СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ПЕЧЕНОЧНОЙ ЭНЦЕФАЛОПАТИИ Российский патент 2009 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и может быть применено при моделировании печеночной энцефалопатии.

Известен способ моделирования энцефалопатии, согласно которому у лабораторных животных (грызунов) в течение 2-3 часов дробно, 2-5 раз, производят забор 60-70% объема циркулирующей крови (1 - патент RU №2257620). Данный способ принят за аналог.

Известен способ моделирования энцефалопатии, согласно которому лабораторным животным однократно внутрибрюшинно или внутривенно вводят фенилгидразин в дозе 100-150 мг/кг (2 - патент RU №2253152). Данный способ принят за прототип. Однако данный способ позволяет моделировать гипоксическую, а не печеночную энцефалопатию. Целью изобретения является повышение точности моделирования печеночной энцефалопатии.

Технический результат достигается тем, что в качестве химического соединения используют четыреххлористый углерод в сочетании с вазелиновым маслом в соотношении 1:1, вводимый однократно еженедельно в течение 4-6 недель, и при наличии выраженного дистрофического процесса гепатоцитов, в сосудистой системе и желчных протоках портальных трактов и при снижении времени побежки крысами на расстояние 30 см до 100-150 с на седьмое-восьмое сочетание условного и безусловного раздражителя считают модель печеночной энцефалопатии достигнутой.

Способ осуществляется следующим образом.

Модель печеночной энцефалопатии создавали на крысах породы Вистар весом 220-250 г путем 4-6-кратного еженедельного подкожного введения четыреххлористого углерода в вазелиновом масле в соотношении 1:1 в объеме 0,3-0,4 мл. Точность моделирования печеночной энцефалопатии оценивали путем выработки условного пищевого рефлекса. Рефлекс вырабатывали путем предварительного раздражения зрительного анализатора источником света мощностью 60 Вт при экспозиции 1 с и последующим предоставлением пищевого безусловного белкового раздражителя (мяса) в объеме 1/10-1/12 емкости желудка животного. Оценку скорости образования условных рефлексов проводили путем определения длительности преодоления (побежки) животным расстояния в 30 см до места кормления и длительности сохранения условного рефлекса без подкрепления его безусловным раздражителем.

Условный пищевой рефлекс у крыс с дистрофией печени характеризовался замедлением выработки условного рефлекса через 1 месяц от начала моделирования - снижением времени побежки до 100-150 с на седьмое-восьмое сочетание условного и безусловного раздражителя.

Подкрепление условного раздражителя безусловным не сопровождалось поглощением животными предъявляемого корма на протяжении 200 с. Второе сочетание условного и безусловного раздражителя сопровождалось сокращением времени подкрепления условного раздражителя побежкой к кормушке длительностью от 150 с до 180 с. На протяжении третьего сочетания условного и безусловного раздражителей не происходило уменьшения времени побежки - 150-180 с. Четвертая, пятая и шестая пробы сопровождались закреплением связей корковых центров условного и безусловного раздражителей. Седьмая и восьмая пробы характеризовались наименьшим латентным периодом от светового сигнала до пищевого подкрепления - от 100 с до 150 с.

То есть развитие печеночной энцефалопатии у крыс с дистрофией печени приводило к увеличению латентного периода выработки условного рефлекса. Условный рефлекс при неподкреплении его безусловным раздражителем сохранялся на протяжении 4-5 последующих после его выработки дней.

Морфологическое исследование печени крыс через 1-1,5 месяца после введения четыреххлористого углерода выявило нарушение дольковой структуры печеночной ткани и дистрофию большинства гепатоцитов в виде вакуолизации цитоплазмы. Множественные вакуоли часто сливаются в одну общую вакуоль, занимающую практически всю клетку и содержащую плотное пикнотичное ядро и разрушенные органеллы. Клеточная оболочка у большинства клеток утолщена. Группы наиболее измененных гепатоцитов разрушаются с образованием полиморфных кист, имеющих разные размеры. В участках деструкции гепатоцитов располагаются небольшие скопления черно-бурых гранул, свидетельствующих о развитии холестаза. Сосудистая система печени также изменена - синусоиды практически не выявляются, за исключением тех, которые расположены вблизи расширенных центральных вен. Для портальных трактов характерна разная степень лимфоидной инфильтрации, отражающая развитие воспалительного процесса. Сосудистый пучок представлен резко расширенной веной, содержащей небольшое количество форменных элементов крови. Артерии практически не встречаются. Желчные протоки портального тракта единичные или в количестве 2-3 имеют разную ширину просвета. Кубический эпителий, выстилающий их стенку, в большинстве случаев сохранен. Ядра эпителиоцитов несколько уплотнены. Стенка некоторых протоков частично инфильтрирована лимфоцитами.

Повышение точности моделирования печеночной энцефалопатии доказывается значительным увеличением времени побежки, замедлением образования условного рефлекса и выраженным дистрофическим процессом, распространяющимся на гепатоциты, сосудистую систему, желчные протоки портальных трактов печени.

В контрольной группе (интактных животных) выработку условного пищевого рефлекса осуществляли при 5-6-кратном сочетании условного светового сигнала с пищей. Время от предъявления условного раздражителя до подкрепления его пищей составило 13-20 с. Второе световое раздражение сопровождалось уменьшением минимального времени побежки до 7 с. Последующее третье сочетание условного и безусловного раздражителя приводило к уменьшению минимального времени побежки до 5 с. Четвертое и пятое сочетание условного и безусловного раздражителя приводило к выработке условного рефлекса, длительность побежки составляла 5-10 с. Шестое сочетание условного раздражителя с безусловным пищевым подкреплением приводило к закреплению временных связей между центрами условного и безусловного представительства рефлексов у всех животных, причем минимальное время рефлекса оставалось на прежнем уровне, составляя 5 с.

На седьмой-восьмой раз осуществления светового раздражения без пищевого подкрепления у всех животных наблюдалась побежка к кормушке с минимальным временем 5 с.

Таким образом, у интактных животных условный пищевой рефлекс вырабатывается после 5-6 применений сочетания условного раздражителя с безусловным пищевым подкреплением и имеет небольшую экспозицию. Условный рефлекс при неподкреплении его безусловным раздражителем у интактных крыс сохранялся на протяжении 6-7 последующих после его выработки дней.

Пример 1

Крысе породы Вистар весом 220 г осуществляли 4-кратное введение четыреххлористого углерода в вазелиновом масле в соотношении 1:1 в объеме 0,3 мл подкожно с интервалами в 1 неделю. Условный пищевой рефлекс вырабатывали путем раздражения зрительного анализатора источником света мощностью 60 Вт при экспозиции 1 с с предоставлением пищевого безусловного белкового раздражителя (мяса) в объеме 1/12 емкости желудка животного. Определяли длительность побежки животного до места кормления.

Условный пищевой рефлекс у крысы с дистрофией печени характеризовался замедлением выработки условного рефлекса через 1 месяц от начала моделирования - снижением времени побежки на расстояние 30 см до 100 с на седьмое сочетание условного и безусловного раздражителя.

Первое подкрепление условного раздражителя безусловным не сопровождалось поглощением животными предъявляемого корма на протяжении 200 с. Второе сочетание условного и безусловного раздражителя сопровождалось уменьшением времени подкрепления условного раздражителя - 160 с. На протяжении третьего сочетания условного и безусловного раздражителей происходило уменьшение времени побежки до 150 с. Четвертая, пятая и шестая пробы сопровождались закреплением связей корковых представителей условного и безусловного раздражителей. Седьмая проба характеризовалась наименьшим латентным периодом от светового сигнала до пищевого подкрепления, составившим 100 с.

То есть развитие печеночной энцефалопатии у крысы с дистрофией печени приводило к увеличению латентного периода выработки условного рефлекса. Условный рефлекс сохранялся на протяжении 4 дней.

Морфологическое исследование биоптатов печени крысы с дистрофией печени проведено через 1 месяц после четырехкратного введения четыреххлористого углерода. Через 1 месяц после создания модели в печени развивается дистрофический процесс. Дольковая структура печени нарушена. Дистрофический процесс распространяется на большую часть гепатоцитов, в которых выявляется вакуолизация цитоплазмы. Клеточная оболочка у большинства клеток утолщена. В участках деструкции гепатоцитов располагаются небольшие скопления черно-бурых гранул. Вблизи расширенных центральных вен выявляются единичные синусоиды. В портальных трактах выявляется лимфоидно-клеточная инфильтрация. Сосудистый пучок представлен резко расширенной веной, содержащей небольшое количество форменных элементов крови. Артерии не встречаются. Желчные протоки портального тракта единичные, имеют разную ширину просвета. Кубический эпителий, выстилающий их стенку, сохранен. Ядра эпителиоцитов несколько уплотнены. Стенка некоторых протоков частично инфильтрирована лимфоцитами.

О повышении точности моделирования печеночной энцефалопатии свидетельствует значительное увеличение времени побежки, замедление образования условного рефлекса и выраженный дистрофический процесс, распространяющийся на гепатоциты, сосудистую систему, желчные протоки портальных трактов печени.

Пример 2

Крысе породы Вистар весом 250 г 6-кратно один раз в неделю вводили четыреххлористый углерод в вазелиновом масле в соотношении 1:1 в объеме 0,4 мл подкожно в течение 6 недель. Условный пищевой рефлекс вырабатывали путем раздражения зрительного анализатора источником света мощностью 60 Вт при экспозиции 1 с и последующим предоставлением пищевого безусловного белкового раздражителя (мяса) в объеме 1/10 емкости желудка животного. Оценку скорости образования условных рефлексов проводили путем определения длительности преодоления (побежки) животным расстояния в 30 см до места кормления.

Условный пищевой рефлекс у крыс с дистрофией печени характеризовался замедлением выработки условного рефлекса через 1,5 месяца от начала моделирования - снижением времени побежки на расстояние 30 см до 150 с на восьмое сочетание условного и безусловного раздражителя.

Подкрепление условного раздражителя безусловным не сопровождалось поглощением животными предъявляемого корма на протяжении 200 с. Второе сочетание условного и безусловного раздражителя сопровождалось сокращением времени подкрепления условного раздражителя побежкой к кормушке - 180 с. На протяжении третьего сочетания условного и безусловного раздражителей происходило уменьшение времени побежки до 150 с. Четвертая, пятая и шестая пробы сопровождались закреплением связей корковых представителей условного и безусловного раздражителей. Восьмая проба характеризовалась наименьшим латентным периодом от светового сигнала до пищевого подкрепления - 150 с.

То есть развитие печеночной энцефалопатии у крысы с дистрофией печени приводило к увеличению латентного периода выработки условного рефлекса. Условный рефлекс сохранялся на протяжении 5 дней.

Проведено морфологическое исследование биоптатов печени данной крысы через 1,5 месяца после создания модели. В печени развивается дистрофический процесс. Дольковая структура печени нарушена. Дистрофический процесс распространяется на большую часть гепатоцитов, в которых выявляется вакуолизация цитоплазмы. Множественные вакуоли часто сливаются в одну общую вакуоль, занимающую практически всю клетку, содержащую плотное пикнотичное ядро и разрушенные органеллы. Клеточная оболочка у большинства клеток утолщена. Группы наиболее измененных гепатоцитов разрушаются с образованием полиморфных кист, имеющих разные размеры. В участках деструкции гепатоцитов располагаются небольшие скопления черно-бурых гранул. Синусоиды практически не выявляются. В портальных трактах выявляется лимфоидная инфильтрация. Сосудистый пучок представлен резко расширенной веной, содержащей небольшое количество форменных элементов крови. Артерии не встречаются. Желчные протоки портального тракта в количестве 2-3 имеют разную ширину просвета. Кубический эпителий, выстилающий их стенку, в большинстве случаев сохранен. Ядра эпителиоцитов уплотнены. Стенка некоторых протоков частично инфильтрирована лимфоцитами.

Повышение точности моделирования печеночной энцефалопатии доказывается значительным увеличением времени побежки, замедлением образования условного рефлекса и выраженным дистрофическим процессом, распространяющимся на гепатоциты, сосудистую систему, желчные протоки портальных трактов печени.

Пример 3

Крысе породы Вистар весом 240 г осуществляли 5-кратное введение четыреххлористого углерода в вазелиновом масле в соотношении 1:1 в объеме 0,35 мл подкожно с перерывами в 1 неделю в течение 5 недель. Рефлекс вырабатывали путем предварительного раздражения зрительного анализатора источником света мощностью 60 Вт при экспозиции 1 с и последующим предоставлением пищевого безусловного белкового раздражителя (мяса) в объеме 1/10 емкости желудка животного. Оценку скорости образования условного рефлекса проводили путем определения длительности преодоления (побежки) животным расстояния в 30 см до места кормления.

Условный пищевой рефлекс у данной крысы характеризовался замедлением выработки рефлекса через 5 недель от начала моделирования - снижением времени побежки до 120 с на седьмое сочетание условного и безусловного раздражителя.

Подкрепление условного раздражителя безусловным не сопровождалось поглощением животными предъявляемого корма на протяжении 190 с. Второе сочетание условного и безусловного раздражителя сопровождалось уменьшением времени подкрепления условного раздражителя до 170 с. На протяжении третьего сочетания условного и безусловного раздражителей уменьшение времени побежки составляло 160 с. Четвертая, пятая и шестая пробы сопровождались закреплением связей корковых представителей условного и безусловного раздражителей. Седьмая проба характеризовалась наименьшим латентным периодом от светового сигнала до пищевого подкрепления - 110 с.

То есть развитие печеночной энцефалопатии у крысы приводило к увеличению латентного периода выработки условного рефлекса. Условный рефлекс сохранялся на протяжении 5 дней.

Морфологическое исследование печени крысы через 5 недель после введения четыреххлористого углерода выявило нарушение дольковой структуры печеночной ткани и дистрофию большинства гепатоцитов в виде вакуолизации цитоплазмы. Множественные вакуоли сливаются в одну общую вакуоль, занимающую практически всю клетку и содержащую плотное пикнотичное ядро и разрушенные органеллы. Клеточная оболочка у большинства клеток утолщена. Группы наиболее измененных гепатоцитов разрушаются с образованием полиморфных кист, имеющих разные размеры.

В участках деструкции гепатоцитов располагаются небольшие скопления черно-бурых гранул. Синусоиды печени практически не выявляются, за исключением тех, которые расположены вблизи расширенных центральных вен. Для портальных трактов характерна лимфоидная инфильтрация. Сосудистый пучок представлен резко расширенной веной, содержащей небольшое количество форменных элементов крови. Артерии практически не встречаются. Желчные протоки портального тракта единичные. Кубический эпителий, выстилающий их стенку, в большинстве случаев сохранен. Ядра эпителиоцитов несколько уплотнены. Стенка некоторых протоков частично инфильтрирована лимфоцитами.

Изобретение относится к области экспериментальной медицины, а именно к экспериментальной гепатологии, и может быть использовано для моделирования печеночной энцефалопатии. Для этого используют четыреххлористый углерод в сочетании с вазелиновым маслом в соотношении 1:1. Смесь вводят однократно еженедельно в течение 4-6 недель. При наличии выраженного дистрофического процесса в гепатоцитах, в сосудистой системе и желчных протоках портальных трактов, и при снижении времени побежки на расстояние 30 см крысами до 100-150 с на седьмое-восьмое сочетание условного и безусловного раздражителя считают модель печеночной энцефалопатии достигнутой. Способ обеспечивает адекватное воспроизведение модели.

Способ моделирования печеночной энцефалопатии путем введения химического соединения, отличающийся тем, что в качестве химического соединения используют четыреххлористый углерод в сочетании с вазелиновым маслом в соотношении 1:1, вводимый однократно еженедельно в течение 4-6 недель, и при наличии выраженного дистрофического процесса в гепатоцитах, в сосудистой системе и желчных протоках портальных трактов, и при снижении времени пробежки на расстояние 30 см крысами до 100-150 с на седьмое-восьмое сочетание условного и безусловного раздражителя считают модель печеночной энцефалопатии достигнутой.