СПОСОБ ОЧИСТКИ ГРУППЫ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ БЕЛКОВЫХ АНТИГЕНОВ ФАСЦИОЛ Российский патент 2011 года по МПК C07K1/16 C07K14/435 A61K39/00 

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, а более конкретно - к получению диагностических антигенных препаратов из гельминтов, в частности - из фасциол.

Известны способы получения из фасциол суммарных антигенных материалов в виде белковых экстрактов или секреторно-экскреторных продуктов этих паразитов, которые включают массу иммунологически активных компонентов, не равнозначных по своей диагностической эффективности (3-5, 7).

Известны способы получения отдельных диагностически ценных антигенных компонентов фасциол путем освобождения экстрактов от неспецифических примесей. Однако физико-химические характеристики выделенных антигенных компонентов не соответствуют параметрам группы высокомолекулярных белковых антигенов. Это другие вещества (2, 6, 8, 9).

Наиболее близким прототипом является способ фракционирования белковых экстрактов фасциол на сефадексе G-200 или сефарозе 6В (1), позволяющий в процессе одного хроматографического опыта разделить многочисленные антигены фасциол на 3 группы, каждая из которых включает, помимо балластных веществ, по несколько антигенных компонентов, обладающих диагностической ценностью:

1) высокомолекулярные небелковые антигены, растворимые в трихлоруксусной кислоте (мукополисахариды);

2) высокомолекулярные белковые антигены;

3) белковые антигены относительно невысокого молекулярного веса, основным компонентом которых является антиген с молекулярной массой около 28kD, обладающий протеолитической активностью (кислая протеиназа - гемоглобиназа).

Недостатком группы высокомолекулярных белковых антигенов, полученной на сефадексе G-200 или сефарозе 6В, является то, что она в отличие от мукоидов и протеиназы дополнительной очистке не подвергалась и представляет собой гетерогенную белковую смесь, включающую, кроме нескольких преципитирующих антигенных компонентов, многие балластные белки, в том числе и белки хозяина, а также небольшие примеси мукоидов и протеиназы.

Целью данного изобретения является повышение степени очистки группы высокомолекулярных белковых антигенов двух видов фасциол (Fasciola hepatica и Fasciola gigantica).

Поставленная цель достигается тем, что проводят хроматографическое фракционирование полученного из фасциол белкового экстракта на суперозе 12 с последующей рехроматографией на той же колонке пула фракций, в которых обнаружена активность высокомолекулярных белковых антигенов.

Примеры конкретного исполнения

Пример 1. Взрослых паразитов вида F.hepatica, собранных из желчных протоков при убое зараженного скота, свежих или замороженных, гомогенизируют в блендерах разных конструкций на холоде при соотношении веса фасциол и объема буферного раствора 1:1 с добавлением охлажденного эфира. Можно использовать любой буферный раствор, обеспечивающий величину рН 7-8. В качестве детергента, вместо эфира, можно использовать неионный детергент тритон Х-100.

Полученный гомогенат центрифугируют 20 минут на рефрижераторной центрифуге (+4°С) при 10000 об/мин. Супернатант, представляющий собой тотальный белковый экстракт, отделяют от осадка и фракционируют методом гель-фильтрации на колонке HR 10/30 с суперозой 12 в хроматографической системе FPLC шведской фирмы Pharmacia

- LKB при скорости потока 0,5 мл/мин. Максимальный объем образца - 500 µl. Сбор фракций по 1 мл в 2-минутные интервалы времени.

Результаты фракционирования экстракта представлены на фиг.1 (верхний график), где по горизонтали обозначены номера фракций, а по вертикали - оптическая плотность в процентах при длине волны 280 нм. График вычерчен плоттером на термической бумаге при чувствительности монитора 0,1.

На фиг.2 (верхний снимок) представлены результаты иммунологического анализа фракций №№7-18 реакцией диффузионной преципитации в агаровом геле. Использовали штамп "семерка", периферические лунки которого заполняли образцами фракций, а центральные лунки - соответствующими референс-сыворотками. Сыворотка А содержит антитела к группе мукоидных антигенов. Сыворотка В реагирует с высокомолекулярными белковыми антигенами, а сыворотка С - с антигеном-протеиназой.

Активность основного антигенного компонента группы высокомолекулярных белковых антигенов в виде единственной полосы преципитации обнаружена во фракциях №№10-11, тогда как мукоиды попадают во фракции №№7-8, а протеиназа

- во фракции №№13-16. Антигенные фракции в соответствии с их специфической активностью были объединены в 3 пула (мукоиды, высокомолекулярные белковые антигены и антиген-протеиназа).

При фракционировании экстракта с 5-кратно большей концентрацией антигенного материала в элюате, вытекающем из колонки, удается обнаружить не один, а до 4 антигенных компонентов группы высокомолекулярных белковых антигенов (2 основных и 2 минорных), которые распределяются во фракциях №№10-12 с максимальной активностью во фракции №11 (фиг.2, штамп В внизу).

Таким образом, на суперозе 12 происходит разделение антигенов фасциол на 3 группы, в которых в отличие от разделения на сефадексе G-200 или сефарозе 6В препипитиновые реакции не показали взаимных примесей. Однако эти примеси и примеси других белков в полученном препарате высокомолекулярных белковых антигенов были обнаружены иммуноблоттингом (фиг.3), где под номером 1 представлен анализ исходного экстракта, под номером 2 - препарат мукоидных антигенов (сами мукоиды, ввиду их незаряженности в данных условиях опыта, не видны, а видны лишь примеси), под номером 3 представлены результаты иммуноблоттинга высокомолекулярных белковых антигенов, где присутствует примесь протеиназы и других белков, под номером 4 представлены результаты иммуноблоттинга препарата протеиназы с примесями.

На графике фракционирования экстракта (фиг.1, вверху) группа высокомолекулярных белковых антигенов (фракции 10-11) соответствует пику 2, на долю которого приходится около 7% белка исходного экстракта.

Хроматографический анализ продукта, полученного после первого разделения (пул фракций №№10-11) показал его гетерогенность, выражающуюся в множественности пиков (фиг.1, средний график). Здесь на долю пика 2, соответствующего высокомолекулярным белковым антигенам (фракции 10-12), приходится около 33% белка фракционируемого образца.

Проведение второго этапа (рехроматография на той же колонке с суперозой 12 пула фракций №№10-11, полученных при первом разделении) показало отделение многих белков в виде отдельных пиков (фиг.1, график посередине). Большинство фракций, как ненужные примеси, было отброшены, а оставшийся продукт (пул фракций 10-12, в которые попали высокомолекулярные белковые антигены) при третьем разделении не показал примесей и дал единственный пик (фиг.1, нижний график), на долю которого приходится около 98% белка фракционируемого образца. Удаление примесей других антигенных компонентов показал иммуноблоттинг (фиг.3, номер 5). Следовательно, в третьем разделении нет необходимости.

Таким образом, проведение второго разделения оказалось достаточным и полученный при этом препарат высокомолекулярных белковых антигенов (фракции №№10-12) не содержал антигенов смежных групп - мукоидов и протеиназы.

Параметры фракционирования на суперозе 12 при скорости потока 0,5 мл/мин для группы высокомолекулярных белковых антигенов фасциол на конечном этапе: Retention - 20,02 min Duration - 7,28 min Accumulated Area (AA) - 98,3%, Max tube - 11 (при min/ mark-2,0).

Хроматографический анализ исходного экстракта с множеством пиков и конечного продукта в виде единственного пика представлен на фиг.4. Графики вычерчены рекордером и относятся к тем же опытам, что и на фиг.1. Помеченный стрелкой пик соответствует группе высокомолекулярных белковых антигенов.

В очищенном препарате преципитиновым методом обнаружено два основных и два минорных антигенных компонента. Методом электрофореза в денатурирующей системе с последующим иммуноблоттингом установлено, что молекулярная масса основных антигенных компонентов близка к молекулярной массе сывороточного альбумина (68 kD).

Пример 2. Тотальный белковый экстракт получают из фасциол вида F. gigantica. Параметры выделения группы высокомолекулярных белковых антигенов из этого вида фасциол те же, что и в примере 1. Антигенные компоненты очищенного препарата в реакции диффузионной преципитации показывают иммунологическую идентичность с соответствующими компонентами F. hepatica.

Полученные препараты высокомолекулярных белковых антигенов двух видов фасциол могут быть использованы в качестве диагностикумов, а также для изучения молекулярных основ иммунологического родства и видовых различий в антигенах разного происхождения.

Источники информации

1. Клименко В.В. Сочетание фракционирования антигенов фасциол на гелях сефадекса и сефароза, их физико-химические и иммунологические свойства. Тр. Всес. ин-та гельминтол. 1984, т.27, c.67-79.

2. Клименко В.В. Очистка главного антигенного компонента Fasciola hepatica и его функция в организме этого гельминта. Тр. Всес. ин-та гельминтол. 1992, т.31, c.59-73.

3. Ambroise-Thomas P., Desgeorges P.T., Bouttaz M. Le diagnostic immunoenzymologique (ELISA) de la fasciolose humaine et bovine. Detection d'anticorps et/or d'antigens circulans. Ann. Soc. beige Med. trop., 1980, 60, 47-60.

4. Espino Ana M., Dumenigo Blanca E., Femandez Roberto, Finlay Carlos M. Immunodiagnosis of human fascioliasis by enzyme-linked immunosorbent assay using excretory-secretory products. Am. J. Trop.Med. Hyg. 1987, 37, №3, 605-608.

5. Farrell С.J., Shen D.Т., Wescott R.В., Lang B.Z. An enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis on Fasciola hepatica in cattle. Am. J. Vet. Res. 1981, 42, 237-240.

6. Geyer E. Darstellung und Charakterisierung eines Fasciola hepatica-Totalhomogenatextrakt-Antigens. Z. Parasitenkunde, 1969, 33, №2, 135-163.

7. Speiser F., Weiss N. Comparative evaluation of 7 helminth antigens in the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Experientia, 1979, 35, 1512-1593.

8. Tailliez R., Korach S. Les antigenes de Fasciola hepatica. 1. Isolement et characterization d'un antigene specifique du genre. Ann. Inst. Pasteur, 1970, 118, №1, 61-78.

9. Zimmerman G.L., Clark С.R.В. Separation of parasite antigens by molecular exclusion, anion exchange and chromatofocusing utilizing FPLC-protein fraction systems. Veter. Parasitol., 1986, 20, №1-3, 217-228.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу очистки группы высокомолекулярных белковых антигенов фасциол. Очистку высокомолекулярных белковых антигенов фасциол проводят с использованием высокоэффективной хроматографии. Причем белковые экстракты фасциол (F.hepatica и F.gigantica) фракционируют гель-фильтрацией экстракта на колонке HR 10/30 с суперозой 12. После чего полученный при первом фракционировании пул фракций, в которых обнаружены высокомолекулярные белковые антигены, повторно хроматографируют на колонке с тем же сорбентом. Антигенную активность фракций определяют реакцией диффузионной преципитации в агаровом геле с использованием трех типов сывороток, содержащих антитела к разным антигенным компонентам фасциол. Полученный данным способом продукт может быть использован в качестве диагностикума, а также для изучения молекулярных основ иммунологического родства и видовых различий в антигенах разного происхождения. Предложенное изобретение позволяет повысить степень очистки группы высокомолекулярных белковых антигенов двух видов фасциол (F.hepatica и F.gigantica). 4 ил.

Способ очистки группы высокомолекулярных белковых антигенов фасциол, включающий фракционирование тотального белкового экстракта фасциол с использованием хроматографических методов, отличающийся тем, что проводят гель-фильтрацию экстракта на колонке HR 10/30 с суперозой 12, а полученный при этом пул фракций, в которых обнаружены высокомолекулярные белковые антигены, повторно хроматографируют на колонке с тем же сорбентом.