СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ЯИЧНОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ ПТИЦЫ Российский патент 1996 года по МПК A01K67/02 

Изобретение относится к биологии и сельскому хозяйству, в частности к генетике и генной инженерии, и может быть использовано в генетике и селекции сельскохозяйственной птицы для получения птицы с новыми хозяйственно-полезными признаками.

Известен способ повышения продуктивности сельскохозяйственных животных, включающий получение трансгенных животных, например получение гигантской овцы и крупных свиней после инъекции в яйцеклетку гена гормона роста 1) Gene engineers fashion gigant sheep, New scientist, 1986, III, N 1516, р. 80. 2) Palmiter R. et al. control of DNA seguence transcription-United States Patent 19, P. N 4, 579, 821, Арч. 1, 1986).

Недостатком способа является то, что он разработан для повышения продуктивности млекопитающих и непригоден для птицы, т. к. специфические особенности размножения птиц и размеры их не позволяют проводить аналогичные манипуляции, которые проводят на яйцеклетках млекопитающих: их вымывание, центрифугирование, инъекции под микроскопом, в питательной среде вне организма с последующей трансплантацией в половые пути.

Известен способ повышения продуктивности птицы, в частности перепелов, селекционным отбором. Селекционным путем были получены перепела эстонской породы (Х. Тикк и др. Эстонский перепел. Птицеводство. 1989, N 1, с. 30 31). Селекционная работа велась на повышение продуктивности птицы, в частности яйценоскости, скороспелости и наращивание массы тела.

В результате были получены перепела со средней массой яиц 12,1 г (по нашим данным у контрольной группы эстонской породы 11,5 г). Недостатком данного способа является то, что селекционная работа очень трудоемка и требует длительного времени.

Имеются сведения о получении трансгенной птицы. При этом использовались ретровирусные векторы, с помощью которых в куриную яйцеклетку внедряли чужеродный ген (Symposium. "Molecular approaches to poultry breeding, Poultry Science, 1986, 65, р. 1437-1495).

Недостатком является то, что у полученной трансгенной птицы не зарегистрировано приобретение новых фенотипических свойств, возможно из-за вводимых генетических конструкций, которые не связаны с генами, обуславливающими продуктивность.

По сельскохозяйственной птице нет сведений о повышении продуктивности птицы и приобретении птицей новых свойств после проведения микроинъекций чужеродного гена в яйцеклетку. Имеется способ получения трансгенной птицы, включающий инъекцию гена гормона роста человека в яйцеклетки кур ("Способ получения трансгенной птицы". Авт. св. N 1550652, N 10, 1990, ДСП) прототип.

Недостатком данного способа является то, что введение данной генетической конструкции (гена гормона роста человека) в куриную яйцеклетку не привело к приобретению птицей новых фенотипических свойств, связанных с продуктивными качествами и передаче их по наследству.

Разработанная на курах технология получения трансгенов оказалась пригодной для другого вида птиц.

Технический результат: заявленный способ позволяет птице приобрести новые свойства и передать их по наследству.

Сущность изобретения: введение гена гормона роста быка в яйцеклетки перепелок.

Заявленное техническое решение отличается от прототипа тем, что:
использована другая генетическая конструкция на другом виде птицы;
сочетание генетической конструкции и видовой специфики яйцеклетки привело к проявлению экспрессии гена в виде увеличения массы яиц;
получен наследуемый фенотипический эффект у трансгенной птицы высокая масса яйца.

Способ иллюстрируется следующими примерами. Эксперименты проводили на птице перепелах эстонской породы. Птицу выращивали в виварии при клеточном содержании и естественном спаривании. Для инъекции гена в яйцеклетку проводили хирургическую операцию по вскрытию брюшной полости под местной новокаиновой анестезией в боковой сагитальной плоскости по брюшной стенке с левой стороны за бедром.

После вскрытия отодвигали кожные и мышечные ткани так, чтобы открывался доступ к яичнику, и проводили микроинъекцию в бластодиск яйцеклетки, находящейся в фолликуле, не извлекая яйцеклеток из брюшной полости. Если при вскрытии брюшной полости оказывалось, что яйцеклетка находится в воронке яйцевода, в нее производилась инъекция, а затем инъецировались фолликулы. Если овуляция только что произошла, ждали, пока яйцеклетка не захватится воронкой яйцевода, затем проводили инъекции в яйцеклетку и фолликулы. Если не было овуляции или яйцеклетка была в белковом отделе яйцевода инъецировали только фолликулы.

Инъекцию в бластодиск яйцеклетки под контролем увеличительных очков проводили стеклянным микрокапилляром с диаметром отверстия 2 4 мкм. Объем вводимого в яйцеклетку раствора ДНК 100 200 пиколитров. Для инъекций использовали генную конструкцию pMTk3bGHatt, включающую в себя металлотионеиновый просмотр и природный ген гормона роста быка (Жаданов А.Б. Получение векторов для экспрессий чужеродных генов в трансгенных животных. В кн. Автореферат диссертации на соискание учен. степ. канд. биол. наук. М. 1991).

Улучшение генно-инженерной конструкции за счет добавления специального att-участка в составе вектора обеспечивает экспрессию встроившегося трансгена независимо от природы геномного окружения сайта интеграции. При конструировании векторов была использована плазмида рИС19.

У подросших перепелят брали кровь из крыловой вены. ДНК выделяли фенол-хлороформным методом из форменных элементов крови, тканей, печени и мышц, взятых биопсией, а также из 10-суточных эмбрионов, получаемых от тестируемых особей. ДНК выделяли также из тканей естественно погибших эмбрионов и перепелят. Выделенную ДНК анализировали на наличие гена гормона роста быка блот-гибридизацией по модифицированной методике Саузерна. Плазму крови перепелят анализировали на бычий гормон роста иммуноферментным методом.

Результаты эксперимента по инъецированию яйцеклеток перепелов представлены в таблице I.

В процессе выращивания перепелов и отвода от них потомства было замечено, что некоторые перепела несут крупные яйца, а из обычных по размерам яиц иногда вылупляются перепелята с высокой живой массой, на 15 20 выше обычной, вне зависимости от массы яйца. Крупные яйца были 14 20 г, встречались яйца до 22,0 г. Фотографии крупных яиц представлены на фиг. 1. Вскрытие крупных яиц показало, что они одножелтковые, двухжелтковые явление крайне редкое.

В таблице 2 представлены данные по учету массы яиц, снесенных двумя перепелками (самка N 29 и N 111), полученными по данному способу.

F_o особи полученные после инъекции в яйцеклетку.

F₁, F₂, F₃ потомство первого, второго и третьего поколения от этой птицы.

Масса яиц самок N 29 и N 111 на 25 29 выше, чем у контрольных яиц (сравнить: 14,9 у самки N 29 и 11,5 у контрольных). Также в потомстве от птицы, полученной по данному способу от самочек и от самцов, наблюдали снесение крупных яиц. В первом поколении F₁ крупные яйца несли три самочки, во втором F₂ пять самочек, в F₃ третьем поколении - шесть самочек.

Происхождение перепелов представлено на фиг. 2. На основании схемы происхождения перепелов можно сказать, что все перепелки несущие крупные яйца произошли от 8 особей, полученных по данному способу: двух самочек NN 29, 111 и шести самцов: NN 26, 22, 33, 21, 14, 32.

Анализ плазмы крови на бычий гормон роста СТГ подтвердил наличие его у самцов N 22, 21, 14 (табл. 3). Бычий гормон роста также синтезировался в потомстве (NN 104 самец, 76 самец, 95 самец) от самцов N 22, 33, 14 (см. схему происхождения фиг. 2, табл. 3).

Результаты блот-гибридизации (табл. 4) на интеграцию чужеродной ДНК подтвердили на радиоавтографе наличие гена гормона роста была у эмбрионов самки N 111, самца N 26, а также особей не вошедших в данную схему: у самки N 8, у самки N 37, у самца N 7 (синтез также СТГ), потомство от которых не отведено. Не вошедшая в схему самка N 108 также показала СТГ в крови.

Из схемы происхождения перепелов видно, что полученный фенотипический эффект высокая масса яйца передается по наследству. В первом поколении F₁ (фиг. 2, табл. 2) три самочки несли крупные яйца (NN 54, 47, 49). Самка N 54 это дочь самки N 111, ДНК которой, выделенная из эмбрионов, давала сигнал на автографе. Самка N 47 дочь самца N 22, в крови которого определен СТГ. Самка N 49 дочь N 32 самца, полученного из инъецированной яйцеклетки. Масса их яиц на 20 27 превышает массу яиц у контрольных перепелок.

Второе поколение перепелов также подтвердило, что полученный данным способом фенотипический эффект наследуется. С целью более полного его выявления было проведено скрещивание экспериментальных особей между собой, а также с контрольной птицей (контрольная птица на схеме не указана). Полученные таким образом перепелки (1 самка и 2 самца), отец которых N 33 получен из инъецированной яйцеклетки, а мать N 47 несла крупные яйца.

При обследовании выявлено, что два брата N 104 и N 76 содержат в крови соматотропный бычий гормон, а их сестра N 105 несет крупные яйца.

Потомки этих трех особей унаследовали данный признак и самки NN 153, 185, 158 несут крупные яйца (на 13 выше, чем контрольные), что наглядно отражено в схеме происхождения перепелов.

Потомство самки N 49, несущей крупные яйца, и самца N 14, кровь которого содержит СТГ, тоже унаследовало приобретенный признак: у самца N 95 в крови зафиксирован соматотропный гормон быка, его сестра N 96 несет крупное яйцо, а потомство от самцов N 90, 91 самочки N 143 и 153 тоже несут крупное яйцо.

В поколении крупнояичных перепелок N 111 и 29 наблюдали появление особей, несущих крупные яйца, самки NN 155, 136, 143, 187, масса их яиц превышает массу контрольных на 23 21 Учет яйценоскости перепелов, несущих крупные яйца, показал, что птица, несущая крупные яйца, имеет яйценоскость не хуже контрольных. В таблице 5 приведены данные по учету яйценоскости перепелов за месяц.

Положительный эффект выражается в том, что у птицы, выращенной из инъецированных яйцеклеток, получен наследуемый фенотипический эффект высокая масса яйца. Средняя яйцемасса на 13 29 выше по сравнению с контролем. ТТТ1 ТТТ2 ТТТ3 ТТТ4 ТТТ5

Использование: в селекции и генетической инженерии, в частности в способах повышения продуктивности птицы. Сущность изобретения: способ предусматривает введение гена гормона роста быка и генной конструкции pMTK3bGHa^tt в яйцеклетки перепелок. У выращенной птицы получен наследуемый фенотипический эффект - высокая масса яйца. Средняя масса яиц на 13 - 29 проц. выше, чем у контрольных. 2 ил., 5 табл.

Способ повышения яичной продуктивности птицы, включающий получение трансгенной птицы, отличающийся тем, что в яйцеклетку перепелок, вводят генную конструкцию pMTk3bGHa^tt, содержащую металлотионеиновый промотор и природный ген гормона роста быка.