СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ КАДМИЯ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ОТРАВЛЕНИИ Российский патент 2012 года по МПК G09B23/28 A61K31/593 A61K33/06 A61P13/12 

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, экологии, токсикологии и может быть использовано при исследовании методов профилактики хронического токсического действия тяжелых металлов, в частности кадмия, на функциональное состояние почек.

Кадмий относят к высокотоксичным элементам. Многие соединения кадмия ядовиты. Острые и хронические заболевания под воздействием кадмия развиваются при его применении в различных технологических процессах - при производстве щелочных батарей, производстве и применении кадмиевых пигментов, сварке металла [Раннее выявление профессиональных заболеваний. - ВОЗ, 1988. - 298 с.]. Кадмий называют металлом будущего [Трахтенберг И.М., Колесников B.C., Луковенко В.П. Тяжелые металлы во внешней среде. - Минск: Навука i тэхнiка, 1999. - 285 с.]. Постоянно возрастает его применение в атомной и ракетной технике, автоматике, при производстве полимеров, полупроводников. При хроническом кадмиозе в первую очередь поражаются мочевыводящая и половая системы, нарушается фосфорно-кальциевый обмен за счет конформационных изменений кальмодулина. Известно, что основной, а возможно и единственный путь поступления кадмия в клетки - через потенциалзависимые Ca-каналы. Полагают, что важнейшим механизмом токсического действия кадмия является блокирование SH-групп ферментов. Кроме того, он нарушает утилизацию в организме необходимых металлов - Са, Zn, Se, Cr, Fe. Недостаточность этих металлов, а также белков и витаминов увеличивает токсичность кадмия [Liu J. et al. // Toxicology. 2000. V. 147, n 3. P.157-166].

В медицине для уменьшения интоксикации тяжелыми металлами применяют комплексообразующие фармацевтические препараты, элиминирующие токсичные металлы и в то же время снижающие тяжесть течения и проявления интоксикаций (М.Д.Машковский, 2002, 237 с.; ВИДАЛЬ, 2002, 307 с.). Наиболее используемыми для этих целей являются тетацин (кальций-динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты), пентоксил (4-метил-5-оксиметилурацил, ДТПА), сукцимер (тримеркаптол) и др. Данные комплексообразующие препараты образуют с металлами стойкие комплексы, которые обычно хорошо растворимы в воде и при образовании в организме относительно быстро выводятся с мочой. Однако указанные препараты могут оказывать неблагоприятное воздействие на организм, особенно на функцию и паренхиму почек. Длительное применение препаратов может быть причиной избыточного выведения из организма микроэлементов, аллергических реакций, снижения уровня кальция в крови, расстройств желудочно-кишечного тракта.

Известен способ лечения и профилактики интоксикации тяжелыми металлами у животных, включающий применение комплексообразующего лекарственного средства - ксидифона (Патент RU 2089192, опубликованный 10.09.97. Бюл. №25, заявка 2008112298/13, от 02.04.2008, А61K 31/663, А61Р 39/00, авторы Рыжов А.А., Карпенко Л.Ю.). Ксидифон-монокалиевая, мононатриевая соль оксиэтилидендифосфоновой кислоты относится к комплексообразующим соединениям фосфонового ряда, дифосфонатам.

Общим недостатком известных препаратов является их достаточно высокая нефро- и гепатотоксичность. При длительном использовании препаратов ускоряется выведение с мочой кальция и таких важных микроэлементов, как железо, цинк, медь, что ухудшает общие биохимические характеристики крови, нарушается обмен веществ.

Кальций и кадмий являются ионами-антагонистами ввиду одинаковых по знаку электрических зарядов и схожести ионных радиусов. Таким образом, они способны взаимно подавлять присущее каждому из них действие. Длительные клинические и экспериментальные исследования указывают на значимость взаимодействий между кадмием и кальцием. Эти взаимодействия осуществляются на клеточном и молекулярном уровнях, где кадмий способен замещать кальций, вытеснять его из специфических мест связывания с лигандами, а также нарушать его пассивный транспорт [Peraza М.А., Ayala-Fierro F., Barber D.S., Casarez E., Rael L.T. Effects of micronutrients on metal toxicity./ Environmental Health Perspectives. - February, 1998. - Vol.106. - Supplement 1]. Учитывая этот факт, мы решили предложить способ профилактики кадмиевой интоксикации, основанный на антагонизме ионов кадмия и кальция. Этот способ осуществляется путем создания гиперкальциемии с помощью кальцийсодержащего вещества и витамина D для большего всасывания кальция. Нами были выбраны следующие лекарственные препараты: 10% раствор хлорида кальция (производитель ФГУП «Армавирская биологическая фабрика») и водный раствор колекальциферола (витамина D₃) - «Аквадетрим» фирмы МЕДАНА ФАРМА. Витамин D₃ является естественной формой витамина D, которая образуется у человека в коже под действием солнечных лучей, и обладает значительным гиперкальциемическим эффектом. По сравнению с витамином D₂ характеризуется на 25% более высокой активностью. Водный раствор витамина D₃ всасывается лучше, чем масляный раствор. Колекальциферол действует в кишечнике, увеличивая синтез эпителиальных кальциевых каналов и кальцийсвязывающего белка, ответственного за транспорт кальция через мембрану клеток слизистой оболочки кишечника и канальцы нефрона. В костной ткани 1,25-(OH)2D3 мобилизует кальций с использованием его вновь образовавшейся костной ткани для процессов минерализации [Glenville Jones. Current Understanding of the Molecular Actions of Vitamin D. - Physiol Rev 78:1193-1231, 1998].

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа профилактики токсического действия кадмия у экспериментальных животных при хроническом отравлении.

Решение этой задачи обеспечивает значительное снижение нефропатического действия кадмия при хроническом отравлении у экспериментальных животных путем снижения повреждающего действия кадмия на клетки за счет изменения кальциевого гомеостазиса, а именно создания экспериментальной гиперкальциемии.

Для достижения этого технического результата предлагается заявляемое изобретение - способ профилактики токсического действия кадмия у экспериментальных животных при хроническом отравлении, отличающийся тем, что животным одновременно ежедневно через зонд в желудок 1 раз в сутки вводят «Аквадетрим» в дозе 25000 МЕ/кг и 10% раствор хлорида кальция в дозе 1,5 мл/кг массы тела в течение 30 дней, а в последующие 30 дней данные препараты вводят ежедневно за 1 час перед подкожной инъекцией раствора сульфата кадмия в дозе 0,3 мг/кг в пересчете на металл, где на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 0,3 мг кадмия.

Предлагаемый способ отличается тем, что впервые применяется 10% раствор хлорида кальция и водный раствор гиперкальциемического гормона колекальциферола - «Аквадетрим» с целью профилактики хронической токсической нефропатии.

Ежедневное профилактическое введение хлорида кальция в дозе 1,5 мл/кг и «Аквадетрима» в дозе 25000 МЕ/кг через зонд в желудок в течение 30 дней, после чего данные препараты вводят предварительно за 1 час до подкожной инъекции раствора сульфата кадмия, приводит к снижению проявлений токсической кадмиевой нефропатии. Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа профилактики токсического действия кадмия у экспериментальных животных при хроническом отравлении, отличающегося тем, что животным одновременно ежедневно через зонд в желудок 1 раз в сутки вводят «Аквадетрим» в дозе 25000 МЕ/кг и 10% раствор хлорида кальция в дозе 1,5 мл/кг массы тела в течение 30 дней, а в последующие 30 дней данные препараты вводят ежедневно за 1 час перед подкожной инъекцией раствора сульфата кадмия в дозе 0,3 мг/кг в пересчете на металл, где на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 0,3 мг кадмия. В научно-медицинской литературе нами не выявлено описание использования сочетания витамина D с хлоридом кальция в качестве профилактического средства при хронической кадмиевой нефропатии, вызванной длительным введением сульфата кадмия, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе профилактики токсического действия кадмия путем снижения токсического действия тяжелого металла при хроническом отравлении, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом.

С целью создания экспериментальной гиперкальциемии в желудок через атравматичный зонд вводят хлорид кальция в количестве 0,15 мл и «Аквадетрим» в количестве 0,17 мл (2500 ME) на 100 г массы крысы, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного. Предлагаемые дозы хлорида кальция и кальцитриола вызывают повышение уровня кальция в крови интактных животных до 3,16±0,036 ммоль/л (фоновые значения - 2,14±0,047). Для получения токсического вещества сульфат кадмия растворяют в стерильной дистиллированной воде таким образом, что на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 0,3 мг кадмия (в пересчете на металл). На каждые 100 г веса крысы подкожно вводят 0,1 мл токсического раствора, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного. Раствор сульфата кадмия вводят подкожно с помощью инсулинового шприца одноразового использования в дозировке 0,3 мг/кг, ежедневно 1 раз в сутки в течение 30 дней двум группам животных (№1 и №2). Группе №2 каждый день внутрижелудочно через атравматичный зонд вводят одновременно 10% раствор хлорида кальция в дозе 1,5 мл/кг и «Аквадетрим» в дозе 25000 МЕ/кг в течение месяца, после чего эти препараты вводят предварительно за 1 час до подкожной инъекции сульфата кадмия.

По истечении времени эксперимента исследовали функциональное состояние почек, что включало определение диуреза (мл/час/100 г), скорости клубочковой фильтрации по клиренсу эндогенного креатинина (мл/час/100 г), канальцевой реабсорбции воды (%), осмолярности мочи, экскреции натрия, калия и белка с мочой. Крысы забивались с использованием тиопентала натрия. Полученные результаты в группе №2 сравнивали с контролем (гр. №1) и фоновыми показателями интактной группы.

Для гистологических исследований образцы тканей (почки) фиксировали в 10% нейтральном формалине, после чего подвергали заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 7-8 микрон. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Изучение срезов проводилось в проходящем свете при помощи микроскопа Микмед-1 под увеличением 80*200*400.

Сущность способа подтверждается морфологически, где на Фиг.1 в опытной группе (группа №1) выявлены выраженные изменения в канальцевом и клубочковом аппарате почек. Гистологические изменения в клубочке характеризовались увеличением пространства между капсулой и сосудистым клубочком (а), наличием набухших клеток эндотелия (б). Изолированное подкожное введение сульфата кадмия приводило к увеличению просвета канальцев (в), в просвете которых определялся тканевой детрит (г). Клетки канальцевого аппарата находились в состоянии гидропической дистрофии (д), отмечались участки некробиоза (е) и полного некроза эпителиоцитов, ядра которых находились в состоянии лизиса (ж).

На Фиг.2 при гистологическом исследовании почек в группе №2 морфологическая картина характеризовалась снижением степени выраженности всех вышеописанных патологических изменений. Канальцевый и клубочковый аппарат почек полностью сохранял свою структуру, отмечались участки лимфоидно-гистиоцитарной пролифирации (а). Полностью отсутствовали очаги некроза канальцевого аппарата, отмечалось снижение количества эпителиоцитов с признаками гидропической дистрофии (б).

Пример. Двум группам крыс-самцов линии Вистар массой 250-300 г подкожно вводили раствор сульфата кадмия в дозе 0,3 мг/кг каждый день в течение 30 дней. Группе №2 каждый день внутрижелудочно через атравматичный зонд одновременно вводят раствор хлорида кальция в дозе 1,5 мл/кг и «Аквадетрим» в дозе 25000 МЕ/кг в течение месяца, а в последующие 30 дней эти же препараты вводят предварительно за 1 час до подкожной инъекции сульфата кадмия. По окончании эксперимента исследовали функциональное состояние почек в условиях 6-часового спонтанного диуреза, что включало в себя определение: объема диуреза, скорости клубочковой фильтрации по клиренсу эндогенного креатинина, канальцевой реабсорбции воды, экскреции с мочой ионов натрия, калия и кальция, экскреции белка с мочой, осмолярность мочи.

Содержание натрия, калия в плазме крови и моче определяли методом пламенной фотометрии, с помощью пламенного анализатора жидкостей ПАЖ-1, концентрацию кальция и креатинина определяли спектрофотометрически (PV1251C) с помощью наборов «Кальций-Арсеназо-Агат», «Креатинин-Агат», «ООО» «Агат-Мед» (г.Москва, Россия). Концентрацию белка определяли спектрофотометрически (PV1251C) по методу Лоури. Для определения осмотической концентрации мочи использовали метод криоскопии, измерения выполняли на миллиосмометре «OSMOMAT-2». Результаты всех серий опытов обработаны статистически с применением критерия «t» Стьюдента на ПЭВМ Pentium-4 с использованием программы Prizma 4.0.

Результаты экспериментальных исследований позволили выявить увеличение объема спонтанного диуреза у животных, подкожно получавших сульфат кадмия, относительно фоновых животных, несмотря на снижение скорости клубочковой фильтрации. Полиурическая реакция была обусловлена достоверным снижением канальцевой реабсорбции воды (табл.1). Подкожное введение кадмия приводило к формированию выраженной протеинурии, одновременно с этим происходило значительное снижение осмолярности мочи (табл.1, табл.5) относительно значений интактной группы животных.

Таблица 1. Влияние гиперкальциемии на основные процессы мочеобразования и экскрецию белка с мочой у крыс на фоне введения сульфата кадмия (М±м). Условия опыта Стат. показат. Процессы мочеобразования Белок экскреция, мг/час/100 г Диурез, мл/час/100 г F, мл/час/100 г R_H2O% Фон М±m 0,06±0,002 19,44±0,75 99,70±0,011 1,21±0,019 CdSO₄ п/к (месяц) М±m 0,19±0,009 16,03±0,45 98,89±0,089 2,12±0,045 р *) *) *) *) CaCl₂ + «Аквадетрим» в/ж + CdSO₄ п/к М±m 0,10±0,006 19,71±0,91 99,36±0,048 1,33±0,023 р #) #) #) #) Примечание: (*) - достоверное (р≤0,001) изменение по сравнению с фоном; (#) - достоверное (р≤0,001) изменение относительно месяца введения CdSO₄; F - скорость клубочковой фильтрации, - канальцевая реабсорбция воды.

Электролитовыделительная функция почек экспериментальных животных, получавших изолированное подкожное введение сульфата кадмия, характеризовалась повышением экскреции натрия, кальция и калия относительно фоновых значений интактной группы животных, что объяснялось наличием выраженных изменений в фильтрационном заряде и канальцевой реабсорбции катионов (табл.2, табл.3, табл.4).

Таблица 2. Влияние гиперкальциемии на почечную обработку натрия у крыс на фоне подкожного введения сульфата кадмия (М±м). Условия опыта Стат. показат. Процессы почечной обработки натрия E_Na F_Na R_Na мкмоль/час/100 г % I II III IV V Фон M±m 9,08±0,163 2680±64,96 99,66±0,011 CdSO₄ п/к (месяц) M±m 13,09±0,140 2099±60,82 99,37±0,026 р *) *) *) CaCl₂+«Аквадетрим» в/ж+CdSO₄ п/к M±m 12,28±0,158 2353±74,61 99,46±0,019 р *)#) *)#) *)##) Примечание: (*) - достоверное (р≤0,001) изменение по сравнению с фоном; (#) - достоверное (р≤0,001) изменение относительно месяца введения CdSO₄; (##)- достоверное (р≤0,01) изменение относительно месяца введения CdSO₄; E_Na - экскреция Na, F_Na - фильтрационный заряд Na, R_Na - канальцевая реабсорбция Na.

Таблица 3. Влияние гиперкальциемии на почечную обработку калия у крыс в условиях подкожного введения сульфата кадмия (M±м). Условия опыта Стат.показат. Процессы почечной обработки натрия E_K F_K мкмоль/час/100 г I II III IV Фон М±m 7,02±0,024 75,60±0,80 CdSO₄ п/к (месяц) М±m 8,16±0,066 88,79±0,76 р *) *) CaCl₂ + «Аквадетрим» в/ж + CdSO₄ п/к М±m 7,18±0,029 77,22±0,91 р #) #) Примечание: (*) - достоверное (р≤0,001) изменение по сравнению с фоном; (#) - достоверное (р≤0,001) изменение относительно месяца введения CdSO₄; F_K - фильтрационный заряд калия, E_K - экскреция калия.

Таблица 4. Влияние гиперкальциемии на почечную обработку кальция у крыс в условиях подкожного введения сульфата кадмия (М±м). Условия опыта Стат. показат. Процессы почечной обработки кальция E_Ca F_Ca R_Ca ммоль/час/100 г % I II III IV V Фон М±m 0,145±0,004 27,61±0,57 99,46±0,018 CdSO₄ п/к (месяц) М±m 0,325±0,013 19,12±0,28 98,30±0,045 р *) *) *) CaCl₂ + «Аквадетрим» в/ж + CdSO₄ п/к М±m 0,289±0,010 21,65±0,60 98,86±0,015 р #) #) #) Примечание: (*) - достоверное (р≤0,001) изменение по сравнению с фоном; (#) - достоверное (р≤0,001) изменение относительно месяца введения CdSO₄; F_Ca - фильтрационный заряд кальция, E_Ca - экскреция кальция, R_Ca - канальцевая реабсорбция кальция.

Внутрижелудочное ведение хлорида кальция и «Аквадетрима» способствовало профилактике нарушений водовыделительной функции почек в условиях хронической кадмиевой интоксикации, что характеризовалось снижением объема спонтанного диуреза относительно показателей группы животных, получавших изолированное подкожное введение кадмия, вследствие наличия менее выраженных изменений в скорости клубочковой фильтрации и канальцевой реабсорбции воды. Профилактическое введение гиперкальциемической смеси способствовало снижению степени протеинурии, повышая при этом показатели осмолярности мочи относительно значений группы животных, получавших подкожное введение сульфата кадмия (табл.1, табл.5). Применение хлорида кальция и «Аквадетрима» повышало канальцевую реабсорцию катионов и нормализовывало их фильтрационные заряды в условиях хронической кадмиевой интоксикации, что способствовало снижению экскреции натрия, калия и кальция относительно изолированной кадмиевой интоксикации (табл.2, табл.3, табл.4).

Таблица 5. Влияние гиперкальциемии на показатели осмолярности мочи в условиях подкожного введения сульфата кадмия (М±м). Условия опыта Стат. показатель Osm мосм/л I II III Фон М±m 2,120±0,065 CdSO₄ п/к (месяц) М±m 1,801±0,045 Р *) CaCl₂ + «Аквадетрим» в/ж + CdSO₄ п/к М±m 2,097±0,081 р #) Примечание: (*) - достоверное (р≤0,001) изменение по сравнению с фоном; (#) - достоверное (р≤0,001) изменение относительно месяца введения CdSO₄.

Таким образом, из вышеизложенного следует, что профилактическое применение хлорида кальция в сочетании с «Аквадетримом» в условиях хронической кадмиевой интоксикации является эффективным способом профилактики токсического действия кадмия при хроническом отравлении.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, экологии, токсикологии и может быть использовано при изучении методов профилактики хронического токсического действия кадмия на организм, в частности на почки. Для этого в условиях проведения эксперимента токсическое действие кадмия моделируют ежедневным введением животному раствора сульфата кадмия подкожно в дозе 0,3 мг/кг в пересчете на металл, где на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 0,3 мг кадмия. В качестве профилактических средств используют «Аквадетрим» в дозе 25000 МЕ/кг и 10% раствор хлорида кальция в дозе 1,5 мл/кг массы тела. Указанные препараты вводят одновременно ежедневно через зонд в желудок 1 раз в сутки в течение 30 дней. В последующие 30 дней данные препараты вводят ежедневно за 1 час перед подкожной инъекцией раствора сульфата кадмия. Способ обеспечивает эффективное снижение токсического действия кадмия на организм, в частности нефропатического действия, за счет изменения кальциевого гомеостазиса. 2 ил., 5 табл., 1 пр.

Способ профилактики токсического действия кадмия у экспериментальных животных при хроническом отравлении, отличающийся тем, что животным одновременно ежедневно через зонд в желудок 1 раз в сутки вводят «Аквадетрим» в дозе 25000 МЕ/кт и 10%-ный раствор хлорида кальция в дозе 1,5 мл/кг массы тела в течение 30 дней, а в последующие 30 дней данные препараты вводят ежедневно за 1 час перед подкожной инъекцией раствора сульфата кадмия в дозе 0,3 мг/кг в пересчете на металл, где на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 0,3 мг кадмия.