СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕНОТИПИЧЕСКИ НЕВЫРАЖЕННЫХ ФОРМ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПТИЦЫ Российский патент 2009 года по МПК A01K67/02 

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к селекции сельскохозяйственной птицы.

Известно, что основным критерием, по которому можно прогнозировать продуктивные качества птицы, является порода-линия-кросс (формы). В последнее время некоторые виды птиц, считавшихся ранее дикими, приобрели сельскохозяйственное значение. Но не везде ведется строгий контроль их происхождения. В связи с этим затруднено не только прогнозирование продуктивных качеств, но и селекционная работа. Внешние (фенотипические) признаки не всегда четко проявляются. Классическим методом выяснения происхождения животных является генетическая экспертиза как непосредственная, основанная на анализе ДНК (заявка №2004126246/13), так и опосредованная - по иммунологическим реакциям (заявка №97121627/13). Но она может быть использована только в том случае, если известны маркеры. В этом ее основной недостаток. Определение по другим показателям (по продолжительности периода эмбрионального развития - заявка №96101232/13), возможно лишь у тех видов животных, у которых выявлена их жесткая взаимосвязь с теми или иными формами, а величина различия достаточно велика.

В предлагаемом изобретении разработан способ определения фенотипически невыраженных форм сельскохозяйственных птиц, простой для использования и дающий однозначный ответ. В основе изобретения лежит обнаруженный нами факт, что суммарное содержание нитро- и нитрозосоединений (RNO+RNO₂) в амниотической жидкости эмбрионов сельскохозяйственной птицы тесно связано со скоростью роста птенцов после вылупления. У быстрорастущих (мясных) форм этот показатель многократно ниже, чем у исходных, а также яичных. Это позволяет использовать его для прогнозирования мясной продуктивности фенотипически невыраженных особей, а также для подбора пар в селекционной работе.

Пример конкретного выполнения

Эксперименты проводились на амниотической жидкости эмбрионов птиц, полученных в ООО "Генофонд" (г.Сергиев Посад) - куры, перепела и цесарки, в парке птиц "Воробьи" (Калужская область) - страусы. Отборы амниотической жидкости брались на 7 и 11 сутки инкубации у куриных эмбрионов, на 10 - у перепелиных, на 9 и 15 - у цесариных и на 15 и 18 - у страусиных. В каждом случае было исследовано от 10 до 30 эмбрионов.

В амниотической жидкости определялось суммарное содержание нитрата, нитрита, высокомолекулярных нитрозо- и нитросоединений (то есть высоко- и низкомолекулярных нитрозо- и нитросоединений (RNO+RNO₂)). Этот показатель был относительно (±10%) стабилен в течение всего периода развития эмбриона.

Определение содержания RNO+RNO₂ осуществлялось при помощи метода, основанного на способности нитрозосоединений ингибировать фермент каталазу. Он подробно описан в следующих работах: [Титов В.Ю., Петренко Ю.М. (2003) Биохимия, 68, 769-776; Титов В.Ю., Петренко Ю.М. (2005) Биохимия, 70, 575-587; Титов В.Ю., Петренко Ю.М., Ванин А.Ф. Вестник Гродненского Государственного Университета им. Янки Купалы, 2007, серия 2, №2(52), с.93-100].

Порядок определения RNO+RNO₂ и необходимые реактивы

40 мМ р-р КН₂РО₄ (или NaH₂PO₄);

1,5 М маточный раствор NaCl;

25 мкМ маточный водный раствор нитрита (натрия либо калия) - для калибровки;

30 мМ маточный водный раствор хлорида ванадия (VCl₃) - восстановитель нитросоединений в нитрозо-.

Гемолизированные эритроциты коровы, полученные путем разбавления крови дистиллированной водой в 10 раз;

Перекись водорода (3% р-р).

Порядок проведения анализа

1. Определяется активность каталазы в реакционной среде, содержащей 40 мМ фосфатный буфер, рН 6,0, 150 мМ NaCl, 9 нМ фирменного препарата каталазы, либо гемолизированные эритроциты коровы (можно крысы, человека), содержащие эндогенную каталазу. Это - контрольный образец.

2. Проводится калибровка. Определяется активность каталазы в вышеуказанной среде в присутствии 125, 250 и 500 нМ нитрита.

3. Образец амниотической жидкости (200 мкл) инкубируется в течение 15 минут с равным объемом 30 мМ р-ра VCl₃. Затем переносится в основную среду (см п.1). Суммарное содержание RNO+RNO₂ определяется по степени снижения активности каталазы в соответствии с калибровкой (см. п.2).

Активность каталазы определяется любым известным методом, не требующим использования перекиси водорода в концентрации более 9 мМ.

Установлено, что линии и кроссы птиц, отличающиеся высокой скоростью прироста живой массы, содержат в амниотической жидкости многократно меньше нитро- и нитрозосоединений, чем исходные и яичные формы.

Анализ амниотической жидкости указанных в таблице пород, линий и кроссов показал, что все формы кур, перепелов и цесарок, считающиеся мясными, содержат многократно меньшую концентрацию нитро- и нитрозосоединений в амниотической жидкости, чем исходные и яичные - десятки и сотни микромоль против тысяч (таблицы 1-3).

Таблица 1 Содержание метаболитов NO в амниотической жидкости куриных эмбрионов на 11-й день инкубации (Х±m_x) Породы, линии, кроссы RNO+RNO₂, мМ Медленнорастущие (ЯИЧНЫЕ) Русская белая 6,8±1,5 Юрловская (мясояичная) 7,5±2,0 Кросс "Радонеж" 5,4±1,5 Кросс "Хайсекс белый" 5,5±1,5 Его родительская линия Х3 5,5±1,5 Г8 - родительская линия кросса "Смена" 5,5±1,0 Быстрорастущие (МЯСНЫЕ) бройлеры и некоторые их родительские линии Кросс "Смена" 0,2±0,05 Его родительская линия Г6 0,02±0,005 Кросс "Конкурент АК839" 0,04±0,015 Его родительская линия К3 0,06±0,02 Его родительская линия К8 0,04±0,015 Его родительская линия К9 0,06±0,02 Кросс "Кобб-500" 0,15±0,05

Таблица 2 Содержание метаболитов NO в амниотической жидкости эмбрионов цесарок
различных пород и линий на 15-й день инкубации (Х±m_x) Цесарки (породы и линии) RNO+RNO₂, мМ ИСХОДНЫЕ Серо-крапчатая 7,5±1,2 Кремовая 8,4±2,0 Загорская белогрудая (ЗБ) 5,5±1,0 Медленнорастущие (ЯИЧНЫЕ) ЗБ-2 (линия ЗБ) 5,5±1,0 Быстрорастущие (МЯСНЫЕ) ЗБ-1 (линия ЗБ) 0,04±0,015

Таблица 3 Содержание метаболитов NO в амниотической жидкости эмбрионов перепелов различных пород на 10-й день
инкубации (X±m_x) Породы RNO+RNO₂, мМ Медленнорастущие (ЯИЧНЫЕ) Японская серая 5,5±1,0 Быстрорастущие (МЯСНЫЕ) Эстонская 0,03±0,01 Фараон 0,2±0,05

Эта закономерность наблюдается и на страусах. В страусоводческих хозяйствах разводят две разновидности страусов: черношеяя и голубошеяя. Потомство, полученное в результате скрещивания этих разновидностей, отличается более высокой, чем родительские формы, скоростью прироста живой массы. Анализ содержания нитро- и нитрозосоединений в амниотической жидкости эмбрионов страусов показал ту же закономерность, которая наблюдалась у кур, перепелов и цесарок: эмбрионы гибридов содержали более чем на порядок меньше нитрозо- и нитросоединений, чем родительские формы (таблица 4).

Таблица 4 Содержание метаболитов NO в амниотической жидкости эмбрионов различных форм черного африканского страуса на 18-й день инкубации (Х±m_х) ФОРМЫ RNO+RNO₂, мМ ИСХОДНЫЕ Черношеяя (Ч) 70±20 Голубошеяя (Г) 70±20 Быстрорастущая (МЯСНАЯ) Потомство Ч Х Г 5,0±1,0

В таблице 5 представлены факты идентификации фенотипически невыраженных форм страуса при помощи теста на содержание нитро- и нитрозосоединений в амнионе. Тест во всех случаях давал однозначные ответы.

Таблица 5 Определение фенотипически невыраженных форм страуса при помощи теста на содержание метаболитов NO в амнионе Самец Самка Содержание
RNO+RNO₂ в амнионе, мМ Вывод № Формы № Формы 1 Черношеий 1 невыражена 80 Самка черношеяя 2 Голубошеий 2 невыражена 5 Самка черношеяя Самец 2 или 3? неизвестно Голубошеий или черношеий - необходимо определить 3 черная 90 Черношеий самец №3 3 Черношеий 4 невыражена 4-5 Самка голубошеяя 3 Черношеий 5 невыражена 6 Самка голубошеяя 3 Черношеий 6 невыражена 85 Самка черношеяя

Изобретение относится к области сельского хозяйства. Способ заключается в том, что быстрорастущие и медленнорастущие формы определяют по суммарному содержанию нитро- и нитрозосоединений в амниотической жидкости эмбриона. Причем этот показатель у медленнорастущих превосходит таковой у быстрорастущих в 10 и более раз. Способ позволяет прогнозировать мясную продуктивность фенотипически невыраженных особей и осуществлять подбор пар в селекционной работе. 5 табл.

Способ идентификации фенотипически невыраженных форм сельскохозяйственной птицы, отличающийся тем, что быстрорастущие и медленнорастущие формы определяют по суммарному содержанию нитро- и нитрозосоединений в амниотической жидкости эмбриона, причем этот показатель у медленнорастущих превосходит таковой у быстрорастущих в 10 и более раз.