СПОСОБ ОЧИСТКИ НЕБЕЛКОВЫХ АНТИГЕНОВ ФАСЦИОЛ Российский патент 2012 года по МПК C08B37/00 G01N30/00 A61K31/715 

Изобретение относится к области биохимии, ветеринарии и медицины, в частности, к получению иммунологически активных материалов из гельминтов, конкретно, из печеночных сосальщиков - фасциол.

Известны способы получения небелковых антигенов фасциол путем экстрагирования 20% раствором сульфосалициловой кислоты [1] или 10% раствором трихлоруксусной кислоты [2], в результате чего белки исходного материала выпадают в осадок, а в надосадочной жидкости остается в растворенном состоянии антигенный материал небелковой природы.

Недостатком этих способов является то, что, кроме небелковых антигенов, в препарате остаются многие кислоторастворимые как высокомолекулярные, так и низкомолекулярные вещества. Последние удаляются путем диализа вместе с сульфосалициловой или трихлоруксусной (ТХУ) кислотой, но высокомолекулярные вещества, такие как гликоген и некоторые растворимые в ТХУ полипептиды, остаются в составе антигенного препарата [3]. Кроме того, при такой обработке происходит необратимая потеря перспективных в диагностическом отношении белковых антигенов.

Известен способ получения небелковых антигенов, когда белковый экстракт фасциол прежде, чем обрабатывать трихлоруксусной кислотой, подвергают фракционированию на колонке с сефадексом G-200 [3-4], в результате чего небелковые антигены отделяются от белковых антигенов, которые остаются в нативном состоянии и могут быть сохранены для их дальнейшего использования. Одновременно происходит и отделение растворимых в ТХУ низкомолекулярных веществ и крупных полипептидов, размеры молекул которых меньше, чем у большинства белков, и поэтому они выходят из колонки не только позднее небелковых антигенов, но и после белковых антигенов, таким образом, отделяясь от них. Фракции, в которых преципитиновым методом обнаружено несколько антигенных компонентов небелковой природы, объединяют в общий пул и обрабатывают ТХУ для удаления примеси белков. Однако растворимый в ТХУ гликоген оказывается в составе тех же фракций, что и небелковые антигены. Гликоген обусловливает сильную опалесценцию раствора, делая его непрозрачным, а в процессе хранения может выпадать в осадок. Кроме того, присутствие гликогена, являющегося полисахаридом, может исказить результаты при изучении химического состава небелковых (мукополисахаридных) антигенов.

Наиболее близким способом получения небелковых антигенов является фракционирование экстракта фасциол на колонке с сефарозой 6В. В отличие от сефадекса G-200 на сефарозе 6В коэффициенты распределения (К av) гликогена и небелковых антигенов оказались различными (соответственно 0 и 0,27), что способствовало их разделению [4]. При этом одновременно отделялись и белковые антигены, и кислоторастворимые полипептиды, и всевозможные низкомолекулярные вещества. Примесь белков во фракциях, содержавших небелковые антигены, удаляли обработкой 10% раствором ТХУ.

Недостатком этого способа является использование сефарозы, одного из гелей, применяемых в стандартной хроматографии, при которой необходима предварительная обработка геля, его упаковка в колонку и последующее длительное промывание колонки, а также длительность самого хроматографического процесса при фракционировании исходного материала (около 2 суток с момента внесения образца до выхода последних фракций).

Целью данного изобретения является очистка небелковых антигенов фасциол на более современном методологическом уровне, ускоряющем и упрощающем хроматографический процесс.

Поставленная цель достигается тем, что вместо стандартной хроматографии на сефарозе 6В, применяется хроматография высокого давления с использованием готовой колонки, заполненной гелем на предприятии-изготовителе и эксплуатируемой без переупаковки. В частности, экстракт фасциол фракционируют на колонке HR 10/30 с суперозой 6 в комплектации хроматографической системы FPLC, в результате чего небелковые антигены отделяются менее чем за час не только от белковых антигенов, кислоторастворимых полипептидов и низкомолекулярных веществ, но и от гликогена, причем последний отделяется еще эффективнее, чем на сефарозе 6В.

Примеры конкретного исполнения

Пример 1. Взрослых Fasciola hepatica, собранных из желчных протоков при убое зараженного скота, свежих или замороженных, гомогенизируют в блендере разных конструкций на холоде (+4°C) при соотношении веса фасциол и объема буферного раствора 1:1 с добавлением в качестве детергента охлажденного эфира. Можно использовать неионный детергент тритон Х-100. Используются различные буферные растворы, обеспечивающие величину pH 7-8 (например, 1/15 М фосфатный буфер или 0,05 М трис-HCl-буфер).

Полученный гомогенат центрифугируют 20 минут на рефрижераторной центрифуге (+4°C) при 10 000 об/мин. Супернатант, представляющий собой тотальный белковый экстракт, отделяют от осадка и фракционируют методом гель-фильтрации на колонке HR 10/30 с суперозой 6 в хроматографической системе FPLC шведской фирмы Pharmacia - LKB при скорости потока 0,5 мл/мин. Объем образца - 500 мкл (0,5 мл). Сбор фракций по 1 мл в 2-минутные интервалы времени.

Результаты фракционирования представлены на графиках (фиг.1), вычерченных одновременно рекордером (верхний график) и принтером-плоттером с нумерацией фракций и пиков (нижний черный график). По горизонтали обозначены номера фракций, а по вертикали - величина оптической плотности при длине волны 280 нм в процентах.

На фиг.2 представлены результаты иммунологического анализа фракций №№8-25 реакцией диффузионной преципитации в агаровом геле. Фракции до №8 и после №25 преципитирующих антигенов заведомо не содержат.

Для проведения реакции использовали штамп "семерка", периферические лунки которого заполняли образцами анализируемых фракций, а центральные лунки - соответствующими референс-сыворотками, полученными от экспериментально зараженных животных. Сыворотка А содержит антитела к небелковым антигенам, сыворотка В - к высокомолекулярным белковым антигенам, сыворотка С - к белковым антигенам невысокого молекулярного веса, основным компонентом которых является антиген с молекулярной массой 28 kD, обладающий протеолитической активностью.

Небелковые антигены обнаружены во фракциях №№14-15 (пик 2), высокомолекулярные белковые антигены - во фракциях №№17-18 (пик 3) и антиген-протеиназа - во фракциях №№17-19 (пики 3-4). Растворимые в ТХУ полипептиды и низкомолекулярные вещества распределяются во фракциях, относящихся к последующим пикам. Гликоген как самое высокомолекулярное вещество оказывается во фракциях №№8-9 (пик 1). Он, если судить по расстоянию между пиками 1 и 2, отделяется от небелковых антигенов эффективнее, чем на сефарозе 6В (прототип).

Присутствие гликогена во фракциях определяли добавлением к исследуемой пробе одной капли раствора Люголя (раствор йода в насыщенном растворе йодистого калия), дающего кирпично-красное окрашивание, тогда как контрольные пробы, не содержащие гликогена, дают очень слабую желтоватую окраску, обусловленную присутствующим в растворе йодом. При добавлении раствора Люголя фракции №№8-9 (пик 1) давали ярко выраженное специфическое окрашивание (кирпично-красное). В остальных фракциях, в том числе и во фракциях, содержавших небелковые антигены (пик 2), окрашивание не отличалось от окраски контрольных проб.

Гликоген, присутствующий во фракциях, сильно опалесцирует и делает их непрозрачными, что обусловливает оптическую плотность раствора и образование пика на графике не только при 280 нм, но и при других длинах волн.

Несмотря на то что при фракционировании экстракта на суперозе 6 примесь белков в составе небелковых антигенов больше, чем в прототипе, эта примесь независимо от ее количества легко удаляется при обработке ТХУ - процедуре, неизбежной в обоих случаях.

Как видно из результатов фракционирования экстракта на суперозе 6 и последующего иммунологического анализа фракций, белковые антигены высокого и невысокого молекулярного веса хорошо отделяются от небелковых антигенов, но между собой белковые антигены перекрываются и, следовательно, данный гель для их разделения не подходит. Для их очистки лучше использовать другой гель - суперозу 12 (см. заявку №2008132753/13 (041091) от 8.08.2008 г.).

Фракции, в которых обнаружены небелковые антигены (№№14-15, пик 2), объединяют в пул и обрабатывают равным объемом 10% раствора ТХУ для удаления примеси балластных белков, неактивных в преципитиновых тестах. Оптическая плотность пика 2 обусловлена именно их присутствием. Небелковые антигены при длине волны 280 нм свет не поглощают.

Осадок, образовавшийся после обработки ТХУ, отделяют центрифугированием при режиме, описанном выше, а кислоту удаляют посредством диализа против буфера с pH 7 - 8. Вместо диализа можно использовать гель-фильтрацию на сефадексе G-25 или G-50 или их аналогах.

Пример 2. Тотальный белковый экстракт получают из фасциол вида F.gigantica. Параметры выделения небелковых антигенов - те же, что и в примере 1. Антигенные компоненты очищенного препарата показывают частичную иммунологическую идентичность с соответствующими антигенами F.hepatica.

В результате вышеописанных процедур получается препарат небелковых антигенов, свободный не только от примеси белков, но и от всех растворимых в ТХУ веществ, присутствовавших в исходных материалах.

Освобождение небелковых антигенов от многих кислоторастворимых примесей, в том числе и от гликогена - самого высокомолекулярного компонента экстракта фасциол, - повышает чистоту препарата, придавая ему прозрачность и облегчая последующий анализ химического состава и структуры антигенов.

Небелковые антигены фасциол могут быть использованы для диагностики ранних стадий фасциолеза, поскольку в динамике фасциолезной инвазии антитела к этим антигенам появляются первыми. Их максимум соответствует стадии миграции личинок [4], когда овоскопическая диагностика неэффективна.

Сложность и неопределенность состава неочищенных антигенных препаратов может оказывать отрицательное влияние на их диагностическую эффективность. Поэтому их охарактеризованность и отсутствие примесей - одно из требований, предъявляемых к иммунологически активным материалам.

Источники информации

1. Szaflarsky J., Dudziak Z., Kapp Z., Szurman J. Beitrag zur Antigenstruktur von Fasciola hepatica. XVII Welt-Tierärtzekongress. Hannover, 1963, 787-789.

2. Sewell M. M. H. The immunology of fascioliasis. Quantitative studies on the precipition reaction. Immunology, 1964, v.7, №6, 671-680.

3. Клименко В.В. Разделение и характеристика функциональных антигенов Fasciola hepatica и Fasciola gigantica. Тр. Всес. ин-та гельминтол., 1971, т.18, 129-143.

4. Клименко В.В. Сочетание фракционирования антигенов фасциол на гелях сефадекса и сефарозы, их физико-химические и иммунологические свойства. Тр. Всес. ин-та гельминтол, 1984, т.27, 67-79 (прототип).

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу очистки небелковых антигенов фасциол. Способ предусматривает фракционирование белкового экстракта фасциол с использованием хроматографических методов. Проводят обработку трихлоруксусной кислотой пула фракций, в которых обнаружены небелковые антигены. Используют хроматографию высокого давления на колонке HR 10/30 с суперозой 6 в хроматографической системе FPLC. Предложенное изобретение позволяет быстро получать очищенные небелковые антигены фасциол. 2 ил., 2 пр.

Способ очистки небелковых антигенов фасциол, включающий фракционирование белкового экстракта фасциол с использованием хроматографических методов и последующую обработку трихлоруксусной кислотой пула фракций, в которых обнаружены небелковые антигены, отличающийся тем, что используют хроматографию высокого давления на колонке HR 10/30 с суперозой 6 в хроматографической системе FPLC.