СПОСОБ ОЦЕНКИ СОВМЕСТНОГО ДЕЙСТВИЯ ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ И ИНТЕРЛЕЙКИНА-7 НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОЗРЕВАНИЕ Т-ЛИМФОЦИТОВ НОВОРОЖДЕННЫХ Российский патент 2009 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для исследования специфического механизма регуляции созревания Т-лимфоцитов новорожденных гормонами и цитокинами.

Одним из наиболее значимых физиологических регуляторов, подавляющих активность иммунной системы, являются глюкокортикоиды - гормоны коры надпочечников, обладающие выраженными иммуносупрессорными и противовоспалительными свойствами (Ashwell J.D., Lu W.M.L., Vacchio M.C. Glucocorticoids in Т cell development and function. // Annu. Rev. Immunol. - 2000. - Vol.18. - P.309-345). Благодаря этим свойствам препараты глюкокортикоидов широко используются в качестве лекарственных средств, подавляющих нежелательные воспалительные и гипериммунные реакции. Известно, что иммуносупрессорные свойства глюкокортикоидов обусловлены их способностью угнетать функционирование антигенпрезентирующих клеток и Т-лимфоцитов (Bessler H., Kagazanov S., Punsky I., Sirota L. Effect of dexamethasone on IL-10 and IL-12p40 production in newborns and adults. // Biol Neonate. - 2001. - Vol.80 (4). - P.262-266; Bessler H., Straussberg R., Gurary N., Aloni D., Sirota L. Effect of dexamethasone on IL-2 and IL-3 production by mononuclear cells in neonates and adults. // Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. - 1996. - Vol.75(3). - P.197-201; Bessler H., Mendel C., Straussberg R., Gurary N., Aloni D., Sirota L. Effects of dexamethasone on IL-1β, IL-6, and TNF-α production by mononuclear cells of newborns and adults. // Biology of the Neonate. - 1999. - Vol.71. - P.225-233). В частности, глюкокортикоиды подавляют продукцию большинства цитокинов активированными Т-лимфоцитами. В то же время в присутствии некоторых регуляторов иммунной системы, активно продуцирующихся в организме, характер действия глюкокортикоидов может изменяться (Dozmorov I.M., Miller R.A. Generation of antigen-specific Th2 cells from unprimed mice in vitro: effects of dexamethasone and anti-IL-10 antibody. //J. Immunol. - 1998. - Vol.160. - P.2700-2705). Как показали наши исследования, одним из таких регуляторов является интерлейкин-7. Наиболее исследовано физиологическое значение этого цитокина в стимуляции ранних этапов лимфопоэза (Aspinall R. Т cell development, ageing and Interleukin-7. // Mech. Ageing Dev. - 2006. - V.127 (6). - P.572-578), однако в неонатальном периоде он также является важнейшим стимулятором роста Т-лимфоцитов периферического отдела иммунной систиемы (Marchant A., Goldman M. Т cell-mediated immune responses in human newborns: ready to learn? // Clinical end Experimental Immunology. - 2005. - V.141 (1) - P.10-18). Нами показано, что в условиях культуры клеток в присутствии интерлейкина-7 глюкокортикоиды не подавляют, а стимулируют процесс функционального созревания Т-лимфоцитов у новорожденных детей. В результате стимуляция активированных Т-лимфоцитов интерлейкином-7 и глюкокортикоидами (гидрокортизоном или синтетическим лекарственным средством дексаметазоном) приводит к накоплению Т-лимфоцитов, способных продуцировать интерферон-гамма после повторной активации. Одновременно с этим в культуре увеличивается количество Т-лимфоцитов с фенотипом наиболее зрелых клеток периферического отдела иммунной системы (терминально дифференцированных эффекторных Т-клеток памяти). Выявление нового эффекта глюкокортикоидов потребовало разработки метода оценки совместного действия препаратов глюкокортикоидов и интерлейкина-7 на генерацию цитокинопродуцентов для проведения дальнейших фундаментальных и клинических исследований.

Наиболее близким аналогом данного изобретения является метод оценки внутриклеточных цитокинов с использованием стимуляции клеток форбол-12-миристат-13-ацетатом и иономицином и оценкой результатов с помощью лазерной проточной цитометрии (Picker L.J., Singh M.K., Zdraveski Z., et al. Direct demonstration of cytokine synthesis heterogeneity among human memory/effector Т cells by flow cytometry. // Blood. - 1995. - V.86. - P.1408-1419). Метод оценки внутриклеточных цитокинов позволяет оценить количество функционально зрелых клеток-цитокинопродуцентов (в частности, Т-лимфоцитов), имеющееся в кровотоке человека на момент обследования.

Техническое решение предлагаемого изобретения заключается в том, что стимуляцию процесса созревания Т-лимфоцитов в культуре осуществляют глюкокортикоидами и интерлейкином-7 в ходе предварительного культивирования клеток с этими стимуляторами, а результат функционального созревания Т-лимфоцитов определяют по количеству Т-клеток, способных продуцировать интерферон-гамма после повторной краткосрочной активации форбол-12-миристат-13-ацетатом и иономицином. Повторную краткосрочную активацию и детекцию результата с помощью иммунофлюоресцентной окраски и лазерной проточной цитометрии осуществляют по методу оценки внутриклеточных цитокинов, указанному выше в качестве ближайшего аналога. Таким образом, отличие предлагаемого изобретения от аналога заключается в том, что в предлагаемом методе вводят дополнительное предварительное культивирование клеток со специфическими стимуляторами созревания, что позволяет оценить нарастание количества цитокинопродуцентов под действием исследуемых стимуляторов в условиях культуры клеток, т.е. оценить процесс функционального созревания Т-лимфоцитов.

Осуществление изобретения

Метод требует стерильных условий работы. Используется стандартное оборудование иммунологической лаборатории, помещение или бокс для стерильных работ, лазерный проточный цитофлюориметр.

Реагенты:

1. Среда для культур клеток ДМЕМ («Биолот» Санкт-Петербург). Peг. удостоверение №Р №002346/01-2003 от 08.04.2003.

2. Сыворотка эмбрионов коров стерильная («Биолот» Санкт-Петербург). Рег. удостоверение №Р №002358/01-2003 от 09.04.2003.

3. Дексаметазона фосфат, раствор для инъекций (KRKA, Словения). Номер и дата регистрации лекарственного средства №012237/01-2000, 15.09.2000.

4. Моноклональные антитела «Клоноспектр»: меченные флюоресцеинизотиоционатом моноклональные антитела к молекуле CD7 «Клоноспектр IСО-87-ФИТЦ», стерильный раствор очищенных моноклональных антител к молекуле CD3 «Клоноспектр ICO-90» без консервантов («Медбиоспектр», Москва). Рег. удостоверение набора моноклональных антител «Клоноспектр» №ФС012а2013/1866-05 от 30.06.2005.

5. Рекомбинантный человеческий интерлейкин-7 (Sigma chemical С°, St. Louis, МО, США кат. №I 5896) - стандартный реагент для иммунологических исследований.

6. Форбол-12-миристат-13-ацетат (Sigma chemical C°, St. Louis, МО, США кат. №Р 8139) - стандартный реагент для иммунологических исследований.

7. Иономицин (Sigma chemical C°, St. Louis, МО, США кат. №I 0634) - стандартный реагент для иммунологических исследований.

8. Моноклональные антитела к человеческому гамма-интерферону Fast-Immune Anti-Hu-INF gamma/PE (BD Biosciences Immunocytometry systems, США), стандартный реагент для иммунологических исследований.

9. Реагент GolgiPlug (BD Biosciences Immunocytometry systems, США), стандартный реагент для иммунологических исследований.

Метод осуществляют следующим образом.

Заранее подготавливают следующие рабочие растворы используемых реагентов на стерильной среде для культур клеток ДМЕМ с 10% эмбриональной телячьей сыворотки:

1) раствор моноклональных антител «Клоноспектр ICO-90» с концентрацией 2 мкг/мл;

2) раствор рекомбинанатного человеческого интерлейкина-7 с концентрацией 200 нг/мл;

3) раствор фосфата дексаметазона с концентрацией 8 мкг/мл.

Приготовленные растворы моноклональных антител «Клоноспектр ICO -90» и дексаметазона хранят при +4°С в течение срока хранения препарата, указанного производителем. Раствор интерлейкина-7 хранят при +4°С не более 2-х недель или замороженным при -20°С в течение срока хранения препарата, указанного производителем. После размораживания раствора интерлейкина-7 повторное замораживание не допускается, поэтому перед замораживанием готовый раствор целесообразно в стерильных условиях разделить на аликвоты, объем которых зависит от планов исследования.

Из плацентарного отрезка пуповины после ее рассечения производят стерильный забор 10 мл пуповинной крови во флакон с раствором гепарина традиционным способом. Взятая проба крови может храниться не более 4 часов при +4°С. Мононуклеарные клетки из пробы крови выделяют традиционным способом над слоем фиколл-верографина, фиколл-пака или гистопака с плотностью 1,077 г/мл в стерильных условиях.

Выделенные мононуклеарные клетки дважды отмывают средой для культур клеток ДМЕМ, осаждая клетки центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 мин. Перед вторым центрифугированием количество клеток подсчитывают в камере Горяева. После центрифугирования готовят суспензию клеток, содержащую 10⁶ клеток в мл среды ДМЕМ с 10% эмбриональной телячьей сыворотки.

Суспензию клеток по 1 мл вносят в стерильные стеклянные флаконы или в лунки 24-луночных планшетов для культур клеток. В один флакон (или лунку) не вносят дополнительных реагентов. Эта микрокультура служит негативным контролем. В следующую микрокультуру вносят 50 мкл раствора моноклональных антител «Клоноспектр ICO-90» с концентрацией 2 мкг/мл для активации Т-лимфоцитов через молекулу CD3. Данный способ активации моделирует в поликлональном варианте активацию клеток антигеном при иммунном ответе. В следующую микрокультуру вносят 50 мкл раствора антител «Клоноспектр ICO-90» и 50 мкл раствора фостфата дексаметазона с концентрацией 8 мкг/мл. В следующую микрокультуру вместе с 50 мкл раствора антител «Клоноспектр ICO-90» вносят 50 мкл раствора рекомбинантного человеческого интерлейкина-7 с концентрацией 200 нг/мл. Эта проба служит контролем созревания активированных Т-клеток в присутствии интерлейкина-7. В следующую микрокультуру вносят по 50 мкл раствора антител «Клоноспектр ICO-90», раствора интерлейкина-7 и раствора фостфата дексаметазона.

Засеянные культуры инкубируют при 37°С в атмосфере с 5% CO₂ (в CO₂-инкубаторе или в эксикаторе со свечой) в течение 68 часов. Затем клетки собирают пипетированием, осаждают центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 мин и осадок клеток каждой микрокультуры ресуспендируют в 1 мл среды ДМЕМ с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 25 нг/мл форбол-12-миристат-13-ацетата, 1 мкг/мл иономицина и с реагентом GolgiPlug (1 мкл реагента GolgiPlug на 1 мл среды добавляют в среду непосредственно перед использованием). Реагент GolgiPlug блокирует секрецию цитокинов и других секретируемых белков, что приводит к их накоплению в клетках, что облегчает их детекцию. Полученную суспензию клеток в наклонно поставленных центрифужных пробирках, закрытых ватно-марлевыми тампонами, инкубируют еще 4 часа при 37°С в атмосфере с 5% СО₂.

Затем клетки собирают центрифугированием и проводят пробоподготовку и окрашивание накопившегося внутри клеток гамма-интерферона по методу оценки внутриклеточных цитокинов согласно инструкции производителей моноклональных антител к человеческому гамма-интерферону Fast-Immune Anti-Hu-INF gamma/PE (BD Biosciences Immunocytometry systems, США). Для этого клетки фиксируют параформальдегидом, пермеабилизируют мембрану сапонином и содержащийся внутри клеток интерферон окрашивают антителами Fast-Immune Anti-Hu-INF gamma/PE. Одновременно с добавлением антител к интерферону к клеткам добавляют антитела к мембранным молекулам, маркирующим Т-клетки или их субпопуляции. Мы рекомендуем в качестве Т-клеточного маркера использовать молекулу CD7, поскольку эта молекула хорошо сохраняется на мембране Т-клеток при активации и культивировании. Для выявления CD7 рекомендуется использовать антитела «Клоноспектр ICO-87-ФИТЦ» («Медбиоспектр», Москва) или их аналоги (меченные ФИТЦ антитела к CD7 человека фирм «Сорбент», Москва или BD Biosciences Immunocytometry systems, США) в концентрации, указанной производителем. Полученные образцы окрашенных клеток анализируют на лазерном проточном цитофлюориметре согласно инструкции производителя прибора.

При анализе результатов выполняют следующие действия:

1) выделяют лимфоциты в гейт по прямому и боковому светорассеиванию (на графике DotPlot в шкалах FSC/SSC),

2) оценивают флюоресценцию выделенных в гейт лимфоцитов на графике DotPlot или Contur со шкалами FL1-H (окрашивание маркера Т-лимфоцитов CD7) и по шкале FL2-H (окрашивание интерферона-гамма). Результаты выражают как процент продуцирующих интерферон-гамма Т-лимфоцитов от всех лимфоцитов.

Анализ результатов

Индекс совместного действия дексаметазона и интерлейкина-7 высчитывают как отношение количества Т-клеток, продуцирующих интерферон в культурах с добавлением антител «Клоноспектр ICO-90», интерлейкина-7 и дексаметазона, к количеству продуцентов интерферона в культурах с антителами «Клоноспектр ICO-90» и интрлейкином-7 без дексаметазона. Значение индекса более 1,0 свидетельствует о стимуляции функционального созревания Т-лимфоцитов под действием дексаметазона в сочетании с интерлейкином-7.

Пример 1

Пациент М. Новорожденный с нормальным сроком внутриутробного развития (40 нед.), практически здоров. Мононуклеарные клетки пуповинной крови исследовали согласно описанной выше методике. На фиг.1 представлено графическое отражение типичного результата анализа действия глюкокортикоида дексаметазона и интерлейкина-7 на лимфоциты новорожденного. На графиках показан результат окрашивания Т-клеточного маркера CD7 и накопившегося внутри клеток интерферона-гамма. CD7⁺Т-лимфоциты расположены справа от вертикальной линии. Продуцирующие интерферон Т-лимфоциты расположены над горизонтальной чертой. Процент CD7⁺ интepфepoн-гaммa⁺ клеток отмечен на каждом графике. Как следует из фиг.1, в культуре клеток крови ребенка, росшей первые 68 часов в присутствии активирующих антител «Клоноспектр ICO-90», интерферон способны продуцировать лишь 10,1% лимфоцитов. Дексаметазон в отсутствие интерлейкина-7 снижает количество продуцентов интерферона, интерлейкин-7 - незначительно увеличивает их количество. Однако сочетанное действие дексаметазона и интерлейкина-7 на активированные Т-лимфоциты приводит к значительному накоплению продуцентов интерферона в культуре. После воздействия этих факторов 43,8% лимфоцитов приобретают способность продуцировать гамма-интерферон. Индекс совместного действия дексаметазона и интерлейкитна-7 равняется 2,64.

Пример 2

Пациентка В. Практически здоровый взрослый донор. Мононуклеарные клетки венозной крови исследовали согласно описанной выше методике. В культуре клеток крови взрослого, росшей первые 68 часов в присутствии активирующих антител «Клоноспектр ICO-90», интерферон способны продуцировать 38,5% лимфоцитов. Дексаметазон в отсутствие интерлейкина-7 снижает количество продуцентов интерферона до 27,6%. Интерлейкин-7 без дексаметазона и интерлейкин-7 вместе с дексаметазоном практически не влияют на количество продуцентов интерферона-гамма (38,3% и 35,4% CD7⁺ интepфepoн-гaммa⁺ клеток соответственно). Индекс совместного действия дексаметазона и интерлейкитна-7 равняется 0,92.

Метод апробирован при исследовании действия дексаметазона на клетки 48 проб крови практически здоровых новорожденных и 35 взрослых практически здоровых доноров, а также при исследовании действия водорастворимого препарата гидрокортизона (Sigma, США) на клетки 22 проб крови практически здоровых новорожденных и 10 взрослых практически здоровых доноров. Добавление дексаметазона уменьшало количество продуцирующих интерферон-гамма Т-клеток во всех исследованных пробах клеток крови детей и взрослых. Добавление дексаметазона в культуры клеток, активированных антителами «Клоноспектр ICO-90» вместе с интерлейкином-7, приводило к увеличению количества продуцирующих интерферон Т-клеток у 45 из 48 обследованных новорожденных. Средний индекс совместного действия дексаметазона и интерлейкина-7 на Т-клетки новорожденных составил 4,27±1,17. В культурах клеток взрослых нами не было обнаружено усиления созревания интерферонопродуцентов, вызванного совместным действием дексаметазона и интерлейкина-7. Средний индекс совместного действия дексаметазона и интерлейкина-7 на Т-клетки взрослых составил 0,89±0,23. Водорастворимый гидрокортизон оказывал аналогичное, но менее выраженное действие. Усиление созревания продуцентов интерферона в культурах клеток новорожденных под действием гидрокортизона и интерлейкина-7 обнаружено у 17 из 22 обследованных детей. Средний индекс совместного действия гидрокортизона и интерлейкина-7 на Т-клетки новорожденных составил 2,53±0,67. Гидрокортизон, так же как и дексаметазон, не стимулировал созревание продуцентов интерферона в культурах клеток взрослых. Средний индекс совместного действия гидрокортизона и интерлейкина-7 на Т-клетки взрослых составил 0,92±0,32.

Полученные с помощью описанного выше метода результаты исследования влияния глюкокортикоидов на созревание цитокинопродуцентов были подтверждены с помощью определения секреции интерферона-гамма Т-клетками в культуральную среду. Для этого клетки инкубировали 68 часов с активирующими антителами «Клоноспектр ICO-90», интерлейкином-7 и дексаметазоном, как это предусмотрено настоящим методом. Затем клетки культивировали 24 часа в среде с форболмиристатацетатом и иономицином, но без GolgiPlug, для того чтобы интерферон беспрепятственно секретировался в среду культур клеток. После инкубирования среду из культур собирали и оценивали в ней концентрацию интерферона-гамма с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. Результаты исследования представлены на фиг.2. Как видно из фиг.2, концентрация интерферона у новорожденных детей была наибольшей в культурах клеток, росших первые 68 часов в присутствии сочетания активирующих антител «Клоноспектр ICO-90», интерлейкина-7 и дексаметазона. Однако различия, выявленные с помощью определения концентрации интерферона иммуноферментным анализом, были менее выражены, чем при оценке количества клеток-продуцентов с помощью описанного выше метода. В культурах клеток крови взрослых дексаметазон подавлял продукцию интерферона до уровня значений контрольных, неактивированных культур. Стимулирующего эффекта сочетания дексаметазона и интерлейкина-7 в культурах клеток взрослых обнаружено не было.

Факт созревания Т-лимфоцитов детей под действием глюкокортикоидов и интерлейкина-7 также подтверждается результатами исследований фенотипических изменений лимфоцитов при различных условиях стимуляции клеток. Трехцветный цитометрический анализ показал, что вызванное дексаметазоном и интерлейкином-7 увеличение количества продуцирующих интерферон-гамма Т-лимфоцитов сопровождается уменьшением содержания в культуре CD7⁺CD45RA⁺CD62L⁺ наивных Т-лимфоцитов, практически полным исчезновением CD7⁺CD45RA^- CD62L⁺ центральных Т-клеток памяти и значительным увеличением доли Т-клеток с фенотипом CD7⁺CD45RA⁺CD62L^-. Данный набор мембранных молекул соответствует фенотипу наиболее зрелых в функциональном отношении Т-лимфоцитов, называемых терминально-дифференцированными эффекторными Т-клетками памяти.

Таким образом, предложенный метод позволяет оценивать совместный эффект действия препаратов глюкокортикоидов и эндогенного регулятора лимфоцитов интерлейкина-7 на созревание продуцентов интерферона-гамма в условиях культуры клеток у различных контингентов обследуемых.

Метод применим в условиях специализированных иммунологических лабораторий НИИ и может быть использован для фундаментальных исследований механизмов регулирования процессов функционального созревания клеток иммунной системы человека, а также для клинико-иммунологических исследований, направленных на оценку распространенности выявляемого предложенным методом типа реагирования Т-лимфоцитов на глюкокортикоиды в различных группах людей, изучения клинического значения стимуляции созревания Т-лимфоцитов глюкокортикоидами, определения роли данной особенности реагирования в формировании чувствительности или резистентности к терапии препаратами глюкокортикоидов.

Метод разработан и апробирован в лаборатории клеточной иммунологии Нижегородского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и применяется в этом институте в научных исследованиях.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. Дексаметазон в присутствии интерлейкина-7 увеличивает количество Т-лимфоцитов продуцентов интерферона-гамма в повторно активированных культурах клеток крови новорожденного ребенка - результат лазерной проточной цитометрии. Клетки культивировались в течение 68 ч со следующими реагентами: антителами к CD3 ICO-90 (А), антителами ICO-90 и интерлейкином-7 (Б), антителами ICO-90 и дексакметазоном (В), антителами ICO-90, дексаметазоном и интерлейкином-7 (Г). Затем в течение 4 ч - с ФМА и иономицином. Пробы окрашены антителами «Клоноспектр ICO-87-ФИТЦ» (по шкале FL1-H) и антителами Fast-Immune Anti-Hu-INF gamma/PE (no шкале FL2-H). В правом верхнем квадранте каждого графика - Т-клетки, продуцирующие интерферон.

Фиг.2. Средняя концентрация интерферона-гамма в среде повторно активированных культур клеток новорожденных детей (А) и взрослых (Б). Клетки культивировались в течение 68 ч без стимуляторов (гистограмма 1), с антителами к CD3 ICO-90 (2), с антителами ICO-90 и дексакметазоном (3), антителами ICO-90 и интерлейкином-7 (4), антителами ICO-90, дексаметазоном и интерлейкином-7 (5). Затем в течение 24 ч клетки культивировали с ФМА и иономицином. По оси абсцисс - концентрация интерферона (пг/мл). Звездочкой отмечено достоверное различие концентрации интерферона в культурах с дексаметазоном и без него (p<0,05).

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и касается способа оценки совместного действия глюкокортикоидов и интрлейкина-7 на функциональное созревание Т-лимфоцитов новорожденных. Способ заключается в стимуляции процесса созревания Т-лимфоцитов в культуре клеток глюкокортикоидами и интерлейкином-7 с последующим определением индекса совместного действия глюкокортикоидов и интерлейкина-7 как отношение количества Т-клеток, продуцирующих интерферон в культурах клеток, в которые добавлены антитела, интерлейкин-7 и глюкокортикоиды, к количеству продуцентов интерферона в культурах клеток, в которые добавлены только антитела и интерлейкин-7, и при значении индекса более 1,0 делают вывод о стимуляции функционального созревания Т-лимфоцитов под действием глюкокортикоидов и интерлейкина-7. Использование способа позволяет проводить фундаментальные и клинические исследования специфических механизмов регуляции созревания Т-лимфоцитов новорожденных. 2 ил.

Способ оценки совместного действия глюкокортикоидов и интерлейкина-7 на функциональное созревание Т-лимфоцитов новорожденных, характеризующийся тем, что глюкокортикоиды вводятся в культуру мононуклеарных клеток пуповинной крови вместе с активирующими через молекулу CD3 Т-клетки антителами и интерлейкином-7, а оценку результата проводят с помощью иммунофлюоресцентного окрашивания внутриклеточного гамма-интерферона; определяют индекс совместного действия глюкокортикоидов и интерлейкина-7, как отношение количества Т-клеток, продуцирующих интерферон в культурах клеток, в которые добавлены антитела, интерлейкин-7 и глюкокортикоиды к количеству продуцентов интерферона в культурах клеток, в которые добавлены только антитела и интерлейкин-7 и при значении индекса более 1,0 делают вывод о стимуляции функционального созревания Т-лимфоцитов под действием глюкокортикоидов и интерлейкина-7.