СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ КАДМИЕВОЙ НЕФРОПАТИИ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ОТРАВЛЕНИИ Российский патент 2009 года по МПК A61K51/00 A61K31/4164 A61P39/02 

Изобретение относится к экологии, медицине, токсикологии, экспериментальной биологии и может быть использовано при исследовании механизмов профилактики токсического действия тяжелых металлов, в частности кадмия.

Обогащение природной среды соединениями кадмия в последние десятилетия принимает угрожающие масштабы. Избыточное поступление и накопление кадмия в организме приводит к различным нарушениям процессов обмена веществ: разобщению процессов окислительного фосфорилирования (А.Takaki et al., 2004; S.Jimi et al., 2004), конкурентному замещению цинка в ряде металлоэнзимов и измению их активности (M.R.Fox, 1976); усилению активности перекисного окисления липидов (В.Н.Кухта и соавт., 2000; Е. Casalino et al., 2002); нарушению обмена жизненно важных электролитов, в частности кальция (И.В.Ликутова с соавт., 1987; Katsuta О. et al., 1994; Ohta Н., Ymauchi Y. et al. 2000). В конечном итоге все это ведет к развитию тяжелых острых и хронических состояний, поражению практически всех органов и систем. В связи с высокой кровоснабжаемостью и специфичностью функции, связанной с выведением из организма ксенобиотиков, почки являются одним из основных органов, на уровне которых проявляется повреждающее действие кадмия (Fukumoto М. et al., 2001; Tang W., Shaikh Z.A., 2001; L′Azou B. et al., 2002; L.J.Stinson et al., 2003; M. Trzcinka-Ochocka et al., 2004 и др).

Учитывая вышеизложенное и высокие кумулятивные свойства кадмия с эффективным процессом полувыведения равным от 140±20 суток (М.Я. Богомазов и соавт. 1984) до 10 лет (I.Franchini et al., 1990), актуальной является проблема создания и разработки способов профилактики кадмиевой нефропатии и токсических эффектов его соединений на организм.

Известно множество детоксикантов, способных снижать токсическое действие тяжелых металлов на организм. К ним относятся тиоловые соединения - тетацин кальций, унитиол, тиосульфат натрия, различные комплексообразующие соединения - пентацин, динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, дефероксамин, пеницилламин и др (Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2-х томах. Т.2. - Харьков «Торсинг», 1998. С.212-220). Применение, особенно длительное, этих синтетических препаратов способно вызвать различные побочные эффекты: расстройства ЖКТ, аллергические реакции, анемию, лейкопению, тромбоцитопению, острый некроз проксимальных канальцев нефронов и др. Также наряду с токсинами они способны выводить из организма микроэлементы и такие жизненно важные ионы, как железо, кальций, цинк и др. и вызывать нарушение обменных процессов, что затрудняет их длительное и профилактическое применение.

Известны также средства, понижающие нефротоксическое действие тяжелых металлов, в том числе и кадмия, например ксидифон и сукцимер (Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2-х томах. Т.2. - Харьков «Торсинг», 1998. С.212-220).

Недостатком этого способа является то, что препараты вызывают побочные эффекты, а профилактическое их влияние не изучено вообще. Сукцимер (унитиол) наряду с побочными действиями (см. выше) может оказывать мембранотоксический эффект, вследствие чего ограничена возможность его длительного профилактического использования. Ксидифон при длительном применении может изменять обмен жизненно важных электролитов, таких как кальций и магний, баланс которых в организме и без того меняется при кадмиевой интоксикации.

Особое место в комплексе дезинтоксикационных мер занимает использование антидотов. Антидотом, согласно определению экспертов Международной Программы Химической Безопасности ВОЗ, является препарат, обладающий способностью устранять или ослаблять специфические эффекты ксенобиотика. В современной фармакологии интенсивные изыскания ученых направлены, прежде всего, на поиск лекарственных средств, приближающихся по механизму действия к природным соединениям. Для этих целей перспективны металлокомплексы ряда жизненно важных элементов на основе азольных лигандов, принимающих активное участие в разнообразных ферментативных процессах и связывании микроэлементов в живых организмах. Данные координационные соединения, обладая широким спектром направленного действия, способствуют стабилизации гомеостаза, малотоксичны, легко дозируемы, а самое важное - высокоэффективны.

В Иркутском институте химии СО РАН в результате многолетних исследований в области направленного синтеза биологически активных соединений обнаружена высокая фармакологическая активность металлокомплекса соли цинка с 1-винилимидазолом, на основе которого создан лекарственный препарат "Ацизол". Препарат "Ацизол" является самым мощным и единственным в мире противогипоксическим средством. Ацизол, являясь высокоэффективным антигипоксантом, способен защитить организм при низком парциальном давлении кислорода и недостаточной оксигенации гемоглобина, снижать потребность организма в кислороде. Препарат способствует повышению устойчивости к гипоксии органов, чувствительных к недостатку кислорода. Кроме того, содержащийся в Ацизоле цинк, устраняя его дефицит в организме, нормализует каскады метаболических процессов, связанных с работой цинк-зависимых ферментных систем. В связи с этим Ацизол может быть использован при лечении цинк-дефицитных состояний (болезнь Прасада, иммунодефициты, аллергодерматозы и др.).

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа профилактики кадмиевой нефропатии при хроническом отравлении.

Решение этой задачи обеспечивает значительное снижение токсического действия кадмия на почки при хроническом отравлении путем снижения повреждающего действия кадмия на клетки, за счет цитопротекторного действия, основанного на предупреждении развития гипоксии клеток и снижения активности ферментных систем, за счет конкуренции между ионами кадмия и цинка в зоне связывания их в молекуле ферментов.

Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение способа профилактики кадмиевой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении имеет следующие отличительные признаки: животным ежедневно вводят ацизол в дозе 30 мг/кг через зонд в желудок одновременно с ежедневным введением раствора сульфата кадмия подкожно в дозе 0,1 мг/кг.

Ацизол вводится одновременно (что обозначает введение в пределах одного срока - 2 мес.) с сульфатом кадмия, что позволяет оценить его профилактический эффект при хронической интоксикации. Ацизол обладает комбинированным полезным действием при хронической кадмиевой интоксикации - является мощным антигипоксантом и донатором ионов цинка.

Профилактическое ежедневное введение ацизола через зонд в желудок в дозе 30 мг/кг одновременно с введением раствора сульфата кадмия подкожно приводит к уменьшению патологического воздействия тяжелого металла у экспериментальных животных. Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется выше указанная возможность получения способа профилактики кадмиевой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении, отличающийся тем, что животным ежедневно вводят ацизол в дозе 30 мг/кг через зонд в желудок одновременно с ежедневным введением раствора сульфата кадмия подкожно в дозе 0,1 мг/кг, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе профилактики кадмиевой нефропатии путем снижения токсического действия кадмия при хроническом отравлении, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом.

Для получения токсического вещества сульфат кадмия растворяется в стерильной дистиллированной воде таким образом, что на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 0,1 мг кадмия (в пересчете на металл). На каждые 100 г веса крысы вводится подкожно 0,1 мл токсического раствора, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного. Путем растворения 30 г ацизола в 1 литре 0,5% раствора уксусной кислоты получаем стойкий раствор ацизола с содержанием 30 мг в 1 мл. Раствор ацизола вводим через зонд в желудок при помощи шприца со специально изогнутой иглой, на которую надет зонд в количестве 0,1 мл на каждые 100 г, что также не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного.

В конце первого и второго месяца эксперимента определяли показатели водоэлектролитовыделительной функции почек.

Для гистологических исследований образцы тканей (печень, почка, сердце) фиксировали в 10% нейтральном формалине, после чего подвергали заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 7-8 микрон. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Изучение срезов проводилось в проходящем свете при помощи микроскопа Микмед-1 под увеличением 80×200×400.

Сущность способа подтверждается морфологически, где на фиг.1 отмечаются гистологические изменения у животных с изолированным введением сульфата кадмия, представленные проявлениями дистрофии, некроза, дисциркуляторных процессов и воспалительной реакции. Дистрофические процессы представлены гидропической дистрофией, проявления которых варьируют от частичной вакуолизации цитоплазмы эпителия канальцев и эндотелия капилляров до тотального колликвационного некроза клетки (А). Некроз проявляется наличием групп клеток, занимающих местами целиком поле зрения. Местами подобные изменения захватывали не только эпителий канальцев, но и клубочек. Альтеративные изменения встречаются преимущественно в корковом веществе. За счет дистрофических и некротических изменений просвет канальцев по большей части отсутствовует, местами просвет канальцев вакуолизирован (Б), клубочки набухшие, местами гиалинизированы. Собирательные трубочки в мозговом веществе в просвете с белковыми массами, интенсивно окрашенными эозином. Воспаление представлено крайне скудными смешанными периваскулярными инфильтратами, редко встречающимися на препарате (В). Дисциркуляторные изменения представлены полнокровием сосудов, преимущественно коркового вещества. Сосуды с утолщенной стенкой отечны, местами гиалинизированы.

Морфологические отличия между группами с изолированным введением соли кадмия и сочетанным введением сульфата кадмия и Ацизола (фиг.2) заключаются в уменьшении степени выраженности проявлений всех вышеуказанных патологических процессов. Количество нефроцитов с признаками кариолизиса по сравнению с группой с изолированным введением соли кадмия небольшое (А). Количество гиалинизированных клубочков, а также клубочков с выраженной гидропической дистрофией эндотелиоцитов крайне незначительно. Также уменьшено количество клеток эпителия канальцев, в которых гидропическая дистрофия достигает перехода в тотальный колликвационный некроз (Б). Количество канальцев с сохраненным просветом также значительно больше, чем в группе с изолированным введением сульфата кадмия (В).

Пример 1. Двум группам крыс-самцов (№1 - контроль, №2 - опыт с Ацизолом) линии Вистар массой 200-300 г вводили подкожно раствор сульфата кадмия в дозе 0,1 мг/кг каждый день в течение двух месяцев.

Ацизол вводили через зонд в желудок ежедневно в дозе 30 мг/кг группе №2. Через 1 месяц и через 2 месяца определяли некоторые показатели водоэлектролитовыделительной функции почек при спонтанном шестичасовом диурезе: уровень диуреза, клубочковой фильтрации, канальцевой реабсорбции, уровень экскреции натрия, калия, кальция, магния, фосфора; также определяли концентрацию белка в моче.

Анализ данных показал (табл.), что подкожное введение сульфата кадмия приводит к увеличению спонтанного шестичасового диуреза уже через 1 месяц интоксикации за счет существенного снижения канальцевой реабсорбции, при тенденции, в конце второго месяца, к снижению клубочковой фильтрации. Через 1 месяц и еще в большей степени через 2 месяца увеличилась экскреция кальция с мочой, как и фосфора. Экскреция ионов натрия и магния достоверно увеличилась через 2 месяца эксперимента. Концентрация белка в моче увеличилась уже через 1 месяц введения соли кадмия, через 2 месяца она увеличилась почти в пять раз. В группе №2, на фоне одновременного введения Ацизола отмечается менее выраженное увеличение спонтанного диуреза при снижении канальцевой реабсорбции, но с одновременным ростом клубочковой фильтрации.

Профилактическое применение Ацизола привело к достоверно меньшей выраженности роста экскреции ионов кальция (только через 2 месяца) и фосфора, а также достоверно меньшей концентрации белка в моче через 2 месяца.

Профилактическое влияние Ацизола на показатели электролитоводовыделительной функции почек при подкожном введении сульфата кадмия в дозе 0,1 мг/кг (М±м)   Диурез Фильтрац Реабс Кальций Натрий Калий Магний Фосфор Белок   0,116± 10,5± 98,86± 0,106± 11,78± 6,19± 1,189± 3,11± 2,59± Фон 0,006 0,70 0,076 0,006 0,45 0,35 0,04 0,16 0,26 Кадмий, 0,146± 9,35± 98,4± 0,196± 13,0± 6,20± 1,24± 4,42± 6,86± 1 мес 0,004* 0,244 0,045* 0,006* 0,58 0,40 0,03 0,28* 0,51* Кадмий, 0,17± 9,14± 98,12± 0,25± 17,01± 6,06± 1,79± 8,05± 14,03± 2 мес 0,004* 0,20* 0,037* 0,009* 0,56* 0,33 0,056* 0,45* 0,57* Кадмий+ 0,18± 12,97± 98,60± 0,11± 14,08± 5,81± 1,19± 3,86± 6,16± Ацизол, 0,006* 0,34* 0,042* 0,006 0,52* 0,35 0,065 0,32* 0,52* 1 мес   *) *) *)           Кадмий+ 0,223± 12,30± 98,18± 0,15± 17,66± 5,94± 1,799± 6,82± 8,73± Ацизол, 0,009* 0,49* 0,046* 0,012* 0,75* 0,43 0,10* 0,24* 0,82* 2 мес   *)   *)       *) *) *) - p относительно опыта

Выявленные гистологические изменения демонстрируют уменьшение проявлений кадмиевой нефропатии у животных с профилактическим применением Ацизола по сравнению с крысами с изолированным введением сульфата кадмия.

Из вышеизложенного видно, что профилактическое введение Ацизола является эффективным способом снижения и коррекции токсического действия кадмия при хроническом отравлении его соединениями.

Изобретение относится к экологии, медицине, токсикологии, экспериментальной биологии. Способ заключается во введении экспериментальным животным один раз в сутки ацизола в дозе 30 мг/кг одновременно с ежедневным введением раствора сульфата кадмия подкожно в дозе 0,1 мг/кг. Способ обеспечивает профилактику токсического действия кадмия при хроническом отравлении у экспериментальных животных. 2 ил., 1 табл.

Способ профилактики кадмиевой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении, отличающийся тем, что животным вводят ацизол один раз в сутки в дозе 30 мг/кг через зонд в желудок одновременно с ежедневным введением раствора сульфата кадмия подкожно в дозе 0,1 мг/кг.