ОПТИМИЗИРОВАННАЯ ЭКСПРЕССИЯ L1 HPV45 В ДРОЖЖАХ Российский патент 2009 года по МПК C12N15/37 C12N15/63 C12N5/10 C12N7/01 A61K39/12 

Описание патента на изобретение RU2360001C2

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится, главным образом, к лечению человека, зараженного вирусом папилломы (HPV). В частности, настоящее изобретение относится к синтетическим полинуклеотидам, кодирующим белок L1 HPV45, а также к рекомбинантным векторам и хозяевам, включающим указанные полинуклеотиды. Настоящее изобретение относится также к вирусоподобным частицам (VLP) HPV45, причем данные частицы образуются путем экспрессии рекомбинантных белков L1 или L1+L2 вируса HPV45 в дрожжевых клетках, и к их использованию в вакцинах и в фармацевтических композициях для профилактики и лечения больных HPV.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Существует свыше 80 типов вируса папилломы человека (HPV), многие из которых ассоциированы с большим числом биологических фенотипов, начиная с развивающихся доброкачественных бородавок до злокачественных карцином (смотрите обзор McMurray и соавт., Int. J. Exp. Pathol. 82(1): 15-33 (2001)). HPV6 и HPV11 представляют собой типы вируса папиллом, чаще всего ассоциированные с доброкачественными бородавками и/или с незлокачественной кондиломой слизистых половых или дыхательных органов. HPV16 и HPV18 представляют собой типы папиллом повышенного риска, часто ассоциированные с in situ-карциномами и с инвазивными карциномами шейки матки, влагалища, наружных женских половых органов и анального канала. Свыше 90% заболеваний рака шейки матки связаны с заражением вирусами HPV16, HPV18 или менее распространенными канцерогенными типами HPV31, -33, -45, -52 и -58 (Schiffman и соавт., J. Natl. Cancer Inst. 85(12): 958-64 (1993)). Наблюдение о том, что ДНК HPV детектируется более чем у 90% больных раком шейки матки, является веским эпидемиологическим свидетельством того, что многие типы HPV вызывают карциному шейки матки (смотрите Bosch и соавт., J. Natl. Cancer Inst. 87(11): 796-802 (1995)).

Вирусы папилломы представляют собой небольшие (50-60 нм), безоболочечные, икосаэдрические ДНК-вирусы, которые кодируются восемью ранними и двумя поздними генами. Открытые рамки считывания (ORF) вирусных геномов обозначают E1-E7, а также L1 и L2, где "E" означает ранний, а "L" означает поздний. L1 и L2 кодируют белки капсида вируса, а E-гены связаны с такими функциями, как репликация вируса и клеточная трансформация.

Белок L1 представляет собой главный белок капсида и обладает молекулярной массой 55-60 кДа. Белок L2 представляет собой минорный белок капсида. Иммунологические данные дают основание полагать, что бтльшая часть белка L2 находится в вирусном капсиде внутри белка L1. И белок L1, и белок L2 разных вирусов папилломы являются высококонсервативными.

Экспрессия белка L1 или сочетания белков L1 и L2 в дрожжах, в клетках насекомых, клетках млекопитающих или бактериальных клетках приводит к самосборке вирусоподобных частиц (VLP) (смотрите обзор Schiller and Roden, в Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds, Великобритания: Leeds Medical Information, pp. 101-12 (1996)). VLP-частицы морфологически сходны с аутотентичными вирионами и при введении животному способны индуцировать высокие титры нейтрализующих антител. Поскольку VLP-частицы не содержат потенциально онкогенного вирусного генома, они представляют собой безопасную альтернативу использования живого вируса для создания HPV-вакцины (смотрите обзор Schiller and Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67-74 (2000)). По этой причине гены L1 и L2 были идентифицированы в качестве иммунологических мишеней при создании профилактической и терапевтической вакцин для HPV-инфекции и заболевания.

Созданию и организации поточного производства HPV-вакцины препятствовали трудности, связанные с получением высокого уровня экспрессии экзогенных генов в успешно трансформированных организмах-хозяевах, лимитирующих продукцию очищенного белка. Поэтому, несмотря на идентификацию нуклеотидных последовательностей дикого [немутантного] типа, кодирующих белки HPV L1, таких как HPV45 L1-белок, было бы весьма желательно создать легко возобновляемый источник неочищенного HPV L1-белка, который использует HPV45 L1-кодирующие нуклеотидные последовательности, оптимизированные для экспрессии в предполагаемой клетке-хозяине. Кроме того, было бы целесообразно получать большие количества VLP-частиц HPV45 L1, обладающих свойствами нативных белков вызывать иммунитет для использования в разработке вакцин.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩЕСТВА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композициям и к способам активизации или усиления иммунитета к белковым продуктам, экспрессируемым генами L1 HPV45, которые ассоциированы с раком шейки матки. В частности, настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотиды, кодирующие белок L1 HPV45, причем данные полинуклеотиды были кодон-оптимизированы для высокоуровневой экспрессии в дрожжевой клетке. Настоящее изобретение обеспечивает также вирусоподобные частицы (VLP) HPV45, где указанные VLP-частицы получают путем экспрессии рекомбинантных L1 или L1+L2 HPV45 в дрожжевых клетках, а также раскрыто использование VLP-частиц HPV45 в фармацевтических композициях и в вакцинах для профилактики и/или лечения больных HPV-ассоциированной злокачественной опухолью.

Настоящее изобретение относится к синтетическим ДНК-молекулам, кодирующим белок L1 HPV45. Кодоны данных синтетических молекул сконструированы таким образом, чтобы использовать данные кодоны предпочтительно в дрожжевой клетке. Указанные синтетические молекулы можно использовать в качестве источника белка L1 HPV45, который может подвергаться самосборке в VLP-частицы. Указанные VLP-частицы можно использовать для создания вакцины на основе VLP.

Пример осуществления настоящего изобретения включает в себя синтетическую молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок L1 HPV45, представленный в SEQ ID NO:2, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, представленную в SEQ ID NO:1.

Также обеспечиваются рекомбинантные векторы и рекомбинантные клетки-хозяева, как прокариотические, так и эукариотические, которые содержат молекулы нуклеиновой кислоты, раскрытые в данном описании.

Настоящее изобретение относится также к способу экспрессии белка L1 HPV45 в рекомбинантной клетке-хозяине, предусматривающему: (а) внедрение вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок L1 HPV45, в дрожжевую клетку-хозяина; и (b) культивирование дрожжевой клетки-хозяина в условиях, которые делают возможным экспрессию указанного белка L1 HPV45.

Далее, настоящее изобретение относится к способу экспрессии белка L1 HPV45 в рекомбинантной клетке-хозяине, включающему в себя: (а) внедрение вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок L1 HPV45, в дрожжевую клетку-хозяина; где молекула нуклеиновой кислоты является кодон-оптимизированной для оптимальной экспрессии в дрожжевой хозяйской клетке-хозяине; (b) культивирование данной дрожжевой клетки-хозяина в условиях, которые делают возможной экспрессию указанного белка L1 HPV45.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеотидов, представленную в виде SEQ ID NO:1 (R-последовательность L1 типа 45).

Настоящее изобретение относится также к вирусоподобным частицам (VLP) HPV, которые продуцируются в дрожжевых клетках, к способам получения VLP-частиц HPV45, и к способам использования VLP-частиц HPV45.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения дрожжи выбраны из группы, состоящей из Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis и Schizosaccharomyces pombe.

Другой аспект настоящего изобретения составляет VLP-частицу HPV45, где VLP-частицу получают в результате рекомбинантной экспрессии L1 HPV45 или L1+L2 HPV45 в дрожжевой клетке.

Еще один аспект настоящего изобретения составляет VLP-частица HPV45, которая содержит белок L1 HPV45, кодируемый кодон-оптимизированным L1-геном HPV45. В примере осуществления данного аспекта настоящего изобретения кодон-оптимизированный L1-ген HPV45 включает в себя последовательность нуклеотидов, представленную SEQ ID NO:1.

Настоящее изобретение обеспечивает также способ индукции у животного иммунного ответа, предусматривающий введение данному животному вирусоподобных частиц HPV45. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения VLP-частицы HPV45 производят с помощью кодон-оптимизированного гена.

Еще один аспект настоящего изобретения составляет способ профилактики или лечения рака шейки матки, вызванного HPV, включающий в себя введение млекопитающему вакцины, содержащей VLP-частицы HPV45. В предпочтительном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения

VLP-частицы HPV45 получают в дрожжах.

Настоящее изобретение относится также к вакцине, включающей вирусоподобные частицы (VLP) HPV45.

В альтернативном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения вакцина дополнительно содержит VLP-частицы, по меньшей мере, одного дополнительного типа HPV. По меньшей мере, один дополнительный тип HPV может представлять собой любой интересующий тип HPV, включая любой тип HPV, описанный в данной области техники, либо тип HPV, который можно было бы идентифицировать впоследствии. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения тип HPV представляет собой тип, который ассоциируется с таким клиническим фенотипом как бородавки, или рак шейки матки. Еще в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, один тип HPV выбран из группы, состоящей из: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, и HPV68.

Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, содержащим вирусоподобные частицы HPV45. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим VPL-частицы HPV45, а также VLP-частицы одного из дополнительных типов HPV. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, один дополнительный тип HPV выбран из группы, состоящей из: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 и HPV68.

Используемые в данном описании и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылку на множественное число, за исключением особо оговоренных случаев.

В данном описании и в прилагаемой формуле изобретения применяют нижеследующие определения и сокращения.

Термин "промотор" относится к сайту узнавания в цепи ДНК, с которым связывается РНК-полимераза. Промотор образует с РНК-полимеразой инициирующий комплекс, который инициирует и направляет транскрипционную активность. Данный комплекс можно модифицировать с помощью активирующих последовательностей, именуемых "энхансерами", или "вышележащими активирующими последовательностями", либо с помощью ингибирующих последовательностей, именуемых "сайленсерами".

Термин "вектор" относится к тем средством, с помощью которых ДНК-фрагменты могут быть введены в организм хозяина или в ткань хозяина. Существуют разнообразные типы векторов, включая плазмиды, вирусы (в том числе аденовирусы), бактериофаги и космиды.

Определение "последовательность L1 дикого типа 45" относится к ДНК-последовательности L1 HPV45, раскрытой здесь в виде SEQ ID NO:3 (45 L1 wt). Несмотря на то что ДНК-последовательность L1 дикого типа HPV 45 была описана раньше, в препаратах ДНК клинических изолятов нередко обнаруживают незначительные изменения этой последовательности. Поэтому типичная ДНК-последовательность L1 дикого типа 45 выделена из клинических образцов, показывающих содержание ДНК HPV45 (смотрите ПРИМЕР 1). Эту последовательность L1 дикого типа 45 используют в качестве стандартной последовательности для сравнения раскрытых здесь кодон-оптимизированных последовательностей L1 45 (смотрите ФИГУРУ 1).

Обозначение "HPV 45 L1 R" или "45 L1 R" относится к раскрытой здесь типичной синтетической нуклеотидной последовательности L1 HPV45 (SEQ ID NO:1), причем данная последовательность была реконструирована таким образом, чтобы она включала кодоны, которые предпочтительны для высокоуровневой экспрессии в дрожжевой клетке.

Термин "эффективное количество" подразумевает введение достаточного количества вакцинной композиции для получения адекватного уровня соответствующего полипептида, вызывающего иммунную реакцию. Специалисту в данной области техники очевидно, что данный уровень может варьироваться.

"Консервативная аминокислотная замена" относится к замене одного аминокислотного остатка другим, химически сходным аминокислотным остатком. Примеры таких консервативных замен включают: замену одного гидрофобного остатка (изолейцин, лейцин, валин, или метионин) другим; замену одного полярного остатка другим полярным остатком с таким же зарядом (например, аргинин на лизин; глутаминовая кислота на аспарагиновую кислоту).

Термин "млекопитающее" относится к любому млекопитающему, включая человека.

"VLP-частица" или "VLP-частицы" подразумевает вирусоподобную частицу или вирусоподобные частицы.

Термин "синтетический" означает, что ген L1 HPV45 создан так, что он содержит последовательность нуклеотидов, которая отличается от последовательности нуклеотидов, представленной в указанном естественно встречаемом гене L1 дикого типа HPV45 (45 L1 wt, SEQ ID NO:3). Как указано выше, синтетические молекулы, приведенные здесь, включают последовательность нуклеотидов, содержащую кодоны, которые предпочтительны для экспрессии в дрожжевых клетках. Синтетические молекулы, приведенные здесь, кодируют ту же аминокислотную последовательность, что и аминокислотная последовательность гена L1 дикого [немутантного] типа HPV45 (SEQ ID NO:2).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На ФИГУРЕ 1 представлено выравнивание ДНК последовательностей, показывающая нуклеотиды, которые были изменены в синтетическом гене L1 HPV45 настоящего изобретения (SEQ ID NO:1, представленная в виде "45 L1 R") (смотрите ПРИМЕР 2). Стандартная последовательность представляет собой последовательность L1 дикого [немутантного] типа 45 (SEQ ID NO:3, представленная в виде "45 L1 wt"; смотрите ПРИМЕР 1). Измененные нуклеотиды указаны в их соответствующем местоположении. Количество нуклеотидов дано в скобках. Идентичные нуклеотиды в реконструированной последовательности L1 45 изображены с помощью точек.

На ФИГУРЕ 2 представлены реконструированная синтетическая нуклеотидная последовательность L1 HPV45 и соответствующая однокодоновая аминокислотная последовательность. Количество нуклеотидов указано слева.

На ФИГУРЕ 3 представлены результаты Нозерн-блотт-зондирования, специфичного для РНК L1 HPV45 в очень жестких условиях (смотрите ПРИМЕР 4). Дорожка (1) содержит 5 мкг РНК R L1 HPV45, а дорожка (2) содержит 10 мкг РНК R L1 HPV45. На полученном блотте виден единственный полноразмерный РНК-транскрипт. Стрелка слева указывает предсказанное положение полноразмерного L1-транскрипта HPV45.

На ФИГУРЕ 4 показан Вестерн-блотт L1 дикого типа 45 и трех R-изолятов L1 HPV45. Содержимое дорожек: 45 L1 wt (дорожка 1), 45 L1 R#4 (дорожка 2), 45 L1 R#7 (дорожка 3), 45 L1 R#11 (дорожка 4), контроль L1 HPV16 (дорожка 5). Дрожжевой экстракт, содержащий пятнадцать микрограмм тотального белка, вносят на каждую дорожку 10%-го SDS-ПААГ. Для специфической идентификации L1-белка HPV45 используют поликлональную антисыворотку козы против химерного белка L1 TrpE HPV45. Стрелка слева указывает положение 55 кДа-белка.

На ФИГУРЕ 5 частично представлены данные двух экспериментов ИФА в нг VLP/мкг общего белка (смотрите ПРИМЕР 7). Показано сравнение между wt L1 45 и R L1 45 двух отдельных клонов. Экспрессия реконструированной VLP L1 HPV45 оказывается примерно в 2 раза выше, чем L1 wt 45.

На ФИГУРЕ 6 представлен типичный образец VLP-частиц HPV45, составленный из белковых молекул R L1 HPV45, описанных здесь, которые визуализируют с помощью просвечивающей электронной микроскопии (смотрите ПРИМЕР 8). Подчеркнутое соответствует приблизительно 10 нм.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Большинство карцином шейки матки связано с инфицированием специфическими онкогенными типами вируса папилломы человека (HPV). Настоящее изобретение относится к композициям и к способам получения или усиления иммунитета по отношению к белковым продуктам, экспрессируемым генами онкогенных типов HPV.

В частности, настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотиды, кодирующие белок L1 HPV45, который подвержен самосборке в вирусоподобные частицы (VLP) HPV45, а также раскрыто использование указанных полинуклеотидов и VLP-частиц в фармацевтических композициях и в вакцинах для профилактики и/или лечения HPV-ассоциированной злокачественной опухоли.

Сообщается о нуклеотидной последовательности L1 дикого типа HPV45 (Инвентарный № в Genbank NC_001590; смотрите также Delius and Hofmann, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 186:13-31 (1994)). Настоящее изобретение обеспечивает синтетические молекулы ДНК, кодирующие белок L1 HPV45. Синтетические молекулы настоящего изобретения включают в себя последовательность кодонов, в которой, по меньшей мере, часть кодонов была изменена для их использования в высокоуровневой экспрессии преимущественно в дрожжевых клетках. Данные синтетические молекулы можно использовать в виде кодирующей последовательности для экспрессии белка L1 HPV45, который может подвергаться самосборке в VLP-частицы. Указанные VLP-частицы можно использовать в вакцине, основанной на VLP, для создания эффективной иммунопрофилактики инфицирования вирусом папилломы с помощью нейтрализующих антител и клеточноопосредованного иммунитета.

Экспрессия VLP-частиц HPV45 в дрожжевых клетках дает преимущества, заключающиеся в рентабельности и легкой адаптации при масштабном выращивании в ферментерах. Вместе с тем, многие белки L1 HPV, в том числе и L1 HPV45, экспрессируются в дрожжевых клетках на уровне, который ниже желательного для масштабного коммерческого производства.

В соответствии с этим настоящее изобретение относится к последовательностям гена L1 HPV45, которые "оптимизируют" для достижения высокоуровневой экспрессии в среде дрожжевых клеток.

Кодоновый "триплет" из четырех возможных нуклеотидных оснований может существовать более чем в 60 вариантных формах. Поскольку данные кодоны содержат информацию лишь для 20 разных аминокислот (а также для инициации транскрипции и терминации), некоторые аминокислоты могут кодироваться более чем одним кодоном, и это явление известно как вырожденность генетического кода. По не вполне понятным причинам альтернативные кодоны неодинаково представлены в эндогенных ДНК разных типов клеток. Очень похоже, что существует изменчивая естественная иерархия, или "предпочтение", для некоторых кодонов в некоторых типах клеток. В качестве примера, аминокислота лейцин задается любым из шести ДНК-кодонов, включая CTA, CTC, CTG, CTT, TTA и TTG. Всесторонний анализ частот использованных кодонов у микроорганизмов показал, что эндогенная ДНК E. coli обычно содержит специфичный для лейцина CTG-кодон, тогда как ДНК дрожжей и слизевиков чаще всего включают специфичный для лейцина TTA-кодон. С учетом данной иерархии обычно полагают, что вероятность получения с помощью E. coli высокоуровневой экспрессии богатого лейцином полипептида до некоторой степени зависит от определенной частоты использования данного кодона. Например, возможно, что богатый TTA-кодонами ген будет недостаточно экспрессироваться в E. coli, а богатый CTG-кодонами ген будет, по-видимому, высокоэкспрессируемым в данном хозяине. Сходным образом, предпочтительным кодоном для экспрессии богатого лейцином полипептида в дрожжевых хозяйских клетках предполагается TTA.

Значение феномена кодонового предпочтения в технике рекомбинантных ДНК очевидно, и это явление может служить объяснением многих прежних неудач в достижении высокоуровневой экспрессии экзогенных генов у успешно трансформированных организмов-хозяев - менее "предпочтительный" кодон может быть повторно представлен во встроенном гене, и механизм экспрессии может действовать неэффективно. Наличие данного феномена означает, что синтетические гены, предназначенные для включения предпочтительных кодонов в предполагаемые клетки-хозяева, предусматривает придание оптимального вида чужеродному генетическому материалу для экспрессии рекомбинантного белка на практике. Следовательно, один из аспектов настоящего изобретения заключается в том, что ген L1 HPV45 является кодон-оптимизированным для высокоуровневой экспрессии в любой дрожжевой клетке. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения выясняется, что использование альтернативных кодонов, кодирующих одну и ту же белковую последовательность, может исключить ограничения по экспрессии L1-белков HPV45 в дрожжевых клетках.

В соответствии с настоящим изобретением сегменты гена L1 HPV45 конвертируют в последовательности, обладающие идентичными транслируемыми последовательностями, но с использованием альтернативного кодона, как это описано у Sharp и Cowe (Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 7:657-678 (1991)), который включен здесь в качестве ссылки. Данная методика, как правило, состоит из идентифицикации кодонов в последовательности дикого [немутантного] типа, которые, в общем, не связаны с высокоэкспрессируемыми дрожжевыми генами, а также с их замещением на оптимальные кодоны для высокой экспрессии в дрожжевых клетках. Затем полученную новую генную последовательность проверяют на наличие нежелательных последовательностей, образованных в результате данных кодоновых замен (например, "ATTTA"-последовательностей, случайно созданных интронных сплайс-сайтов узнавания, нежелательных сайтов фермента рестрикции, высокого содержания GC, наличия сигналов терминации транскрипции, которые узнаются дрожжами, и т.д., и т.п.). Нежелательные последовательности элиминируют путем замены существующих кодонов другими, кодирующими ту же аминокислоту. Затем сегменты синтетического гена тестируют на улучшенную экспрессию.

Вышеописанные способы используют для создания сегментов синтетического гена L1 HPV45, с получением гена, содержащего кодоны, оптимизированные для высокоуровневой экспрессии в клеточной дрожжевой среде. Хотя вышеприведенная методика предполагает краткое изложение нашего метода по созданию кодон-оптимизированных генов для их использования в HPV-вакцинах, специалистам в данной области техники очевидно, что подобную вакцину для эффективной или повышенной экспрессии генов можно создать путем незначительных изменений данной методики или путем незначительных вариаций данной последовательности.

В соответствии с этим настоящее изобретение относится к синтетическому полинуклеотиду, включающему в себя последовательность нуклеотидов, кодирующую L1-белок HPV45, либо биологически активный фрагмент или мутантную форму L1-белка HPV45, полинуклеотидную последовательность, включающую кодоны, оптимизированные для экспрессии в дрожжевых клетках-хозяевах. Указанные мутантные формы белка L1 HPV45 включают, но не ограничиваются: замены консервативных аминокислот, аминоконцевые усечения, карбоксиконцевые усечения, делеции или добавки. Любой такой биологически активный фрагмент и/или мутант будет кодировать либо белок, либо белковый фрагмент, который, по меньшей мере, существенно имитирует иммунологические свойства белка L1 HPV45, представленнного в SEQ ID NO:2. Синтетические полинуклеотиды настоящего изобретения кодируют молекулы мРНК, которые экспрессируют функциональный белок L1 HPV45, пригодный для создания терапевтической или профилактической HPV-вакцины.

Один из аспектов настоящего изобретения представляет собой кодон-оптимизированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей белок L1 HPV45 и представленной SEQ ID NO:2, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, представленных SEQ ID NO:1.

Настоящее изобретение относится также к рекомбинантным векторам и к рекомбинантным клеткам-хозяевам, как прокариотическим, так и эукариотическим, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, раскрытые в данном описании.

Синтетическую ДНК HPV45 или ее фрагменты, сконструированные с помощью описанных здесь способов, можно рекомбинантно экспрессировать путем молекулярного клонирования в экспрессионный вектор, содержащий подходящий промотор и другие соответствующие элементы регуляции транскрипций, и затем перенести в прокариотические или эукариотические клетки-хозяева для создания рекомбинантного L1 HPV45. Методы такой обработки полностью описаны у Sambrook и соавт. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, New York (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel и соавт., Green Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York (1988); Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual, Rose и соавт., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1990)), которые, тем самым, полностью включены здесь путем ссылки.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу экспрессии белка L1 HPV45 в рекомбинантной клетке-хозяине, включающему в себя: (а) введение вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок L1 HPV45, в дрожжевую клетку-хозяина; и (b) культивирование данной дрожжевой клетки-хозяина в условиях, которые делают возможной экспрессию указанного белка L1 HPV45.

Настоящее изобретение относится также к способу экспрессии белка L1 HPV45 в рекомбинантной клетке-хозяине, включающему в себя: (а) введение вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок L1 HPV45, в дрожжевую клетку-хозяина; причем указанная молекула нуклеиновой кислоты является кодон-оптимизированной для оптимальной экспрессии в данной дрожжевой клетке-хозяине; и (b) культивирование указанной дрожжевой клетки-хозяина в условиях, которые делают возможной экспрессию указанного белка L1 HPV45.

Настоящее изобретение относится также к способу экспрессии белка L1 HPV45 в рекомбинантной клетке-хозяине, включающему в себя: (а) введение вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, представленную SEQ ID NO:1, в дрожжевую клетку-хозяина; и (b) культивирование данной дрожжевой клетки-хозяина в условиях, которые делают возможной экспрессию указанного белка L1 HPV45.

Синтетические гены настоящего изобретения могут быть собраны в экспрессионную кассету, которая включает в себя последовательности, предназначенные для обеспечения эффективной экспрессии белка L1 HPV45 в соответствующей клетке-хозяине. Кассета предпочтительно содержит синтетический ген с присоединенным к нему транскрипционными и трансляционными регуляторными последовательностями функционально связанными с ним, такими как промоторные последовательности, а также последовательности терминации. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный промотор представляет собой промотор GAL1 S. cerevisiae, хотя специалистам в данной области техники известно, что можно использовать любой из ряда других известных дрожжевых промоторов, таких как GAL10, GAL7, ADH1, TDH1 или PGK-промоторы, либо иных промоторов эукариотических генов. Предпочтительным терминатором транскрипции является терминатор ADH1, хотя можно использовать и другие известные терминаторы транскрипции. Особенно предпочтительным является сочетание промотора GAL1 и терминатора ADH1.

Другой аспект настоящего изобретения касается вирусоподобной частицы (VLP) HPV45, получаемой с помощью рекомбинантной экспрессии в дрожжевой клетке генов L1 или L1+L2 HPV45, способов получения VLP-частиц HPV45, а также способов использования VLP-частиц HPV45. VLP-частицы могут образовываться путем самосборки в том случае, если L1, главный белок капсида вирусов папилломы человека и животных, экспрессируется в дрожжевых клетках, клетках насекомого, клетках млекопитающего или в бактериальных клетках (смотрите обзор Schiller and Roden, в Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds, Великобритания: Leeds Medical Information, pp.101-12 (1996)). Морфологически неразличимые VLP-частицы можно также получить путем экспрессии сочетания капсидных белков L1 и L2. VLP-частицы L1 состоят из 72 пентамеров с икосаэдрической структурой T=7 (Baker и соавт., Biophys. J. 60(6):1445-56 (1991)).

VLP-частицы морфологически сходны с аутентичными вирионами, и при введении животному способны индуцировать высокие титры нейтрализующих антител. Иммунизация кроликов (Breitburd и соавт., J. Virol. 69(6):3959-63 (1995)) и собак (Surich и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(25):11553-57 (1995)) с VLP-частицами показала индуцирование нейтрализующих антител и защиту от экспериментального заражения вирусом папилломы. Но, поскольку VLP-частицы не содержат потенциально онкогенного вирусного генома и могут подвергаться самосборке при экспрессии одного гена, они представляют безопасную альтернативу использования живого вируса для создания HPV-вакцины (смотрите обзор Schiller and Hidesheim, J. Clin. Virol. 19:67-74 (2000)).

Marais и соавт. (J. Med. Virol. 60:331 (2000)) описывают VLP-частицы HPV45, которые были получены в клетках насекомых с гена L1 HPV45, экспрессируемого из бакуловируса. Экспрессия VLP-частиц в клетках насекомых не имеет преимущества при создании вакцины из-за высокой стоимости. Кроме того, зачастую трудно наладить масштабную экспрессию генов L1 HPV45 в культуре клеток насекомых с получением больших объемов, необходимых для создания коммерческого продукта. Получение VLP-частиц HPV45 в дрожжевых клетках ранее не было описано. Экспрессия VLP-частиц HPV в дрожжевых клетках дает преимущества в рентабельности и легко применима для масштабированного выращивания клеток в ферментерах. Помимо этого, дрожжевой геном можно легко изменить, что обеспечивает селекцию рекомбинантов, получение дрожжей с усиленным ростом и экспрессионным потенциалом.

Таким образом, настоящее изобретение относится к вирусоподобным частицам, включающим рекомбинантный белок L1 или рекомбинантные белки L1+L2 HPV45, где данный рекомбинантный белок экспрессируется в дрожжевой клетке.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения VLP-частицы HPV45 получают путем экспрессии L1 HPV45 или L1+L2 HPV45 в дрожжах, выбранных из группы, состоящей из: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis и Schizosaccharomyces pombe.

Следующий аспект настоящего изобретения касается VLP HPV45, которые включают в себя белок L1 HPV45, производимый путем экспрессии кодон-оптимизированного гена L1 HPV45. В предпочтительном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения кодон-оптимизированный ген L1 HPV45 включает в себя последовательность нуклеотидов, представленную SEQ ID NO:1.

Еще один аспект настоящего изобретения представляет собой способ получения VLP-частиц HPV45, включающий в себя: (а) трансформацию дрожжей с помощью рекомбинантной ДНК-молекулы, кодирующей белок L1 HPV45 или белки L1+L2 HPV45; (b) культивирование трансформированных таким образом дрожжей в условиях, которые делают возможными экспрессию рекомбинантной ДНК-молекулы для получения рекомбинантного белка HPV45; и (с) вытделение рекомбинантного белка HPV45 и получение VLP-частиц HPV45.

В предпочтительном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения соответствующие дрожжи трансформируют кодон-оптимизированным геном L1 HPV45 для получения VLP-частиц HPV45. В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения кодон-оптимизированный ген L1 HPV45 включает в себя последовательность нуклеотидов, представленную SEQ ID NO:1.

Настоящее изобретение обеспечивает также способ индукции у животного иммунной реакции, предусматривающий введение данному животному вирусоподобных частиц HPV45. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данные VLP-частицы HPV45 получают с помощью кодон-оптимизированного гена.

Еще один аспект настоящего изобретения касается способа профилактики заболевания или лечения пациента с HPV-ассоциированным раком шейки матки, включающего в себя введение млекопитающему вакцины, содержащей VLP-частицы HPV45. В предпочтительном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения VLP-частицы HPV45 получают в дрожжах.

Настоящее изобретение относится также к вакцине, содержащей вирусоподобные частицы (VLP) HPV45.

В альтернативном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения указанная вакцина дополнительно включает VLP-частицы, по меньшей мере, одного дополнительного HPV-типа. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, один указанный дополнительный HPV-тип выбран из группы, состоящей из: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 и HPV68.

В предпочтительном варианте осуществления данного аспекта настоящего изобретения указанная вакцина дополнительно содержит VLP-частицы HPV16.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная вакцина дополнительно содержит VLP-частицы HPV16 и VLP-частицы HPB18.

Еще в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная вакцина дополнительно содержит VLP-частицы HPV6, VLP-частицы HPV11, VLP-частицы HPV16 и VLP-частицы HPV18.

Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, включающим в себя вирусоподобные частицы HPV45. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим в себя VLP-частицы HPV45 и VLP-частицы, по меньшей мере, одного дополнительно HPV-типа. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, один дополнительный HPV-тип выбран из группы, состоящей из: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 и HPV68.

Вакцинные композиции настоящего изобретения могут использоваться поодиночке в соответствующих дозах, установленных при рутинном тестировании для того, чтобы получить оптимальное подавление HPV45-инфекции, а также минимизировать любую потенциальную токсичность. Кроме того, может быть желательно также совместное или последовательное введение иных агентов.

Количество вирусоподобных частиц, которое вводят в вакцину для реципиента, зависит от иммуногенности экспрессируемого генного продукта. В большинстве случаев в мышечную ткань непосредственно вводят иммунологически или профилактически эффективную дозу около 10-100 мкг, и предпочтительно прямо в мышечную ткань вводят около 20-60 мкг VLP-частиц. Предполагаются также подкожная инъекция, внутрикожное введение, чрескожное воздействие и иные способы введения, такие как внутрибрюшинное, внутривенное или путем ингаляции. Предполагается также создание активных прививок. Преимуществом является также парентеральное введение, такое как внутривенное, внутримышечное, подкожное или иные способы введения с адъювантами, такими как квасцы или адъювант фосфат алюминия Merck, одновременно или с последующим парентеральным введением вакцины настоящего изобретения.

Все указанные здесь публикации включены в качестве ссылки с целью описания и раскрытия методов и материалов, которые могут быть использованы в связи с настоящим изобретением. Ничего из того, что здесь рассмотрено в качестве допущения, не дает права настоящему изобретению датировать такое раскрытие задним числом на основании предшествующего изобретения.

Описав предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения со ссылкой на прилагаемые чертежи, следует иметь в виду, что настоящее изобретение не ограничивается определенными вариантами его осуществления, и что специалистом в данной области техники могут быть осуществлены различные изменения и модификации, не выходящие за рамки объема или существа настоящего изобретения, которые определены в прилагаемой формуле изобретения.

Нижеследующие примеры иллюстрируют, но не ограничивают настоящее изобретение.

ПРИМЕР 1

Определение типичной L1-последовательности HPV45.

L1-последовательность HPV45 описана раньше (№ по каталогу в Genbank NC_001590; смотрите Delius and Hofmann Curr. Top. Microbiol. Immunol. 186:13-31 (1994)). Вместе с тем, нередко в полученных клинических изолятах среди молекул ДНК обнаруживают небольшие вариации последовательности. Для определения типичной последовательности L1 дикого типа HPV45 выделяли ДНК из четырех клинических образцов, в которых ранее показано наличие ДНК HPV45. Последовательности L1 HPV45 амплифицировали в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием ДНК Taq-полимеразы и следующих праймеров: F L1 HPV45 5'-CCACCACCACCTATATAGGTATTC-3' (SEQ ID NO:4) и B L1 HPV45 5'-CAAACATACATATATGTGCTAACA-3' (SEQ ID NO:5). Полученные амплифицированные продукты разделяли с помощью электрофореза в агарозных гелях и визуализировали путем окрашивания бромистым этидием. Из геля вырезали полосы L1 размером около 1500 п.н. и ДНК выделяли с использованием набора QUA для быстрого выделения очисткой продуктов ПЦР (Qiagen, Hilden, Германия). Затем выделенную ДНК лигировали с TA-клонирующим вектором (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), трансформировали E. coli с помощью данной лигирующей смеси, высевали на LB-агар с ампициллином, ИПТГ и X-gal для отбора голубых/бесцветных колоний. Засеянные чашки опрокидывали и инкубировали в течение 16 часов при 37°С.

ПЦР колоний осуществляли на восьми бесцветных колониях, происходящих от каждого из четырех клинических изолятов, которые были подвергнуты ПЦР-амплификации. ДНК L1 HPV45 подвергали ПЦР-амплификации с использованием праймеров F L1 HPV45 и B L1 HPV45. Конкретный ПЦР-протокол состоял из 25 циклов по 15 секунд при 98°С (денатурация), 30 секунд при 50°С (отжиг) и 2-х минут при 68°С (удлинение). ПЦР-продукты после гель-электрофореза визуализировали путем окрашивания бромистым этидием. Некоторые колонии каждого изолята содержали L1-полосы. Вторую колонию каждого изолята культивировали в LB-среде с ампициллином, встряхивая при 37°С в течение 16 часов. Из каждой такой колонии осуществляли минипрепаративное экстрагирование плазмидной ДНК.

ДНК-секвенирование осуществляли на плазмидах, содержащих амплифицированную и клонированную ДНК L1 HPV45 из четырех клинических изолятов. ДНК и транслируемые аминокислотные последовательности сравнивали друг с другом и с L1-последовательностями HPV45 из Genbank. Анализ последовательностей из четырех клинических изолятов обнаружил, что ни одна из последовательностей не идентична последовательности из Genbank. Плазмида L1 HPV45 из изолята №33 была выбрана для представления последовательности дикого типа (wt) L1 45 и приводится здесь в качестве "последовательности дикого типа L1 45" (SEQ ID NO:3, смотрите ФИГУРУ 1). Данная последовательность содержит девять нуклеотидов, три аминокислоты, делецию, которая сохраняет открытую рамку считывания последующей последовательности, пять точковых мутаций, дающих изменения в пяти аминокислотах, и восемь дополнительных молчащих точковых мутаций. В последовательности L1 wt 45 аминокислоты 495-497, характерные для Genbank последовательности, делетированы. Номера аминокислот из Genbank 23 (S->N), 55 (N->S), 303 (I->T), 357 (S->N), и 356 (Q->H) соответствуют пяти аминокислотным заменам (Genbank aa->45 L1 wt aa). Указанные 8 молчащих мутаций распределены по всей данной последовательности. Смотрите ФИГУРУ 1.

Последовательность L1 45 дикого типа амплифицировали с использованием праймеров LS-112 5'-CTCAGATCTCACAAAACAAAATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTGAC-2' (SEQ ID NO:6) и EAS L1 HPV45 5'-GACAGATCTTATTTTTTACTACGTATACGTACACG-3' (SEQ ID NO:7) с добавлением BglII-удлинений. ПЦР осуществляли с использованием Vent-полимеразы. Амплифицированный ПЦР-продукт визуализировали, окрашивая агарозный гель бромистым этидием. Вырезали полосу размером около 1500 п.н. и выделяли очисткой ДНК с использованием гель-экстрагирующего набора QIAEX II (Qiagen). Экстрагированный ПЦР-продукт обрабатывали с помощью BglII при 37°С в течение 2 часов и выделяют очисткой с использованием набора QIA для быстрого выделения очисткой продукта ПЦР. Обработанный с помощью BglII ПЦР-продукт L1 HPV45 лигировали с BamHI-обработанной pGAL110 (как описано у Hofmann и соавт., Virology 209:506-18 (1995)) и с помощью данной лигирующей смеси трансформировали штамм DH5 E. coli.
Колонии подвергали скринингу с помощью ПЦР на наличие вставки L1 HPV45 в правильной ориентации. Последовательность нуклеотидов и ориентацию подтверждали с помощью ДНК-секвенирования. Отобранный клон получал название pGAL110-HPV 45 L1 #6. Данный клон обрабатывали с помощью PstI, EcoRI и HindIII, чтобы определить профиль рестрикциионного фрагмента гена L1 HPV45 в векторе pGAL110. ДНК-фрагменты подвергали электрофорезу в агарозных гелях. Полученный профиль рестрикционных фрагментов визуализировали путем окрашивания бромистым этидием и просматривали под УФ-светом.

Готовили maxiprep ДНК. Клетки Saccharomyces cerevisiae делали компетентными, превращая их в сферопласты с помощью Glusulase, и трансформировали с помощью pGAL110-HPV 45 L1 #6. Смесь для трансформации дрожжей наслаивали на поверхность агара с Leu(-)-сорбитом в чашках с Leu(-)-сорбитом и инкубировали их в перевернутом состоянии в течение 5-7 дней при 30°С. Колонии отбирали и высевали штрихом для выделения клонов на Leu(-)-сорбитных чашках. Выделенные колонии последовательно выращивали при 30°С во вращающихся культуральных пробирках, содержащих по 5 мл 5Х Leu(-) Ade(-)-сорбита с 1,6% глюкозы и 4% галактозы, чтобы индуцировать транскрипцию L1 и экспрессию белка.

ПРИМЕР 2

Кодон-оптимизация дрожжей.

Описаны предпочтительные кодоны дрожжей (Sharp, Paul M. and Cowe, Elizabeth 1991 Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae YEAST 7:657-678). Обнаружена экспрессия белка L1 wt HPV45; однако для получения повышенной экспрессии, необходимой для создания коммерческого продукта, ген L1 HPV45 реконструировали с использованием кодонов, предпочтительных для дрожжей. Указанная реконструировали последовательность должна обеспечить повышенную экспрессию L1 HPV45, что было бы шагом вперед по использованию последовательности дикого типа в создании вакцины. Если данную последовательность реконструировать с использованием оптимизированных дрожжевых кодоновых последовательностей, то нуклеотидная последовательность L1 wt 45 окажется измененной по 392 позициям с образованием R L1 45 (R=реконструировать). Тем не менее, соответствующая аминокислотная последовательность не изменится. Указанные нуклеотидная (SEQ ID NO:1) и аминокислотная (SEQ ID NO:2) последовательности представлены на ФИГУРЕ 2.

Способ реконструкции данного гена использовали для создания обширного перекрывания смыслового и антисмыслового олигомеров, чтобы охватить данный ген, заменяя нуклеотиды на предпочтительные дрожжевые кодоновые последовательности при сохранении исходной аминокислотной последовательности. Данные олигомеры использовали вместо ДНК-матрицы в технике ПЦР. Создавали дополнительные амплификационные праймеры и использовали для амплификации реконструированных последовательностей с данной матрицы олигомеров. В ПЦР из 25 циклов использовали Pfu-ДНК-полимеразу.

Оптимальными для амплификации являлись специфичные условия для каждого участка, однако более употребима следующая программа: 94°С в течение 5 минут (денатурирующих) с последующими 25 циклами при 95°С в течение 30 сек (денатурация), 55-50°С в течение 30 сек (отжиг), и 72°С в течение 1,5 минут (удлинение), с последующим окончательным удлинением в течение 7 минут при 72°С и выдерживания при 4°С. ПЦР-продукты исследовали с помощью электрофореза в агарозном геле. Полосы соответствующего размера вырезали и из них выделяли очисткой ДНК. Полученные амплифицированные фрагменты использовали затем в качестве матрицы для сборки реконструированного гена L1 HPV45 длиной 1533 п.н..

После реконструирования электрофорезированную полосу размером 1533 п.н. выделяли из геля очисткой, лигировали с pCR4 Blunt (Invitrogen) и TOP10-клетки E. coli трансформировали с помощью данной лигирующей смеси. Колонии растили в 4 мл LB с ампициллином, а плазмидную ДНК экстрагировали с помощью стандартных минипрепаративных методов. Экстрагированную плазмидную ДНК секвенировали, чтобы подтвердить наличие требуемых изменений в реконструированной L1 45. Указанную R (реконструированную) последовательность L1 45 реамплифицировали из pCR4Blunt-45 L1 R с добавленными BamHI-удлинениями по обоим концам и добавленной дрожжевой 5'-нетранслируемой лидерной последовательностью слева от ATG-кодона инициации. Полученный амплифицированный фрагмент клонировали, как указано выше, а плазмидную ДНК секвенировали. Данную плазмиду, pCR4 Blunt-45 L1 R (Bam), обрабатывали с помощью BamHI и ДНК-фрагменты подвергали электрофорезу в агарозном геле. Из геля выделяли очисткой фрагмент L1 R (Bam) 45 размером приблизительно 1550 п.н., лигировали его с BamHI-обработанной pGAL110 и трансформировали в TOP10F' E. coli (Invitrogen).

С помощью ПЦР скринировали колонии на наличие вставки R L1 HPV45 в правильной ориентации в pGAL110. Последовательность нуклеотидов и ориентацию подтверждали с помощью ДНК-секвенирования. Готовили maxiprep плазмидной ДНК и использовали его для трансформации клеток S. cerevisiae, которые были преобразованы в компетентные путем превращения в сферопласты. Трансформируемые дрожжи помещали сверху на Leu(-)-сорбитный агар в чашках с Leu(-)-сорбитом, которые инкубировали в перевернутом состоянии в течение 7 дней. Колонии сеяли штрихом в Leu(-)-сорбитные чашки для выделения клонов. Выделенные колонии последовательно растили при 30°С во вращающихся культуральных пробирках, содержащих по 5 мл 5X Leu(-)Ade(-)-сорбита с 1,6% глюкозы и 4% галактозы, чтобы индуцировать транскрипцию L1 и экспрессию белка. Через 48 часов объем культуры, эквивалентный ОП600=10, осаждали, удаляли супернатант, а полученный осадок замораживали и хранили при -70°С.

ПРИМЕР 3

Получение РНК.

Осадок клеток трансформированных дрожжей, индуцированных для экспрессии L1 HPV45 в результате галактозной индукции, оттаивали на льду, суспендировали в 0,8 мл реактива Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. В данную пробирку приливали одну пятую объема хлороформа. Затем содержимое пробирки энергично встряхивали в течение 15 секунд для перемешивания и инкубировали при комнатной температуре в течение 3-х минут. После 5 минут центрифугирования при 13 тыс. об/мин собирали верхнюю фазу и переносили ее в новую пробирку. Приливали 0,4 мл изопропанола и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. Центрифугирование до получения осадка РНК осуществляли при 13 тыс. об/мин в течение 10 минут. Образовавшийся супернатант сливали, оставшийся осадок РНК промывали 75%-ным EtOH и повторяли центрифугирование. Данный супернатант сливали, а осадок РНК сушили на воздухе в течение 15 минут и затем суспендировали его в воде, не содержащей РНКазы. Для определения концентрации РНК в данном образце его спектрофотометрировали, допуская, что считывание РНК при А260 дает 1=40 мкг/мл, при том, что А260/280 составляет 1,7-2,0.

ПРИМЕР 4

Нозерн-блотт-анализ.

Готовили 1,1%-ный агарозный гель с формальдегидом. Пять или десять микрограмм РНК объединяли с денатурирующим буфером (конечные концентрации: формальдегид - 6%, формамид - 50%, и 0,1 х MOPS) и в течение 10 минут нагревали до 65°С. К образцу добавляли одну десятую объема гелевого буфера и данный образец вносили в гель для электрофореза. Электрофорез осуществляли при напряжении 75 вольт в 1 х MOPS-буфере в течение приблизительно 3-х часов. Электрофорезированный гель промывают в 10 х SSC в течение 60 минут.

Электрофорезированную РНК капиллярно переносили на нейлоновую мембрану Hybond-N+ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) в 10 х SSC в течение свыше 16 часов. Затем перенесенную РНК фиксировали на нейлоновой мембране путем сшивки с использованием сшивки Stratagene UV-Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA). После фиксации данную нейлоновую мембрану сушили на воздухе.

Для мечения ДНК-последовательностей R L1 45 с помощью DIG, которые использовали в качестве зонда для детектирования РНК R L1 45 в Нозерн-блотте, применяли Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Kit I (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Швейцария). Прегибридизацию, гибридизацию и иммунологическое выявление с использованием конъюгированных с щелочной фосфатазой антител против DIG осуществляли по рекомендациям производителя. Вкратце, данный блотт прегибридизовали при 37°С в течение 30 минут при плавном покачивании. Зонд денатурировали путем нагревания до 95°С в течение 5 минут и резко охлаждали на льду. Охлажденный зонд вводили в раствор для гибридизации и наносили на данную мембрану в течение 4-х часов при 44,6°С при плавном покачивании. Затем раствор для гибридизации удаляли и данный блотт дважды отмывали в течение 5 минут в 2 х SSC с 0,1% SDS при комнатной температуре с последующей дополнительной отмывкой при 65°С с помощью 0,5 х SSC и 0,1% SDS. После этого отмытый блотт блокировали в течение 30 минут и на 30 минут наносили конъюгированные с щелочной фосфатазой антитела против DIG в разведении 1:5000. Полученный блотт отмывали, а присутствие фиксированного с РНК зонда определяли по NBT/BCIP-субстратной детекции щелочной фосфатазы, конъюгированной со связанными против DIG антителами.

Первоначальный анализ дрожжей, экспрессирующих wt L1 45, подтверждает существование функциональной транскрипции и трансляции L1 HPV45; однако данная последовательность, реконструированная с помощью дрожжевых предпочтительных кодоновых последовательностей для получения повышенного уровня экспрессии, пригодна для создания вакцины. Реконструированную последовательность L1 45 создавали, чтобы исключить вероятность появления любого раннего сайта терминации транскрипции и обеспечить устойчивую транскрипцию. Нозерн-блотт-анализ транскрипта R L1 45 показал образование полноразмерных транскриптов (ФИГУРА 3).

ПРИМЕР 5

Экспрессия белка L1 HPV45.

Замороженные осадки индуцируемых галактозой культур дрожжевых клеток, эквивалентные ОП600=10, оттаивали на льду и суспендировали в 300 мкл PC-буфера (100 мМ Na2HPO4 и 0,5 М NaCl, рН 7,0) с 2 мМ PMSF. Добавляли промытые кислотой стеклянные шарики размером 0,5 мм. Содержимое пробирок подвергали турбулизации в течение 3-х циклов по 5 минут при 4°С с интервалом в 1 минуту. Приливали 7,5 мкл 20%-го Тритона Х100 и турбулизацию повторяли в течение 5 минут. Затем эти пробирки помещают на лед на 15 минут, после чего их центрифугировали в течение 10 минут при 4°С. Полученный супернатант переносили в стерильную микроцентрифужную пробирку, регистрировали в качестве тотального экстракта дрожжевого белка, датировали и хранили при -70°С.

ПРИМЕР 6

Вестерн-блотт-анализ.

Тотальный экстракт дрожжевого белка из двадцати выделенных дрожжевых колоний, каждая из которых содержит конструкт L1 45, анализировали с помощью Вестерн-блотт для подтверждения экспрессии белка L1 45 после индукции галактозой.

Десять микрограмм дрожжевого белка из тотального экстракта объединяли с SDS-ПААГ-буфером для внесения образца и нагревали до 95°С в течение 10 минут. Данный белок вносили в SDS-ПААГ-гель и подвергали электрофорезу в трис-глициновом буфере. После электрофоретического разделения белки подвергали Вестерн-переносу из данного геля на нитроцеллюлозу и этот блотт блокировали в 1 х разбавленном буфере (Kirkegaard and Perry Laboratories) в течение 1 часа при комнатной температуре с покачиванием. Полученный блотт отмывали три раза и затем инкубировали с козьей анти-trpE-HPV 45 L1-сывороткой в разведении 1:2500 при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем блотт отмывали три раза и инкубировали в течение 1 часа с анти-козьими-HRP-конъюгированными антителами, разбавленными 1:2500. Полученный блотт вновь отмывали три раза и наслаивали NBT/BCIP-детектирующий субстрат (Kirkegaard and Perry Laboratories). Иммунореактивные белки детектировались на блоте в виде пурпурных полос.

Полученные результаты свидетельствуют, что во всех случаях белок L1 45 детектируется на используемой нитроцеллюлозе в виде отчетливой иммунореактивной полосы, соответствующей приблизительно 57 кДа (ФИГУРА 4). Белок L1 16, который равен приблизительно 55 кДа, был включен в качестве позитивного контроля, наряду с экстрактом тотального дрожжевого белка, не содержащего L1 HPV, включенного в качестве негативного контроля (данные не представлены).

ПРИМЕР 7

ИФА-анализ.

Дрожжевые клетки, экспрессирующие L1 HPV45, выращивали различными способами, включая культивирование во вращающихся пробирках, в колбах со встряхиванием и в ферментерах. Выращенные дрожжи лизировали, а полученные белковые экстракты использовали для определения количества вирусоподобных частиц (VLP) L1 HPV45, образуемых на микрограмм тотального белка. Демонстрацию экспрессии VLP L1 HPV45 осуществляли с использованием сэндвич-ИФА.

Моноклональные антитела (mAb) H18R.5, которые распознают оба типа L1 VLPs HPV - тип 18 и 45, использовали для связывания VLP-частиц L1 тип 45, обнаруживаемых в дрожжевых белковых экстрактах. Несвязавшиеся белки отмывали, а H45.10B11.A5, VLP L 1 HVP45-типа и конформационные специфичные mAb использовали в качестве детекционных антител. Действительно, конформационно правильные VLP-частицы L1 45 оказывались связанными, и детекцию облегчало использование конъюгированных с HRP антител против IgG1 мыши и TMB-субстрат.

В частности, H18R.5 использовали для покрытия дна 96-луночных планшет Immulon 4 HBX в течение ночи при 4°С. Данные планшеты промывали три раза с помощью PBS и 0,005%-ным Твином 20, с последующим блокированием с помощью блокирующего раствора (PBS+0,05% Твин 20+1% BSA). Эти планшеты отмывали три раза и антигены (тотальные дрожжевые клеточные лизаты разбавляли в блокирующем растворе до 100 мкг/мл) наносили в ряд А в повторе. Стандартные образцы выделенных очисткой VLP-частиц L1 HPV45 наносили в ряд А колонок 1 и 2 при 3300 нг/мл по 100 мкг/мл тотального дрожжевого белка. Затем стандартный и опытный образцы последовательно разбавляли в два раза в каждой колонке. Через три часа при комнатной температуре избыток антигена удаляли отсасыванием, и данные планшеты промывали 3 раза. Клеточный супернатант, содержащий VLP L1 HPV45 и конформационные специфичные антитела mAb H45.10B11.A5, разбавляли 1:80 в блокирующем растворе и наслаивали в каждую лунку в течение одного часа при комнатной температуре. Данные планшеты промывали три раза и конъюгированные с HRP антитела к IgG1 мыши, разбавленные 1:8000 в блокирующем растворе, наслаивали в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем планшеты промывали и наносили TMB (Pierce) на 5 минут для детектирования комплексов конъюгированных с HRP антител. Реакцию детектирования останавливали добавлением 2М H2SO4. Планшеты прочитывали при длине волны 450 нм, а концентрацию VLP L1 HPV45, в нг VLP/мкг тотального белка, определяли путем сравнения со стандартными образцами.

Сравнение между wt L1 45 и двумя отдельными клонами R L1 45, проанализированные все в двух повторах, представлено на ФИГУРЕ 5. Экспрессия реконструированной VLP L1 HPV45 оказывается приблизительно в 2 раза выше результатов, полученных для wt L1 45 (ФИГУРА 6).

ПРИМЕР 8

Просвечивающая Электронная Микроскопия.

Чтобы продемонстрировать, что белок L1 45 в действительности подвержен самосборке с образованием пентамерных-L1 капсомеров, которые, в свою очередь, подвергаются самосборке в вирусоподобные частицы, частично выделенный очисткой из экстракта белок R L1 45 анализировали с помощью просвечивающей ЭМ.

Дрожжевые клетки выращивали в условиях ферментации в небольшом масштабе, осаждали и полученный осадок подвергали обработке по выделению очисткой. Осадок и очищенные дрожжевые экстракты анализировали с помощью иммуноблота, чтобы продемонстрировать экспрессию белка L1 и степень очистки после выделения очисткой. Затем очищенные дрожжевые экстракты подвергали центрифугированию через 45%-ную сахарозную подушку, а полученный осадок ресуспендировали в буфере для анализа с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ЭМ).

Полученный типичный образец VLPs R L1 45 представлен на ФИГУРЕ 6. Диаметр полученных сферических частиц в данном неочищенном образце колеблется в диапазоне от 40 до 60 нм, и некоторые частицы проявляют правильное расположение капсомеров.

Похожие патенты RU2360001C2

название год авторы номер документа
МОЛЕКУЛА НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, КОДИРУЮЩАЯ HPV31 L1, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ ВЕКТОР, КЛЕТКА-ХОЗЯИН, ВИРУСОПОДОБНАЯ ЧАСТИЦА И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ, ВАКЦИНА, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБЫ С ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ 2004
  • Янсен Катрин У.
  • Шульц Лорен Д.
  • Нипер Майкл П.
  • Маркус Генри З.
RU2356943C2
ОПТИМИЗИРОВАННАЯ ЭКСПРЕССИЯ HPV 58 L1 В ДРОЖЖАХ 2004
  • Брайан Джанин Т.
  • Браунлоу Мишелл К.
  • Шульц Лорен Д.
  • Ван Синь-Минь
  • Янсен Катрин У.
RU2370538C2
ОПТИМИЗИРОВАННАЯ ЭКСПРЕССИЯ HPV 52 L1 В ДРОЖЖАХ 2005
  • Брайан Джанин Т.
  • Браунлоу Мишелл К.
  • Шульц Лорен Д.
  • Янсен Катрин У.
RU2373219C2
ВАКЦИННАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ПРИГОДНАЯ ПРИ ИНФЕКЦИЯХ HPV И ВИРУСОМ ГЕПАТИТА В, И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ 2009
  • Элла Кришна Муртхи
  • Суматхи Кандасвами
RU2509570C2
РЕКОМБИНАНТНАЯ ВАКЦИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ 2014
  • Крымский Михаил Александрович
  • Борисов Иван Андреевич
  • Яковлев Михаил Симеонович
  • Мельников Владимир Алексеевич
RU2546243C1
Способ получения рекомбинантной вакцины для профилактики папилломавирусной инфекции человека, рекомбинантная вакцина 2018
  • Крымский Михаил Александрович
  • Борисов Иван Андреевич
  • Яковлев Михаил Симеонович
RU2681174C1
РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Hansenula polymorpha - ПРОДУЦЕНТ ГЛАВНОГО КАПСИДНОГО БЕЛКА L1 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА ТИПА 56 2014
  • Крымский Михаил Александрович
  • Борисов Иван Андреевич
  • Яковлев Михаил Симеонович
  • Агафонов Михаил Олегович
  • Тер-Аванесян Михаил Давидович
RU2546240C1
ПАПИЛЛОМАВИРУСНЫЕ ВАКЦИНЫ 1995
  • Янсен Катрин У.
  • Кук Iii Джеймс К.
  • Джордж Хью А.
  • Хофманн Катрин Дж.
  • Джойс Джозеф Г.
  • Лехман Эрнест Дейл
  • Маркус Генри З.
  • Росоловский Марк
  • Шульц Лорен Д.
RU2206608C2
Рекомбинантный штамм дрожжей Hansenula polymorpha - продуцент главного капсидного белка L1 вируса папилломы человека типа 6 2018
  • Крымский Михаил Александрович
  • Борисов Иван Андреевич
  • Яковлев Михаил Симеонович
  • Агафонов Михаил Олегович
  • Тер-Аванесян Михаил Давидович
RU2675471C1
РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ PICHIA ANGUSTA - ПРОДУЦЕНТ КАПСИДНОГО БЕЛКА L1 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА ТИПА 16 2011
  • Крымский Михаил Александрович
  • Борисов Иван Андреевич
  • Яковлев Михаил Симеонович
  • Агафонов Михаил Олегович
  • Тер-Аванесян Михаил Давидович
RU2445357C1

Реферат патента 2009 года ОПТИМИЗИРОВАННАЯ ЭКСПРЕССИЯ L1 HPV45 В ДРОЖЖАХ

Изобретение относится к области вирусологии и медицины. Представлена синтетическая ДНК-молекула, кодирующая белок L1 HPV45. При этом ДНК-молекула была кодон-оптимизирована для высокоуровневой экспрессии белка в дрожжевой клетке. Данные синтетические молекулы можно использовать для получения вирусоподобных частиц (VLP) HPV45 и для получения вакцин и фармацевтических композиций, содержащих VLP-частицы HPV45. Вакцины обеспечивают эффективную иммунопрофилактику заражения вирусом папилломы благодаря нейтрализующим антителам и клеточно-опосредованному иммунитету. Изобретение может быть использовано в медицине. 5 н. и 4 з.п. ф-лы, 6 ил.

Формула изобретения RU 2 360 001 C2

1. Молекула нуклеиновой кислоты, по существу соответствующая последовательности нуклеотидов, которая представлена SEQ ID NO:1 и которая кодирует белок L1 HPV45, представленный SEQ ID NO:2, причем данная последовательность нуклеиновой кислоты является кодон-оптимизированной для высокоуровневой экспрессии в дрожжевой клетке.

2. Экспрессирующий вектор для экспрессии в дрожжевой клетке, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.

3. Дрожжевая клетка-хозяин, содержащая экспрессирующий вектор по п.2.

4. Дрожжевая клетка-хозяин по п.3, где клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis и Schizosaccharomyces pombe.

5. Дрожжевая клетка-хозяин по п.4, где данная клетка-хозяин представляет собой Saccharomyces cerevisiae.

6. Вирусоподобная частица (VLP), содержащая рекомбинантный белок L1 HPV45, где рекомбинантный белок L1 продуцируется экспрессией молекулы нуклеиновой кислоты по п.1 в дрожжевой клетке.

7. Способ получения вирусоподобных частиц (VLP) HPV45, включающий: (а) трансформирование дрожжевой клетки молекулой нуклеиновой кислоты по п.1;
(b) культивирование трансформированной дрожжевой клетки в условиях, которые делают возможной экспрессию кодон-оптимизированной молекулы нуклеиновой кислоты с получением рекомбинантного белка вируса папилломы; и
(c) выделение рекомбинантного белка вируса папилломы для получения VLP HPV45.

8. Способ по п.1, в котором дрожжевая клетка выбрана из группы, состоящей из Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, и Schizosaccharomyces pombe.

9. Способ по п.8, в котором дрожжевая клетка представляет собой Saccharomyces cerevisiae.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2009 года RU2360001C2

US 2003096259, 22.05.2003
US 6602697, 05.08.2003
US 2002168372, 14.11.2002.

RU 2 360 001 C2

Авторы

Брайан Джанин Т.

Браунлоу Мишелл К.

Шультц Лорен Д.

Янсен Катрин У.

Даты

2009-06-27Публикация

2004-09-24Подача