СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ГРИППА ПУТЕМ СОЧЕТАННОГО ПРИМЕНЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНА ГАММА И ИНАКТИВИРОВАННОЙ ПРОТИВОГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ Российский патент 2015 года по МПК A61K39/145 A61K38/21 A61P31/16 

Данное изобретение относится к способу модуляции иммунного ответа на антиген у взрослых людей. В качестве модулятора применяли препарат интерферон гамма. Способ последовательного введения препаратов контролируемым образом обеспечивает иммунную реакцию на антиген. В результате происходит активация иммунной системы с переключением на клеточный тип иммунного ответа, а также стимулируется гуморальное звено иммунитета, благодаря чему индуцируется сильный и продолжительный ответ, направленный против вакцинного антигена.

Индукция иммунной реакции на антиген и ее интенсивность зависят от сложного взаимодействия между антигеном, различными типами антигенпрезентирующих и иммунных клеток, а также сложных цитокиновых реакций, модулирующих иммунный ответ. Антигенпрезентирующие клетки, такие как макрофаги и дендритные клетки, после процессинга представляют Т-клеткам антигенные пептиды, а также секретируют дополнительно стимулирующие молекулы.

К антигенам, которые используются для вакцинации, относятся инактивированные вирусы и их компоненты. Качество вакцинации во многом зависит от иммунного статуса человека в момент вакцинации, степени иммунного ответа организма. На ответ могут влиять такие факторы, как генетические особенности, перенесенные инфекционные заболевания, наличие хронической патологии, возраст, стресс.

Не все антигены одинаково иммуногенны, и для слабо иммуногенных антигенов существует несколько альтернативных возможностей увеличить эффективность иммунизации.

С целью повышения готовности к пандемиям гриппа продолжаются интенсивные научные и клинические исследования новых кандидатов в вакцинные штаммы, ведутся поиски перспективных адъювантов, определяются оптимальные схемы и способы введения вакцин. В настоящее время в мире на различных стадиях клинических испытаний находятся более 30 вакцинных кандидатов против высокопатогенных для человека вирусов гриппа, в том числе и вирусов гриппа птиц. Большинство из кандидатов - инактивированные вакцины с традиционным парентеральным способом введения, содержащие в качестве адъюванта соли алюминия.

Американскими исследователями опубликованы результаты исследований иммуногенности вакцины, приготовленной по стандартной процедуре на основе штамма H5N1. Здоровым взрослым в возрасте 18-64 лет двукратно с интервалом в 28 дней вводили в дельтовидную мышцу вакцину в дозах в 90, 45, 15 или 7.5 мкг или плацебо. Предопределенный заранее титр в 1:40 появился только в группе получивших дозу 90 мкг у 54% (95% доверительный интервал 47-67%) по РТГА. РМН в титре 1:20 и выше наблюдалась у 70% в группе получивших дозу 90 мкг и 57% группы получивших дозу 45 мкг, только у 32% группы получивших дозу 15 мкг и у 25% - 7.5 мкг [N.EngI J Med. Mar. 30, 2006 354: 1343-1351].

Таким образом, для повышения иммуногенной активности подобного типа вакцин, необходимо повторное, т.е. двукратное, введение высоких доз антигена, что связано с увеличением числа побочных эффектов при вакцинации и является очень нежелательным явлением при массовой вакцинации для предупреждения эпидемий и, особенно, пандемий [Lancet. 2001 Jim 16; 357(9272): 1937-43.]. Из-за высоких доз вводимых вакцин требуется наработка их в больших количествах, что для промышленного выпуска нагрузочно в период пандемий, а также прививка становится дорогостоящей.

Vogel F. указывал на необходимость применения более эффективных адъювантов в субъединичные инактивированные вакцины для стимуляции клеточного звена иммунитета, что может обеспечить усиление защитного эффекта вакцинации [Clin Infect Dis. 2000 Jun; 30 Suppi 3:S266-70]. Такой подход мог бы способствовать достаточному объему производства вакцин против высокопатогенных вирусов гриппа птичьего происхождения в экстренной ситуации, которая может возникнуть при развитии пандемии, однако пока таких адъювантов не предложено.

Известно, что интерферон гамма (ИНФ-γ), продуцируемый преимущественно Т-хелперами I типа и цитотоксическими лимфоцитами, является как индуктором неспецифической защиты, стимулирующим фагоцитоз, активность нейтрофилов и естественных киллеров, так и мощным иммуностимулятором, регулирующим направление иммунного ответа по клеточному типу, способствуя тем самым формированию клеток памяти [Иммунология. 2002. №2. С.77-80].

Известны некоторые приемы усиления развития иммунного ответа у животных, в частности, в 1989 году американскими авторами Joseph М. Cummins, Amarillo Тех. запатентован способ применения низких доз интерферона альфа (ИНФ-α) у животных для повышения эффективности любой вакцинации [Патент США №. 4 820514].

Известно, что у мышей эффективность сочетанного применения субъединичного противогриппозного вакцинного препарата и цитокина интерферона-гамма в свободном и/или липосомальном виде проявилась в значительном увеличении защитных титров антител [Biochim Biophys Acta. 2001 Mar 30; 1531(1-2): 99-110].

Однако эти исследования не получили развития в профилактике гриппа у людей.

По применению ИНФ-α в качестве адъюванта у людей известен патент: Вакцины, включающие в качестве адъюванта интерферон типа I, и связанные с этим способы [Евразийский патент №006211, 2005]. Применение IFN типа I, т.е. ИНФ-α, для получения нетоксической композиции адьюванта для усиления гуморального иммунного ответа на вакцину при защитной иммунизации in vivo, в котором ИНФ-α применяется в дозировке, большей или равной 100000 ЕД/мл на дозу вакцины. Недостатком данного способа является преимущественная стимуляция только гуморального иммунного ответа, который не является длительным и требует повторных вакцинаций.

Задачей данного изобретения является снижение прививочной дозы антигена при введении гриппозной инактивированной вакцины, переход на однократное введение вакцины, причем с существенным повышением иммуногенности вакцины, с формированием протективного иммунитета, превосходящего иммунный ответ при введении классических гриппозных вакцин.

В качестве цитокина выбрали отечественный препарат рекомбинантного человеческого ИНФ-γ - "Ингарон" (ООО "НПП "Фармаклон"), рекомендованный для лечения инфекционных, вирусных заболеваний: хронических вирусных гепатитов В и С, генитального герпеса, опоясывающего лишая, хламидиоза и для иммунотерапии онкологических заболеваний, а также для профилактики и лечения гриппа, в том числе птичьего происхождения (per. удостоверение №ФС-2006/034 от 05.04.2006 г.).

Выбор ИНФ-γ мог не привести к желаемому результату, т.к. Juan Antonio Quiroga с соавторами в 1990 г. провели клинические исследования применения гамма интерферона в дозе 2 million units/m² в качестве адъюванта для вакцины против гепатита В [Hepatology. - 1990. - Volume 12, Issue 4, pages 661-663]. Однако они не получили достаточного уровня сероконверсий, а также достаточных доказательств механизма формирования поствакцинального иммунитета, т.е. не был достигнут желаемый эффект, несмотря на применение высокой дозы ИНФ-γ.

Сущностью изобретения является последовательное парентеральное введение цитокина, в частности ИНФ-γ, а затем инактивированной вакцины, что способствует поляризации иммунного ответа в сторону Тh1 и является эффективной и рациональной стратегией повышения эффективности иммунизации. Предлагаемый способ модулирования иммунного ответа при сочетанием применении ИНФ-γ с инактивированной субъединичной гриппозной вакциной отличается значительным преимуществом в формировании протективного иммунитета против вируса гриппа: за счет именно такой последовательности введения снижается в 3 раза прививочная доза антигена, особенно это имеет значение при малой иммуногенности вакцинного штамма.

Также за счет такого введения становится возможной однократная вакцинация с повышением иммуногенности и протективной активности вакцины, а также снижается вероятность побочных эффектов.

Такой результат возможен именно из-за схемы введения препаратов, которые вводят в верхнюю треть плеча одной руки, затем в верхнюю треть плеча другой руки.

В связи с тем, что иммунная система каждого индивидуума по-разному отвечает на введение антигена, именно при таком способе применения ИНФ-γ и вакцины становится возможным достижение стандартизации иммунного ответа, что позволяет в равной мере защитить от инфекции как здоровых людей, так и лиц со сниженной иммунореактивностью (часто болеющих, с хронической патологией).

Цель изобретения - гарантированная защита организма человека от гриппозной инфекции с помощью модуляции иммунного ответа на антиген с тем, чтобы увеличить иммуногенность и протективную активность инактивированной вакцины против гриппа. Для проведения сравнительного анализа полученных данных использовались результаты, полученные в ходе проведенного на базе ГУ НИИ гриппа РАМН (в настоящее время ФГУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития России) первой фазы клинического исследования по оценке безопасности и иммуногенности вакцины на основе вакцинного штамма гриппа A(H5N1) (реассортант вирусов А/Вьетнам/1194/2004(H5N1) и A/PR8/34 (H1N1), соотношение генов 2:6, содержит 15 мкг/доза гемагглютинина (ГА)), названной «Орнифлю» при ее двукратном введении здоровым добровольцам. Общая характеристика групп сравнения представлена в таблице 1.

Таблица 1 Общая характеристика групп Группы Кол-во лиц Пол Возраст (средний, диапазон) мужчины женщины Орнифлю 20 11 9 29 (19-44) Орнифлю + Ингарон 20 8 12 31 (19-50)

Оценка реактогенности сочетанного введения препарата «Ингарон» и вакцины «Орнифлю» проводилась в течение 7 суток с момента введения препаратов и включала в себя анализ характера и частоты местных и общих побочных реакций. В критерии оценки безопасности входили результаты лабораторно-инструментальных исследований, включающих клинический анализ крови, общий анализ мочи и биохимический анализ крови (C-реактивный белок, мочевина, аланин-аминотрансфераза, общий белок), определение уровня IgM, IgG, IgE в сыворотке крови.

Способ введения: препарат ИНФ-γ вводится подкожно или внутримышечно в дозе 0,5 мл (100000 ME±10%/доза) в верхнюю треть плеча одной руки, затем инактивированная противогриппозная вакцина, содержащая 15 мкг/доза, вводится внутримышечно в дозе 0,5 мл, в верхнюю треть плеча другой руки. Интервал времени составил 5-10 минут.

Следует отметить, что по параметрам иммуногенности вакцина «Орнифлю» с содержанием ГА 15 мкг/дозу после однократного введения не удовлетворяла ни одному из национальных и европейских критериев ежегодной регистрации сезонных инактивированных гриппозных вакцин (ИГВ) для лиц в возрасте 18-60 лет. При сочетании введении вакцины с «Ингароном» отмечено соответствие критериям СРМР по 2-м из 3-х показателей иммуногенной активности вакцины (табл.2).

Таблица 2 Соответствие параметров иммуногенной активности вакцины критериям СРМР Показатели иммуногенной активности Однократная вакцинация «Орнифлю» + «Ингарон» Уровень выработки специфических антител Соответствие критериям СРМР Число лиц с 4-кратными сероконверсиями (≥1:20) 40% да Число лиц с защитными титрами (≥1:40) 24% нет Кратность прироста геометрических титров антител 2,5 да *Примечание: СРМР (Committee for Human Medicinal Products) - европейские критерии ежегодной регистрации ИГВ для лиц возраста 18-60 лет: увеличение среднегеометрического титра антител в 2,5 раза; 4-кратные сероконверсии у 40% и более лиц; число лиц с защитными титрами антител более 70%.

Оценка специфической активности (иммуногенных свойств) проводилась на 28±3 сутки после иммунизации. Гуморальный иммунный ответ оценивали по выработке специфических антител к вакцинному штамму NIBRG-14 вируса гриппа H5N1, содержание которых определяли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с человеческими и лошадиными эритроцитами и обработкой рецептор-разрушаюшим энзимом (RDE). Основные классы иммуноглобулинов (IgG, IgE, IgM) определяли методом радиальной иммунодиффузии по Manchini. Изучение популяционного состава и экспрессии активационных маркеров на поверхности лимфоцитов осуществлялось стандартным методом проточной цитофлюорометрии на цитометре EPICS XL (Coulter Corp., USA) с использованием моноклональных антител фирмы Bering. Выделение клеток проводится методом центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Pack (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция), плотность 1,077 г/см³. Уровни продукции цитокинов (ФНО-α, ИФН-гамма, ИЛ-4, ИЛ-6) определяли в сыворотке крови и в супернатантах трехдневных культур лимфоцитов при добавлении стандартных индукторов (пирогенал, фитогемагглютинин) и вакцинного препарата (5 мкг/мл) с использованием стандартных коммерческих наборов для тестирования в иммуноферментном анализе цитокинов человека. Содержание интерлейкина-2 (ИЛ-2) определяли биологическим методом с помощью стандартного теста поддержания пролиферации ИЛ-2 зависимой Т-клеточной перевиваемой линии CTLL-2.

Средние показатели общего анализа крови добровольцев как до вакцинации, так и в течение динамического наблюдения претерпевали незначительные изменения и оставались в пределах нормальных значений. Средние значения биохимических показателей крови у всех добровольцев на разных сроках обследования, несмотря на незначительные отклонения, также оставались в пределах нормативных значений. Показатели общего анализа мочи у добровольцев в процессе динамического наблюдения незначительно колебались в пределах нормальных величин (данные не приводятся).

Определение уровня IgE в сыворотках крови выявило, что колебания значений содержания IgE в поствакцинальном периоде были незначительны и оставались в пределах нормы, что свидетельствует об отсутствии аллергизирующего воздействия использованной схемы вакцинации.

Таким образом, в ходе исследования отмечена хорошая переносимость и безопасность сочетанного введения препарата «Ингарон» и вакцины «Орнифлю». Специфических реакций на введение «Ингарона», а также системных реакций средней и тяжелой степени выраженности, а также серьезных побочных реакций в ходе исследования не отмечено.

Для оценки влияния препарата «Ингарон» на показатели иммуногенной активности вакцины «Орнифлю» при однократном введении вакцины проведено серологическое исследование парных сывороток крови добровольцев, взятых до и через 28±3 дня после иммунизации, в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Оценку иммуногенности проводили в соответствии с критериями СРМР ЕМЕА (2001 г.) и МУ 3.3.2.1758-03. Следует отметить, что к настоящему времени подобные критерии для пандемических гриппозных вакцин не определены.

Иммуногенность испытуемой вакцины оценивалась по основным показателям, характеризующим напряженность гуморального иммунитета - по проценту привитых с достоверными 4-кратными и более приростами титров антител во вторых сыворотках, а также по средним геометрическим титрам антител и кратности приростов геометрических титров антител. В настоящем клиническом исследовании использовались данные, полученные в ходе 1-й фазы клинического исследования вакцины «Орнифлю» с содержанием ГА 15 мкг/дозу.

При сравнении иммуногенности сочетанного применения вакцины «Орнифлю» с препаратом «Ингарон» и применения вакцины без «Ингарона» показано усиливающее влияние препарата «Ингарон» на показатели иммуногенной активности вакцины «Орнифлю» при ее однократном введении.

Отмечено увеличение уровня 4-кратных сероконверсий ≥1:20 (40% против 21%); повышение показателя кратности прироста геометрических титров антител (2,5 против 1,6); увеличение процента сероконверсий с выработкой защитного титра антител ≥1:40 (24% против 10,5%) и прироста средних геометрических титров антител (12,6 против 8). Оценка клеточного звена иммунитета.

Проведено исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови, содержания и функциональной активности NK-клеток, изучены параметры цитокинового звена иммунитета (in vivo, in vitro) у добровольцев через 2 недели после однократного сочетанного введения вакцины «Орнифлю» и препарата «Ингарон». Проведено сравнение полученных данных с результатами исследования показателей клеточного звена иммунитета у волонтеров через 4 недели после двукратной вакцинации «Орнифлю» без «Ингарона». Иммунологическое исследование проведено у 10 человек в каждой группе.

Т-лимфоциты. В настоящем исследовании у волонтеров до введения вакцины относительное и абсолютное количество лимфоцитов не выходило за пределы нормативных значений (табл.3). Абсолютное количество зрелых CD3-позитивных клеток, выполняющих функцию проведения сигнала активации Т-клеток, соответствовало норме, а относительное количество СВ4-клеток (Т-хелперов) характеризовалось тенденцией к увеличению. Также отмечалось снижение абсолютного содержания зрелых цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ) CD3+CD8+, что соответствовало нижней границы нормы их содержания. Это отразилось на увеличении иммунорегуляторного индекса (ИРИ), отражающего соотношение относительного числа Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов (CD4/CD8). У всех добровольцев до и после вакцинации сохранялось исходно повышенное значение этого показателя.

После вакцинации в группе однократно привитых вакциной «Орнифлю» в сочетании с препаратом «Ингарон» наблюдалось достоверное увеличение относительного и абсолютного количества активированных Т-киллеров (CD3-CD8+). При этом двукратная вакцинация без «Ингарона» сопровождалась существенным снижением как абсолютного, так и относительного содержания CD3-CD8+Т-клеток. Следует отметить, «Ингарон» не повышает апоптоз мононуклеаров периферической крови при введении вакцины с ««Ингароном»» увеличения экспрессии на лимфоцитах антигена CD95, который является маркером апоптоза, отмечено не было.

Активированные лимфоциты: экспрессия «активационных маркеров» HLA-DR и CD25 на лимфоцитах привитых. Важную информацию о состоянии иммунной системы дает анализ экспрессии активационных маркеров на поверхности иммунокомпетентных клеток (ИКК). Анализ экспрессии раннего активационного маркера CD25 (α-субъединица рецептора для ИЛ-2) на лимфоцитах добровольцев, привитых вакциной «Орнифлю», выявил, что введение в схему вакцинации «Ингарона» при однократном введении «Орнифлю» привело к достоверному увеличению абсолютного и относительного содержания CD25+Т-клеток по сравнению с исходными данными, и группой сравнения (табл.3).

Таблица 3 Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови у добровольцев, однократно привитых вакциной «Орнифлю» + «Ингарон» и у двукратно привитых вакциной «Орнифлю» (М±m) Показатель отн. (%), абс. (в мм3) До вакцинации После вакцинации Орнифлю + Ингарон (n=10) Орнифлю (n=10) Лимфоциты % 29,4±2,8 28,4±2,6 31,8±5,6 абс. 1631,5±95,2 1380,1±113,6 1699,8±191,2 CD3+(Т-лимфоциты) % 73,6±1,3 70,9±2,6 77,9±4,1 абс. 1201,9±80,8 972,4±73,1 1306,8±145,4 CD4+(Т-хелперы) % 46,7±1,8 44,7±1,3 49,4±3,2 абс. 7б5,4±54,5 628,0±56,7 772,2±161,8 CD3+CD8+(Т-киллеры) % 24,0±1,9 24,0±2,4 27,2±2,6 абс. 384,0±45,1 317,5±31,3 412,6±54,5 CD3-CD8+ % 4,1±0,6 5,3±1,1* 2,0±0,5** абс. 60,6±9,4 73,3±14,2* 32,6±11,6** CD4/CD8   2,1±0,2 2,0±0,2 1,9±0,3 CD19+(В-лимфоциты) % 8,4±1,3 8,3±1,2 6,8±0,5 абс. 133,1±14,0 122,5±17,5 104,6±17,5 CD95+ % 6,2±0,4 5,9±0,7 7,8±0,9 абс. 108,2±14,9 83,0±11,9 121,2±27,9 Примечание: * - достоверные отличия по сравнению с группой добровольцев до вакцинации (Р<0,05), ** - достоверные отличия между группами «Орнифлю» и «Орнифлю» + «Ингарон» (Р<0,05).

Одним из основных маркеров активированных лимфоцитов является экспрессия HLA-DR антигена на поверхности клеток, связанного с процессами презентации антигена.

Исходное количество HLA-DR⁺ лимфоцитов у добровольцев до вакцинации было в пределах нормативных показателей (табл.4).

После вакцинации наблюдалась тенденция к увеличению относительного содержания HLA-DR⁺ -клеток в группе привитых вакциной «Орнифлю» с «Ингароном»; в группе двукратно привитых вакциной «Орнифлю» данный показатель практически не изменился.

Таблица 4 Показатель (%, абс.) До вакцинации После вакцинации Орнифлю + Ингарон (n=10) Орнифлю (n=10) HLA DR+ % 7,6±1,2 10,6±1,3 6,6±0,6 абс. 122,6±10,5 123,5±20,1 103,4±20,0 CD4+HLA DR+ % 1,2±0,2 1,7±0,2* 0,9±0,1** абс. 19,4±1,4 19,8±2,9 14,0±1,7 CD25 + (рецептор для ИЛ-2) % 2,0±0,2 3,4±0,3* 1,4±0,3** абс. 29,4±3,4 40,1±3,9* 24,0±3,4** Примечание: * - достоверные отличия по сравнению с группой добровольцев до вакцинации (Р<0,05), ** - достоверные отличия между группами «Орнифлю» и «Орнифлю» + «Ингарон» (Р<0,05).

При этом отмечено достоверное увеличение относительного содержания лимфоцитов с фенотипом CD4⁺ HLA-DR⁺ в группе «Орнифлю» + «Ингарон» (1,2±0,2% до вакцинации; 1,7±0,2% после вакцинации) против 0,9±0,1% после двукратной вакцинации «Орнифлю» без «Ингарона».

В-лимфоциты

Основной характеристикой В-лимфоцитов является наличие на их поверхности рецепторов для распознавания антигенов - BCR, подобно TCR рецептору Т-лимфоцитов. Сигнальной функцией обладает ряд дополнительных молекул, образующих корецептор - CD19, CD20, CD21 и др. молекулы. Количество СШ9-позитивных В-лимфоцитов у всех исследуемых добровольцев было в пределах нормальных показателей как до, так и после вакцинации независимо от схемы введения вакцины.

Оценка функциональной активности В-лимфоцитов показала, что наряду с усиливающим влиянием препарата «Ингарон» на выработку специфических антител в ответ на введение вакцины, наблюдается достоверное повышение уровня неспецифических сывороточных IgM у добровольцев, вакцинированных «Орнифлю» + «Ингарон» по сравнению с уровнем IgM, выявляемых после однократной вакцинации «Орнифлю» без «Ингарона» (табл.5).

Таблица 5 Уровни неспецифических иммуноглобулинов в сыворотке крови. Показатель Орнифлю+Ингарон (n=20) Орнифлю (n=20) До вакцинации После вакцинации До вакцинации После 1-й вакцинации После 2-й вакцинации IgM 1,8 2,9 1,91 1,78 2,28 IgG 19,2 13,54 11,58 11,22 12,52

Содержание и функциональная активность NK-клеток

В периферическом пуле лимфоцитов присутствует фракция клеток, лишенная маркеров Т- и В-лимфоцитов, обозначаемая как NK (натуральные или естественные киллерные) клетки. NK-клетки рассматриваются как существенный компонент неспецифической защиты организма и участники клеточно-опосредованного иммунного ответа. Проведено изучение количественного содержания клеток-эфффекторов неспецифической резистентности NK-клеток с маркером CD3-CD16+, субпопуляции NK-клеток CD56+, обладающих регуляторным потенциалом и уступающим CD3-CD16+ в цитотоксической активности. Также были изучено количество зрелых Т-лимфоцитов с маркером CD3+CD16-CD56- и минорной популяции лимфоцитов, NK- Т-клеток, несущих на поверхностной мембране маркеры, как зрелых Т-лимфоцитов, так и NK-клеток (с одновременной экспрессией CD16 и CD3 антигенов). В качестве теста на функциональную цитотоксическую активность NK-клеток использовали цитотоксический тест в отношении стандартных опухолевых клеток-мишеней линии К562.

Фоновое относительное содержание субпопуляций натуральных киллеров, а именно CD16⁺ и CD56⁺ практически не отличались от нормы, и составило 16,1±1,5% и 1,0±0,1% от всех лимфоцитов периферической крови соответственно (табл.6).

Таблица 6 Показатели относительного содержания субпопуляций NK-клеток и их цитотоксическая активность. Показатель До вакцинации После вакцинации Орнифлю + Ингарон (n=10) Орнифлю (n=10) CD3+, % 73,6±1,3 72,4±1,1 77,9±4,1 CD16+, % 16,1±1,5 18,1±2,2 8,2±2,4** CD 56+, % 1,0±0,1 1,3±0,3* 0,8±0,1** T-NK, % 0,7±0,2 1,7±0,2* 0,5±0,1** Цитотоксичность NK клеток, % 35,8±0,6 36,4±6,9 31,7±5,9 Примечание: * - достоверные отличия по сравнению с группой добровольцев до вакцинации (Р<0,05), ** - достоверные отличия между группами «Орнифлю» и «Орнифлю» + «Ингарон» (Р<0,05).

Однократное введение вакцины «Орнифлю» с препаратом «Ингарон» привело к увеличению относительного содержания обеих субпопуляций NK-клеток, что выразилось тенденцией к увеличению относительного содержания CD16⁺ клеток до 18,1±2,2% и существенным увеличением CD56⁺ клеток до 1,3±0,3% от всех лимфоцитов периферической крови. Данные показатели достоверно превышали показатели относительного количества CD16⁺ и CD56⁺ клеток после двукратного введения вакцины «Орнифлю» (8,2±2,4% и 0,8±0,1%, соответственно).

Однократная вакцинация с введением «Ингарона» привела к достоверному увеличению T-NK клеток по сравнению с исходными данными (1,7±0,2% против 0,7±0,2%). При этом изменения относительного количества T-NK клеток после двукратной вакцинации «Орнифлю» отмечено не было и составило 0,5±0,1% от всех лимфоцитов периферической крови.

Увеличение относительного количества субпопуляций NK-клеток не сопровождалось изменением их суммарного цитотоксического потенциала как после однократной вакцинации с ««Ингароном»» (35,8±0,6% до вакцинации и 36,4±6,9 через 2 недели после вакцинации), так и после двукратной вакцинации «Орнифлю» (35,8±0,6% против 31,7±05,9%).

Параметры цитокинового звена иммунитета

По современным представлениям, в реализации гуморальных и клеточных механизмов развития поствакцинального иммунного ответа важная роль отводится цитокиновой регуляции. Проведено исследование особенностей развития Тh1- и Th2-иммунного ответа in vivo (цитокины сыворотки крови) и in vitro (спонтанная и индуцированная продукция цитокинов мононуклеарами периферической крови) в ответ на однократное сочетанное введение вакцины с «Ингароном» и при двукратном введении вакцины «Орнифлю» без «Ингарона».

Уровни цитокинов в сыворотке крови волонтеров

Определялись уровни цитокинов (ИФНγ, ИЛ-4, ИЛ-6, ФНО-α) в сыворотке крови, отражающие текущее состояние работы иммунной системы. Через 2 недели после сочетанного введения вакцины с «Ингароном» отмечено достоверное по сравнению с исходным увеличение уровня содержания ФНО-α в сыворотке крови волонтеров и увеличение уровня ИФН-γ, превышающее нормальные показатели (табл.7).

Таблица 7 Уровень цитокинов в сыворотке крови волонтеров однократно привитых вакциной «Орнифлю» + «Ингарон» Показатель (пг/мл) Норма Орнифлю + Ингарон (n=10) До вакцинации После вакцинации ИЛ-4 0-50 5,0±0,1 4,7±0,2 ИЛ-6 0-50 10,7±5,1 7,9±2,4 ИФН-γ 0-50 57,9±6,9 67,2±2,1 ФНО-α 0-50 9,3 ±2,7 28,8±9,3* Примечание: * - достоверные отличия по сравнению с группой добровольцев до вакцинации (Р<0,05)

Определение уровней спонтанной и индуцированной продукции цитокинов мононуклеарами периферической крови (МПК), отражающих функциональное состояние клеток и потенциальные возможности их активации, проводилось до вакцинации и через 2 недели после сочетанного введения вакцины с «Ингароном» (табл.8).

Таблица 8 Спонтанная и индуцированная продукция цитокинов мононуклеарами периферической крови волонтеров, однократно привитых вакциной «Орнифлю» + «Ингарон» Показатель Норма Орнифлю + Ингарон (n=10) СП ИП До вакцинации После вакцинации СП ИП СП ИП ИЛ-4 (пг/мл) 0-50 100-400 60,7±2,3 65,8±5,2 51,4±3,6* 45,9±4,7* ИЛ-6(пг/мл) 0-50 1000-3000 11,7±3,1 1716,7±24,3 9,9±2,2 2145,7±35,2* ИФН-γ (пг/мл) 0-50 1000-5000 138,3±7,9 564,3±13,8 193,6±8,1* 631,6±15,4* ФНО-α (пг/мл) 0-50 500-1500 13,3±2,5 1172,1±12,7 22,7±3,3* 1331,0±16,9* ИЛ-2 Ед/мл 0-5 10-100 2,0±0,1 13,3±0,9 4,3±2,2* 22,8±2,9* Примечание: СП - спонтанная продукция; ИП - индуцированная продукция; * - достоверные отличия по сравнению с группой добровольцев до вакцинации (Р<0,05)

Интерлейкин-4

Фоновое исследование B-клеточного ростового фактора (ИЛ-4) характеризовалось повышенным уровнем спонтанной продукции этого цитокина при его нормальном содержании в сыворотке. Индуцированная продукция при этом была ниже показателей популяционной нормы, однако это не было расценено как снижение резервных возможностей. Через две недели после вакцинации отмечалось достоверное снижение всех показателей ИЛ-4 in vitro, тогда как содержание в сыворотке оставалось без изменений, что может косвенно свидетельствовать об ингибиции продукции ИЛ-4 Т-хелперами 2 типа. Таким образом, в поствакцинальный период не отмечено увеличения B-клеточного ростового фактора (ИЛ-4), который способствует переключению T-хелперов 0 на Т-хелперы 2 типа.

Интерлейкин-6

До вакцинации фоновый уровень ИЛ-6 в сыворотке, спонтанная продукция и индуцированная продукция на пирогенал, были в пределах нормы. Через две недели после вакцинации отмечалось достоверное увеличение продукции ИЛ-6 in vitro. При этом наблюдалась незначительное снижение его спонтанной продукции и содержания в сыворотке. Эти данные могут также свидетельствовать об ингибиции продукции ИЛ-6 Т-хелперами 2 типа при введении вакцины с «Ингароном», однако при этом увеличиваются резервные возможности организма, для достаточной продукции ИЛ-6, что способствует выработке специфических антител.

Интерферон-гамма

До вакцинации спонтанная и индуцированная продукция ИФН-γ были в пределах нормы. Увеличение через две недели после вакцинации уровня ИФН-γ при индукции стандартным индуктором и при использовании в качестве индуктора вакцинного препарата, сопровождающиеся увеличением спонтанной продукции и содержания в сыворотке подтверждают поляризацию иммунного ответа в сторону Th-1 звена.

Фактор некроза опухолей альфа

Фоновый уровень ФНО-α в сыворотке, спонтанная продукция и резервные возможности, определяемые стандартным индуктором, были в пределах нормы. Специфическая индуцированная продукция ФНО-α уступала уровню выработки цитокина при стимуляции оптимальным индуктором, которым является пирогенал. Вакцинация волонтеров вызвала активацию иммунной системы, что было показано повышением уровня ФНО-α в сыворотке крови, увеличением спонтанной и индуцированной продукции ФНО-α. При этом продукция ФНО-α на вакцинный препарат в качестве индуктора достоверно увеличивалась и была сопоставима с ответом на общепринятый индуктор.

Интерлейкин-2

До вакцинации спонтанная и индуцированная продукция ИЛ-2 были в пределах нормы. Через две недели после вакцинации отмечено повышение уровня ИЛ-2 при индукции стандартным индуктором и при использовании в качестве индуктора вакцинного препарата, что сопровождалось увеличением спонтанной продукции ИЛ-2. Так как ИЛ-2 синтезируется активированными Т-лимфоцитами (Тx₀ и Tx₁), являясь ростовым фактором для Т-, В- и NK-клеток, то полученные данные свидетельствуют в пользу развития иммунного ответа по Th1-типу.

Сравнительная оценка спектра цитокинов в поствакинальном периоде при двух схемах вакцинации.

Проведена сравнительная оценка продукции цитокинов (in vivo, in vitro) в поствакцинальном периоде при двух схемах вакцинации (однократная вакцинации «Орнифлю» + «Ингарон»; двукратная вакцинация «Орнифлю»). Наибольшие различия в спектре вырабатываемых цитокинов в сравниваемых группах наблюдались по продукции ФНО-α и ИЛ-6. Отмечено, что введение в схему вакцинации «Ингарона» привело к достоверно более высокой продукция цитокинов in vitro в ответ на специфический индуктор.

ИЛ-6 является фактором дифференцировки В-клеток и способствует созреванию В-лимфоцитов в антител-продуцирующие клетки. Можно предположить, что одним из механизмов позитивного влияния препарата на процесс специфического антителообразования при вакцинации может служить увеличение продукции ИЛ-6. В данном исследовании выявлена взаимосвязь между достоверно более высокой продукцией ИЛ-6 в ответ на специфическую стимуляцию in vitro в группе волонтеров, привитых вакциной с «Ингароном» и ответивших на вакцинацию выработкой специфических антител по сравнению с лицами, у которых вакцинация не приводила к развитию специфического гуморального ответа (данные не приводятся).

Сравнительная оценка уровня цитокинов в сыворотке крови в группах сравнения выявила однонаправленный характер изменений в поствакцинальном периоде. Отмечено повышенное содержание IFNγ в сыворотке крови привитых, что вероятно связано с периодом выработки специфических IgG в ответ на антигенную стимуляцию и определяет достоверно более высокий уровень IFNγ в сыворотке крови при двукратном введении вакцины.

Выводы

1. В ходе исследования отмечена хорошая переносимость и безопасность сочетанного введения в означенных дозах препарата «Ингарон» и вакцины «Орнифлю», причем специфических реакций на введение «Ингарона» не отмечено.

2. Показано усиливающее влияние препарата «Ингарон» (100000±10% МЕ/дозу) на показатели иммуногенной активности вакцины «Орнифлю» (15 мкг ГА/дозу) при однократном введении.

Выявленные иммуномодулирующие свойства рекомбинантного интерферона гамма человека «Ингарон» при его сочетанном применении с субъединичной гриппозной вакциной «Орнифлю» показали, что использование препарата в схеме вакцинации другими противогриппозными вакцинами может быть иммунологически обоснованным, способным стимулировать развитие специфического ответа ЦТЛ (CD8+), обеспечивающего формирование поствакцинального иммунитета к вирусам гриппа разных подтипов, особенно у иммунокомпрометированной категории людей, таких как часто болеющие, имеющие аллергопатологию и другие хронические заболевания.

Пример

40 здоровым взрослым лицам сначала ввели подкожно в верхнюю треть плеча одной руки рекомбинантный интерферон гамма человека («Ингарон») в дозе 100000 МЕ/дозу вакцины, затем, через 5-10 минут, гриппозную инактивированную субъединичную вакцину «Орнифлю» (штамм NIBRG-14, A/H5N1) 0,5 мл 15 мкг/дозу в верхнюю треть плеча другой руки. Исследование через 4 недели после вакцинации показало, что такая схема введения препаратов способствовала активации гуморального звена иммунитета, что проявилось в увеличении выработки специфических антител при однократном введении вакцины «Орнифлю» - число лиц с защитными титрами антител (>1:40) по данным РТГА составило 21 человек, что составило 52,5%. А также выявлена активация клеточного иммунитета с увеличением содержания активированных неспецифических ЦТЛ (CD3-CD8+), основных субпопуляций NK-клеток (CD16+, CD56+, NKT), усиление экспрессии «активационных маркеров» CD25+и HLA DR на лимфоцитах добровольцев, что соответствовало предыдущим исследованиям.

Определение продукции Т-хелперами Тhl (ИФНγ, ИЛ-2) и Th2 (ИЛ-4) - цитокинов в поствакцинальном периоде выявило поляризацию иммунного ответа в сторону Тhl-звена. Также отмечено увеличение специфической продукции in vitro ИЛ-6 и ФНО-α, что способствовало процессу специфического антителообразования. Основные изменения параметров клеточного и гуморального иммунитета при однократной вакцинации «Орнифлю» с сочетанным введением «Ингарона» представлены в таблице 9.

Таблица 9 Изменения параметров клеточного и гуморального иммунитета при однократной вакцинации «Орнифлю» с сочетанным введением «Ингарона» Показатели В-клетки Т-клетки NK клетки Фенотип Уровень CD19+
не изменился Увеличение содержания активированных неспецифических ЦТЛ-клеток (CD3-CD8+); усиление экспрессии «активационных маркеров» лимфоцитов (CD25+, HLADR+, CD4+HLADR+); не отмечено увеличения СВ95+Т-клеток. Увеличение содержания CD16+, CD56+, NK- и Т-клеток. Исследование функционального состояния in vitro Не проводилось Формирование иммунного ответа по Тhl-типу: увеличение антиген-специфической продукции ИЛ-2 и ИФН-гамма, угнетение выработки ИЛ-4; увеличение продукции ФНО-альфа и ИЛ-6. Изменения цитотоксической активности NK-клеток не отмечено Исследование функционального состояния in vivo Увеличение продукции специфических антител и неспецифических IgM Увеличение содержания ФНО-альфа и ИФН-гамма в сыворотке крови.  

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для профилактики гриппа. Для этого совместно однократно вводят цитокин, в качестве которого используют интерферон гамма, и инактивированную противогриппозную вакцину. Интерферон гамма вводят внутримышечно или подкожно в дозе 0,5 мл 100000 МЕ±10% в верхнюю треть плеча одной руки, а затем внутримышечно в верхнюю треть плеча другой руки вводится 0,5 мл инактивированной противогриппозной вакцины на основе вакцинных штаммов вируса гриппа (H5N1) «Орнифлю» с содержанием минимальной дозы гемагглютинина для этой вакцины 15 мкг/доза. Способ позволяет повысить иммуногенность и протективную активность вакцины при однократной вакцинации и снижении побочных эффектов за счет модуляции иммунного ответа на антиген. 9 табл., 1 пр.

Способ профилактики гриппа, включающий введение цитокина и инактивированной противогриппозной вакцины совместно однократно, отличающийся тем, что в качестве цитокина используют интерферон гамма и введение осуществляют парентерально, причем сначала вводят интерферон гамма внутримышечно или подкожно 0,5 мл в дозе 100 000 ME ±10% в верхнюю треть плеча одной руки, а затем внутримышечно в верхнюю треть плеча другой руки вводят 0,5 мл инактивированной противогриппозной вакцины на основе вакцинных штаммов вируса гриппа A(H5N1) «Орнифлю» с содержанием минимальной дозы гемагглютинина для этой вакцины 15 мкг/доза.