ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ В ФОРМЕ РАСТВОРА ДЛЯ ИНЪЕКЦИЙ, ОБЛАДАЮЩАЯ ЦЕРЕБРОВАЗОДИЛАТИРУЮЩЕЙ И НООТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2009 года по МПК A61K31/4015 A61K31/4375 A61K9/08 A61P9/08 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к фармацевтической композиции в форме раствора для инъекций, обладающей церебровазодилатирующей и ноотропной активностью.

Широкое распространение в медицинской практике получил (3α,16α)-эбурнаменин-14-карбоновой кислоты этиловый эфир (винпоцетин), применяемый при нарушениях мозгового кровообращения различного происхождения. Он используется как известное церебровазодилатирующее средство: улучшает мозговое кровообращение, вызывает небольшое снижение системного артериального давления, расширение сосудов головного мозга, усиление кровотока и улучшение снабжения мозга кислородом и глюкозой. Повышает устойчивость клеток головного мозга к гипоксии, облегчая транспорт кислорода и субстратов энергетического обеспечения к тканям (вследствие уменьшения сродства к нему эритроцитов, усиления поглощения и метаболизма глюкозы, переключая его в энергетически более выгодное аэробное направление). Улучшает микроциркуляцию в головном мозге за счет уменьшения агрегации тромбоцитов, снижения вязкости крови, увеличения деформируемости эритроцитов.

Известно, что в неврологической практике при острых очаговых ишемических нарушениях мозгового кровообращения (в случае отсутствия геморрагии) препараты винпоцетина применяют внутривенно. Вводят вначале 0,01-0,02 г (1-2 ампулы) в 500-1000 мл изотонического раствора хлорида натрия (капельная инфузия). При необходимости назначают повторные (3 раза в день) медленные капельные инфузии, затем переходят на прием препарата внутрь (Машковский М.Д. «Лекарственные средства», М., ООО «Новая волна», 2002 г., т.1, с.390-391).

Инъекционная форма винпоцетина описана в ЕР 0305181, опубл. 01.03.1989, в состав известной композиции входят, мас.%:

Винпоцетин 1,2 Аскорбиновая кислота 0,5 Пиросульфат натрия 0,4 Винная кислота 2,4 Бензиловый спирт 3,5 Пропиленгликоль 92

В патенте RU 2212890, опубл. 27.09.2003, раскрыт инфузионный раствор для улучшения мозгового кровообращения следующего состава, мас.%:

Винпоцетин 0,4-0,6 Кислота аскорбиновая 0,04-0,06 Спирт бензиловый 0,9-1,1 Натрия пиросульфат 0,09-0,11 Сорбитол 7,0-9,0 Кислота винная 0,4-0,6 Вода для инъекций Остальное

Из патента RU 2232579, опубл. 20.07.2004, известен раствор винпоцетина, имеющий следующий состав, мас.%:

Винпоцетин 0,25-1,0 Янтарная кислота 0,165-1,5 Натрия хлорид 0,088-0,092 Натрия пиросульфат 0,2-0,5 Аскорбиновая кислота 0,05-0,5 Вода До 1000 мл

Известен 2-оксо-1-пирролидинацетамид (пирацетам), который обладает ноотропным действием при очень низкой токсичности. Пирацетам оказывает положительное влияние на обменные процессы мозга, улучшает интегративную деятельность головного мозга, улучшает микроциркуляцию, не оказывая при этом сосудорасширяющего действия, оказывает защитное действие при повреждениях головного мозга, вызываемых гипоксией, интоксикациями, электрошоком, повышает умственную активность, усиливает мозговой кровоток, не обладает седативным, психостимулирующим влиянием.

Известны различные лекарственные формы пирацетама, в том числе раствор для инъекций, содержащий 1 г активного вещества в ампуле (Машковский М.Д. Лекарственные средства, М., 1993, ч.1, с.135).

Известно ноотропное средство в виде раствора для инъекций, содержащее пирацетам и вспомогательные вещества - оротовую кислоту, этаноламин, лимонную кислоту и воду для инъекций (US 4990513, опубл. 05.02.1991 г.).

В патенте RU 2224514, опубл. 27.02.2004, описано ноотропное средство в форме раствора для инъекций, содержащее, мас.%: пирацетам 15-25, ацетат натрия (0,08-0,11), уксусную кислоту (до рН 5,8) и воду (остальное).

Известно, что пирацетам повышает эффекты усиливающих мозговое кровообращение средств [Регистр лекарственных средств России (РЛС 2001). М.: «РЛС», 2000].

В патенте RU 2126250, опубл. 20.02.1999, описано совместное использование винпоцетина и пирацетама в форме инфузий, которое входит в способ лечения психопатологических синдромов пограничного уровня сосудисто-склеротического генеза, включающий внутривенное капельное введение антидепрессантов в дозе 40-50 мг или транквилизаторов в дозе 5-10 мг в сочетании с ангиопротекторами (в том числе, винпоцетином) в дозе 2,0 мл, ноотропами (в том числе, пирацетамом) в дозе 5,0-10,0 мл и физиологическим раствором в количестве 200,0 мл. Данное изобретение относится к области пограничной психиатрии и не является объектом того же назначения, что и заявляемое изобретение.

Заявляемая фармацевтическая композиция, обладающая церебровазодилатирующей и ноотропной активностью, предназначена для терапевтического лечения больных с нарушениями мозгового кровообращения в раннем восстановительном периоде ишемического инсульта. Кроме того, в представленном описании известного способа не прослеживается связь технического результата изобретения с отдельным использованием комбинации винпоцетина и пирацетама, поскольку эта комбинация добавляется к транквилизатору или антидепрессанту. Возможно, что комбинация винпоцетина и пирацетама способна лишь усиливать эффект психотропных средств (транквилизаторов и антидепрессантов).

Наиболее близким аналогом заявляемого изобретения является фармацевтическая композиция в виде твердой лекарственной формы, обладающая церебровазодилатирующей и ноотропной активностью, разработанная ЗАО «Канонфарма продакшн» и раскрытая в патенте RU 2262931, опубл. 27.10.2005. Известная фармацевтическая композиция содержит винпоцетин и пирацетам в качестве действующих веществ. За счет достигаемого синергического эффекта композиция обладает высокой эффективностью при более низких дозах активных компонентов и высокой биодоступностью.

В соответствии с раскрытым в RU 2262931 изобретением, ЗАО «Канонфарма продакшн» ранее был разработан, зарегистрирован и разрешен к медицинскому применению фармацевтический церебровазодилатирующий и ноотропный препарат Винпотропил^® (регистрационный номер №002632/01-2003), выпускаемый в форме капсул.

Винпотропил^® показан при недостаточности мозгового кровообращения (восстановительный период ишемического и геморрагического инсульта), невротических и психических нарушениях у больных с цереброваскулярной недостаточностью и без нее, дисциркуляторной, гипертонической и посттравматической энцефалопатии, климактерическом синдроме, сосудистых заболеваниях глаз, снижении остроты слуха, интоксикации, абстинентном и астеническом синдромах.

Применение фармацевтического препарата в инъекционной форме имеет ряд преимуществ перед другими формами применения, а именно: более быстрое действие фармацевтически активного вещества из-за непосредственного введения препарата в кровь пациента, отсутствие раздражающего воздействия препарата на органы желудочно-кишечного тракта. В ряде случаев применение инъекционной формы фармацевтического препарата оказывается весьма эффективно в случае невозможности его приема внутрь.

Также неожиданно было обнаружено, что препарат Винпотропил^® (раствор для инъекций), при введении суммарной дозы винпоцетина и суммарной дозы пирацетама, аналогичной достигавшейся при пероральном приеме препарата Винпотропил^® (желатиновые капсулы), обеспечивает, при его непрерывном применении в течение 3 нед. 2 раза в сутки (в соответствии с инструкцией к применению), более выраженное клиническое улучшение, проявляющееся в снижении такой субъективной неврологической симптоматики, как головная боль, головокружение, шум в ушах, нарушения сна, утомляемость и снижение памяти.

Кроме того, задачей данного изобретения является расширение арсенала комбинированных лекарственных средств, предназначенных для терапевтического лечения больных с нарушениями мозгового кровообращения в раннем восстановительном периоде ишемического инсульта.

Технический результат изобретения заключается в получении стабильной фармацевтической композиции в форме раствора для инъекций, обладающей более выраженной, по сравнению с прототипом, церебровазодилатирующей и ноотропной активностью благодаря подбору качественного и количественного состава компонентов.

Поставленная задача решается тем, что фармацевтическая композиция в форме раствора для инъекций, обладающая церебровазодилатирующей и ноотропной активностью, содержит эффективные количества винпоцетина и пирацетама и вспомогательные вещества, обеспечивающие не только необходимую растворимость действующих веществ в инъекционном растворе, но и стабильность раствора при хранении.

Решение поставленной задачи осложнялось тем фактом, что винпоцетин и пирацетам имеют значительную разницу в физико-химических свойствах, в частности в параметрах растворимости. Винпоцетин практически нерастворим в воде, тогда как пирацетам имеет хорошую растворимость в воде. В этой связи необходимо было подобрать состав инъекционной формы так, чтобы в ней присутствовали и винпоцетин, и пирацетам в достаточном для обеспечения терапевтического эффекта количестве, а также обеспечивалась бы стабильность препарата при хранении.

Подбор компонентов фармацевтической композиции осуществлялся экспериментальным путем. Содержание винпоцетина и пирацетама в пересчете на 100 мас.% всей композиции составляет: винпоцетин - 0,1-0,5 мас.%, пирацетам - 5-40 мас.%, остальное - вспомогательные вещества. В качестве вспомогательных веществ могут использоваться кислоты (янтарная, аскорбиновая или аминоуксусная (глицин)), а также различные соли натрия - метабисульфит, хлорид, ацетат или сукцинат.

Фармацевтическую композицию в соответствии с изобретением получают следующим образом: в мерную колбу объемом 1000 мл помещают навески предварительно измельченных и просеянных винпоцетина и пирацетама, кислоты янтарной, кислоты аскорбиновой (или глицина), натрия метабисульфита (или натрия сукцината, или натрия хлорида, или натрия ацетата), прибавляют 400 мл воды для инъекций, растворяют смесь при комнатной температуре, доводят рН до значения не более 4,0 с помощью 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной, доводят объем раствора водой дистиллированной до 1 л, перемешивают.

Готовый раствор фильтруют через фильтр Миллипор (размер пор 0,22 мкм), разливают по ампулам вместимостью 5 мл, запаивают и стерилизуют.

Примеры 1-3 являются иллюстративными, подтверждая возможность осуществления изобретения, без ограничения объема испрашиваемых притязаний.

Пример 1

В мерную колбу объемом 1000 мл помещают 2 г винпоцетина и 160 г пирацетама (предварительно измельченные и просеянные порошки), 15 г кислоты янтарной, 5 г кислоты аскорбиновой (или глицина), 5 г натрия метабисульфита, прибавляют 400 мл воды для инъекций, растворяют смесь при комнатной температуре, доводят рН до значения не более 4,0 с помощью 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной, доводят объем раствора водой дистиллированной до 1 л, перемешивают, разливают по ампулам вместимостью 5 мл, запаивают и стерилизуют.

Пример 2

В мерную колбу объемом 1000 мл помещают 2 г винпоцетина и 400 г пирацетама (предварительно измельченные и просеянные порошки), 4 г кислоты янтарной, 2 г кислоты аскорбиновой, 2 г натрия хлорида, прибавляют 400 мл воды для инъекций, растворяют смесь при комнатной температуре, доводят рН до значения не более 4,0 с помощью 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной, доводят объем раствора водой дистиллированной до 1 л, перемешивают, разливают по ампулам вместимостью 5 мл, запаивают и стерилизуют.

Пример 3

В мерную колбу объемом 1000 мл помещают 2 г винпоцетина и 200 г пирацетама (предварительно измельченные и просеянные порошки), 0,8 г кислоты янтарной, 0,4 г кислоты аскорбиновой, 0,4 г натрия ацетата, прибавляют 400 мл воды для инъекций, растворяют смесь при комнатной температуре, доводят рН до значения не более 4,0 с помощью 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной, доводят объем раствора водой дистиллированной до 1 л, перемешивают, разливают по ампулам вместимостью 5 мл, запаивают и стерилизуют.

В примере 4 приведены данные сравнительного исследования эффективности препарата Винпотропил^® (раствор для инъекций), полученного в соответствии с настоящим изобретением, и препарата Винпотропил^® (желатиновые капсулы), полученного в соответствии с RU 2262931, подтверждающие достижение указанного технического результата.

Пример 4

Характеристика обследованных больных.

В исследование эффективности препарата Винпотропил^® были включены 160 человек (87 мужчин и 73 женщины) в возрасте от 40 до 74 лет (средний возраст 59,2 года) в соответствии с критериями включения и исключения (табл.1).

Таблица 1   Критерии включения и исключения из исследования   Критерии включения в исследование:   Ранний восстановительный период ишемического инсульта (от 4 недель до 6 месяцев)   Возраст от 40 до 70 лет   Критерии исключения из исследования:   Наличие тяжелой соматической патологии   Выраженные когнитивные и эмоционально-волевые нарушения   Выраженные речевые нарушения   Применение в срок до 3 месяцев от начала исследования препаратов, включавших в свой состав винпоцетин и пирацетам  

115 пациентов перенесли ишемический инсульт в каротидном бассейне, 45 больных - в вертебрально-базиллярном бассейне. Сроки от развития инсульта соответствовали раннему восстановительному периоду (с 4-й недели до 6 месяцев). Причинами цереброваскулярных расстройств были атеросклероз церебральных или прецеребральных артерий, гипертоническая болезнь, нарушения сердечного ритма или их сочетание. У всех больных диагноз церебрального инсульта был подтвержден компьютерной томографией или магниторезонансной томографией.

Больные получали одинаковый 3-недельный курс терапии, различаясь только по одному компоненту (8 групп):

I группа (20 больных, из них 12 мужчин и 8 женщин, средний возраст 55,9±3,4 года), получала по 2 капсулы Винпотропила^® (5 мг/капс. винопоцетина, 400 мг/капс. пирацетама) 2 р./сут, перорально;

II группа (20 больных, из них 10 женщин и 10 мужчин, средний возраст 56,4±3,2 года) получала только винпоцетин в дозе 20 мг/сут, перорально;

III группа (20 больных, из них 9 женщин и 11 мужчин, средний возраст 53,1±3,1 года) получала только пирацетам в дозе 1600 мг/сут, перорально;

IV группа (20 больных, из них 10 мужчин и 10 женщин, средний возраст 57,0±2,3 года) получала винпоцетин в дозе 20 мг/сут и пирацетам в дозе 1600 мг/сут, перорально;

V группа (20 больных, из них 8 мужчин и 12 женщин, средний возраст 60,0±3,3 года) получала инъекции композиции винпоцетина и пирацетама в соответствии с настоящим изобретением (1 мл препарата по изобретению 2 р./сут.);

VI группа (20 больных, из них 10 мужчин и 10 женщин, средний возраст 64,0±2,3 года) получала 1 мл 0,5% раствора винпоцетина 2 р./сут в виде инъекций;

VII группа (20 больных, из них 11 мужчин и 9 женщин, средний возраст 63,7±2,8 года) получала 1 мл 40% раствора пирацетама 2 р./сут в виде инъекций;

VIII группа (20 больных, из них 12 мужчин и 8 женщин, средний возраст 61,7±4,3 года) получала 1 мл 40% раствора пирацетама 2 р./сут и отдельно 1 мл 0,5% раствора винпоцетина 2 р./сут в виде инъекций.

Методы исследования:

Всем больным на 1-й и 21-й день исследования проводилась оценка неврологического и нейропсихологического статуса. При исследовании неврологического статуса проводилась балльная оценка выраженности субъективных симптомов: головной боли, головокружения, шума в ушах, нарушения сна, утомляемости и степени снижения памяти. Для этого использовали 5-шаговые балльные рейтинговые шкалы со стандартизированными критериями оценки выраженности каждого субъективного симптома (от 0 (нет нарушений) до 4 (грубые нарушения)) (результаты представлены в таблице 2). Для оценки внимания использовали пробу Бурдона (таблица 3).

Результаты и обсуждение.

Из исследования были исключены 2 пациента основной группы и 5 человек из групп сравнения, в связи с необходимостью коррекции стандартной терапии, не связанной с развитием побочных эффектов. У 5% больных, получавших Винпотропил^® в виде раствора для инъекций, было отмечено появление болей в области желудка и диспепсических явлений, при этом аналогичные жалобы отмечались у 10-20% больных I и IV групп сравнения.

Таблица 2
Динамика среднего балла в выраженности субъективных симптомов № группы I II III IV V VI VII VIII   До До До До До До До До После После После После После После После После Головная боль 2,4 2,1 1,9 2,3 2,5 2,1 2,0 2,4 1,2 1,7 1,6 1,3 1,1 1,5 1,6 1,2 % изм. 50,0%* 19,0%* 15,8% 43,5%* 56,0%* 28,6%* 20,0%* 50,0%* Головокружение 1,9 1,6 1,7 1,9 1,8 1,6 1,8 1,8 1,0 1,2 1,4 1,2 0,8 1,4 1,4 0,9 % изм. 47,4%* 25,0%* 17,6% 36,8%* 55,6%* 12,5% 22,2%* 50,0%* Шум в голове 1,5 1,5 1,3 1,5 1,4 1,6 1,4 1,4 0,8 1,1 1,0 0,9 0,6 1,2 1,1 0,9 % изм. 46,7%* 26,7%* 23,1%* 40,0%* 57,1%* 18,8%* 21,4%* 35,7%* Утомляемость 2,2 2,1 2,0 2,2 2,3 2,2 2,0 2,2 1,5 1,7 1,8 1,6 1,0 1,4 1,6 1,3 % изм. 31,8%* 19,0%* 10,0% 27,3%* 56,5%* 36,4%* 20,0%* 40,9%* Снижение памяти 1,8 1,8 1,9 1,8 2,2 1,8 1,7 1,9 1,3 1,6 1,4 1,4 0,9 1,4 1,0 1,1 % изм. 27,8%* 11,1% 26,3%* 22,2%* 59,1%* 22,2%* 41,2%* 42,1%* Нарушение сна 1,9 1,6 1,7 2,0 1,6 1,7 1,6 1,9 1,1 1,2 1,3 1,3 0,7 1,1 1,2 0,8 % изм. 42,1%* 25,0%* 23,5%* 35,0%* 56,3%* 35,3%* 25,0%* 57,8% * - различия до и после проведения курса лечения являются значимыми (р<0,05)

Из приведенных в таблице 2 данных видно, что, хотя в группах, получавших винпоцетин и пирацетам в капсулах (в виде комбинированного препарата Винпотропил^® или раздельно), а также в группе, получавшей комбинированную терапию, включавшую инъекции пирацетама и винпоцетина (в различные моменты времени), также наблюдалось уменьшение среднего рейтингового балла по оценке выраженности головной боли, головокружения, шума в голове, нарушений сна, снижения памяти и повышенной утомляемости, наиболее отчетливая положительная динамика состояния больных наблюдалась в группе V, получавшей инъекции композиции винпоцетина и пирацетама в соответствии с настоящим изобретением.

Результаты проверки внимания (продуктивность внимания, показатель точности выполнения, показатель продуктивности внимания) обследованных больных представлены в таблице 3.

Таблица 3
Динамика восстановления внимания Показатель I II III IV V VI VII VIII Продуктивность внимания 130,3 135,2 133,6 142,1 137,8 133,5 129,0 139,7 155,3 140,1 145,2 150,0 176,4 147,1 149,8 158,1 % изм. 19,2%* 3,6% 8,7% 5,6% 28,0%* 10,2% 16,1% 13,2% Показатель точности выполнения 0,81 0,87 0,83 0,85 0,80 0,86 0,78 0,83 0,90 0,90 0,86 0,92 0,97 0,9 0,85 0,93 % изм. 11,1% 3,4% 3,6% 8,2% 21,3%* 4,7% 9,0% 12,0% Показатель продуктивности внимания 640 630 650 655 646 636 650 630 688 659 671 683 700 670 680 680 % изм. 7,5% 4,6% 3,2% 4,3% 8,4% 5,3% 4,6% 7,9% * - различия до и после проведения курса лечения являются значимыми (р<0,05)

Из представленных данных можно видеть, что у больных исходно отмечалось значительное расстройство внимания, проявляющееся неустойчивостью и истощаемостью, вплоть до невозможности концентрации на каком-либо виде деятельности. После проведенного лечения показатели имели тенденцию к улучшению, однако не достигали нормальных значений. При этом различия являлись значимыми лишь у пациентов основной группы.

Таким образом, после проведенного 3-недельного курса инъекций препарата Винпотропил^® (раствор для инъекций) наблюдалась значительно более выраженная позитивная динамика основных неврологических и нейропсихологических параметров в сравнении как с аналогичным курсом препарата Винпотропил^® (желатиновые капсулы), так и с курсом, включающим введение либо винпоцетина, либо пирацетама (либо их раздельное введение в различное время). Наиболее близкие результаты были получены при раздельном введении (в различные моменты времени) винпоцетина (в виде раствора для инъекций) и пирацетама (также в виде раствора для инъекций), однако в сравнении с данными видами терапии препарат Винпотропил^® (раствор для инъекций), полученный в соответствии с заявляемым изобретением, оказывал неожиданно превосходное церебровазодилатирующее и ноотропное действие в раннем восстановительном периоде ишемического инсульта.

Предложены фармацевтическая композиция на основе сочетания винпоцетина и пирацетама в форме раствора для инъекций, обладающая церебровазодилатирующей и ноотропной активностью и способ ее получения. Раствор содержит 0,1-0,5 мас.% винпоцетина и 5-40 мас.% пирацетама и вспомогательные вещества. Композицию отличает от аналогичной в форме желатиновых капсул значительно более выраженный синергизм при лечении заболеваний, связанных с острой или хронической недостаточностью мозгового кровообращения в сочетании со стабильностью формы. 2 н. и 11 з.п.ф., 3 табл.

1. Фармацевтическая композиция, обладающая церебровазодилатирующей и ноотропной активностью, содержащая винпоцетин и пирацетам в эффективном количестве и вспомогательные вещества, отличающаяся тем, что выполнена в форме раствора для инъекций.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что содержание винпоцетина составляет 0,1-0,5 мас.%.

3. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что содержание пирацетама составляет 5-40 мас.%.

4. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве вспомогательных веществ содержит одну или несколько кислот, выбранных из группы, включающей янтарную кислоту, аскорбиновую кислоту или аминоуксусную кислоту (глицин).

5. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве вспомогательных веществ содержит одну или несколько солей натрия, выбранных из натрия хлорида, натрия метабисульфита, натрия ацетата и натрия сукцината.

6. Фармацевтическая композиция по п.4, отличающаяся тем, что содержание янтарной кислоты составляет 0,1-1,5 мас.%.

7. Фармацевтическая композиция по п.4, отличающаяся тем, что содержание аскорбиновой кислоты составляет 0,1-1,5 мас.%.

8. Фармацевтическая композиция по п.4, отличающаяся тем, что содержание глицина составляет 0,1 -1,5 мас.%.

9. Фармацевтическая композиция по п.5, отличающаяся тем, что содержание натрия хлорида составляет 0,1-1,5 мас.%.

10. Фармацевтическая композиция по п.5, отличающаяся тем, что содержание натрия метабисульфита составляет 0,1 -1,5 мас.%.

11. Фармацевтическая композиция по п.5, отличающаяся тем, что содержание натрия сукцината составляет 0,1-1,5 мас.%.

12. Фармацевтическая композиция по п.5, отличающаяся тем, что содержание натрия ацетата составляет 0,1-1,5 мас.%.

13. Способ получения фармацевтической композиции по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что
а) навески винпоцетина, пирацетама, кислоты янтарной или ее фармацевтически приемлемой соли (в пересчете на кислоту янтарную), кислоты аскорбиновой (или глицина), натрия метабисульфита (или натрия хлорида, или натрия ацетата) измельчают, просеивают через сито и помещают в мерную колбу объемом 1000 мл;
б) прибавляют 400 мл воды для инъекций;
в) растворяют смесь при комнатной температуре;
г) доводят рН до значения не более 4,0 с помощью 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной;
д) доводят объем раствора водой дистиллированной до 1 л;
е) перемешивают;
ж) разливают по ампулам;
з) запаивают;
и) стерилизуют.