40 50 50 40 50 50 ГАМК-глюконат 50 50 60 50 50 60 50 50 60 ДиГАМК-Mg-глюконат 40 45 55 40 40 55 10 20 35 Ди-3-гидроксиГАМК-Mg-глюконат 50 45 50 50 45 50 50 45 50 Координационное соединение ЭДТА-Mg₂-диглюконат 50 40 40 50 40 40 50 40 40 Координационное соединение ЭГТА-Mg₂-диглюконат 35 40 40 35 40 40 70 80 70 Координационное соединение ЭДТА-Mg₃-триглюконат 40 40 50 40 40 50 60 50 65 Координационное соединение ЭГТА-Mg₃-триглюконат 30 40 40 30 40 40 60 60 60 Бутиратоглюконат магния 40 50 40 40 50 40 60 60 60 Оксибутиратоглюконат магния 50 50 45 50 50 45 50 50 45 Глюкаратоглюконат магния 60 50 50 50 40 40 60 60 50 ДиГАМК-Са-глюконат 60 50 50 60 50 50 60 50 50 Ди-3-гидроксиГАМК-Са-глюконат 50 50 55 55 50 55 55 50 55 Координационное соединение ЭДТА-Са₂-диглюконат 40 50 50 40 70 90 40 70 90 Координационное соединение ЭТТА-Са₂-диглюконат 30 40 50 30 70 70 60 80 75 Координационное соединение ЭДТА-Са₃-триглюконат 40 40 50 40 40 50 60 40 50 Координационное соединение ЭГТА-Са₃-триглюконат 40 50 70 40 50 40 60 65 70 Бутиратоглюконат кальция 40 50 50 40 50 50 40 30 40 Оксибутиратоглюконат кальция 50 50 60 50 50 60 50 50 60 Глюкаратоглюконат кальция кальция 60 70 70 60 70 70 60 70 70

Антинеопластический препарат, представляющий собой координационное соединение на основе глюконата магния, в котором лиганды выбраны из группы, состоящей из γ-аминомасляной кислоты (ГАМК), 3-гидрокси-ГАМК, этилендиаминтетрауксусной кислоты и этиленгликольтетрауксусной кислоты, или двойную соль, выбранную из группы, состоящей из бутиратоглюконата магния, оксибутиратоглюконата магния, глюкаратоглюконата магния, бутиратоглюконата кальция, оксибутиратоглюконата кальция, глюкаратоглюконата кальция и их комбинаций. Препарат способен проявлять апоптозный и антипролиферативный эффект на фоне сохранности здоровых клеток. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Антинеопластический препарат на основе глюконовой кислоты, отличающийся тем, что он представляет собой координационное соединение на основе глюконата магния, в котором лиганды выбраны из группы, состоящей из ГАМК, 3-гидрокси-ГАМК, этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и этиленгликольтетрауксусной кислоты (ЭГТА).

2. Антинеопластический препарат по п.1, отличающийся тем, что он представляет собой координационное соединение диГАМК-Mg-глюконат.

3. Антинеопластический препарат на основе глюконовой кислоты, отличающийся тем, что он представляет собой двойную соль, выбранную из группы, состоящей из бутиратоглюконата магния, оксибутиратоглюконата магния, глюкаратоглюконата магния, бутиратоглюконата кальция, оксибутиратоглюконата кальция, глюкаратоглюконата кальция и их комбинаций.

4. Антинеопластический препарат по п.3, отличающийся тем, что он представляет собой глюкаратоглюконат магния.