СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ КАДМИЯ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ОТРАВЛЕНИИ Российский патент 2012 года по МПК G09B23/28 A61K33/06 A61P13/12 

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, экологии, токсикологии и может быть использовано при исследовании механизмов токсического действия кадмия на функциональное состояние почек.

Избыточное поступление тяжелых металлов в организм человека неблагоприятно сказывается на его здоровье. Особую опасность представляет кадмий, который в значительных количествах из разных источников попадает в среду обитания человека, концентрируется в почве и водоемах и по цепи вода - почва - растения - животные попадает в продукты питания в количествах, значительно превосходящих его естественное содержание [Тарасенко Н.Ю., Воробьева Р.С., Шабалина Л.П., Цветкова Р.П. Кадмий во внешней среде и его влияние на обмен кальция. // Гигиена и санитария. - 1975. - №9. - С.22-25]. В связи с его высокой токсичностью и кумулятивной способностью появляется острая необходимость в разработке легкодоступных и эффективных средств, препятствующих его поступлению в организм.

В настоящее время довольно хорошо изучены патогенетические механизмы токсического действия данного ксенобиотика: нарушение кальциевого гомеостазиса клетки, изменение активности клеточных органелл и усиление ПОЛ [Аксенова М.Е. Тяжелые металлы: механизмы нефротоксичности. / Нефрология и диализ. - 2000. - Т.2. - №1-2]. Кадмий способен вытеснять кальций из специфических мест связывания с лигандами, а также нарушать его пассивный транспорт, так как является конкурентным биометаллом по отношению к кальцию. Выяснено, что для проникновения в кровь и клетки организма кадмий использует кальциевую транспортную систему. В условиях истощения запасов кальция отмечается активация трансмембранного переноса кадмия [Viarengo A., Nicotera P. Possible role of Са2+ in heavy metals cytotoxicity. Comp.Biochem.Physiol., 1991; 100C(l/2): 81-84].

Известен способ профилактики кадмиевой нефропатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении (Патент 2366459 С1, опубликованный 10.09.2009. Бюл. №25, заявка 2008114894/13, от 15.04.2008, МКИ A61K 51/00, A61K 31/4164, A61P 39/02, авторы: Кокаев Р.И., Брин В.Б.), заключающийся в том, что животным вводят ацизол один раз в сутки в дозе 30 мг/кг через зонд в желудок одновременно с ежедневным введением раствора сульфата кадмия подкожно в дозе 0,3 мг/кг.

Недостатком данного способа является то, что с целью профилактики используется синтетическое металлорганическое соединение, эффекты длительного применения которого находятся на стадии экспериментального изучения. Выбранный нами препарат хлорида кальция является естественным для организма соединением, а сам кальций относится к группе эссенциальных элементов в организме человека и животных.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа профилактики токсического действия кадмия.

Решение этой задачи обеспечивает профилактику токсического действия кадмия при хроническом отравлении путем создания экспериментальной гиперкальциемии, оказывающей протекторную роль.

Кальций и кадмий являются ионами-антагонистами ввиду одинаковых валентностей и схожих ионных радиусов. Таким образом, они способны взаимно подавлять присущее каждому из них действие. Предлагаемый способ профилактики токсического действия кадмия основан на изменении кальциевого гомеостазиса, а именно - на создании гиперкальциемии.

Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение - способ профилактики токсического действия кадмия у экспериментальных животных при хроническом отравлении, отличающийся тем, что животным вводят 10% раствор хлорида кальция 1 раз в сутки ежедневно через зонд в желудок в дозе 1,5 мл/кг массы тела, предварительно, за 1 час перед ежедневным подкожным введением раствора сульфата кадмия в дозе 0,3 мг/кг в пересчете на металл, где на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 0,3 мг кадмия.

Предлагаемый способ отличается тем, что в качестве профилактического средства используют 10% раствор хлорида кальция, вводимый животным 1 раз в сутки ежедневно через зонд в желудок в дозе 1,5 мл/кг массы тела, предварительно, за 1 час перед подкожным введением раствора сульфата кадмия в дозе 0,3 мг/кг в пересчете на металл в течение 30 дней.

Введение сульфата кадмия на фоне экспериментальной гиперкальциемии приводит к снижению проявлений токсической нефропатии и уменьшению нефротоксичности сульфата кадмия. Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа профилактики токсического действия кадмия у экспериментальных животных при хроническом отравлении, отличающийся тем, что животным вводят 10% раствор хлорида кальция 1 раз в сутки ежедневно через зонд в желудок в дозе 1,5 мл/кг массы тела, предварительно, за 1 час перед ежедневным подкожным введением раствора сульфата кадмия в дозе 0,3 мг/кг в пересчете на металл, где на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 0,3 мг кадмия. В научно-медицинской литературе нами не выявлено описание использования хлорида кальция в качестве профилактического средства при хронической кадмиевой нефропатии, вызванной длительным введением сульфата кадмия, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе профилактики токсического действия кадмия, путем снижения токсического действия тяжелого металла при хроническом отравлении, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом.

С целью создания экспериментальной гиперкальциемии 10% раствор хлорида кальция вводят через атравматичный зонд в желудок в количестве 1,5 мл/кг массы крысы в течение 30 дней, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного. Предлагаемая дозировка хлорида кальция вызывает повышение уровня кальция в крови интактных животных до 2,92±0,046 ммоль/л (фоновые значения - 2,15±0,047). Для получения токсического вещества сульфат кадмия растворяют в стерильной дистиллированной воде таким образом, что на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 0,3 мг кадмия (в пересчете на металл). На каждые 100 г веса крысы инъецируют 0,1 мл токсического раствора. Введение металла подкожное в дозе 0,3 мг/кг, ежедневно 1 раз в сутки в течение 30 дней.

По истечении времени эксперимента (30 дней) исследовали функциональное состояние почек, что включало определение диуреза (мл/час/100 г), клубочковой фильтрации (мл/час/100 г), канальцевой реабсорбции воды (%), осмолярности мочи, экскреции натрия, калия, белка. Крысы забивались с использованием тиопентала. Полученные результаты в группе №2 сравнивали с контролем (группа №1) и фоновыми показателями интактной группы.

Для гистологических исследований образцы тканей (почки) фиксировали в 10% нейтральном формалине, после чего подвергали заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 7-8 микрон. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Изучение срезов проводилось в проходящем свете при помощи микроскопа Микмед-1 под увеличением 80×200×400.

Сущность способа подтверждается морфологически, где на Фиг.- 1 в группе №1 выявляются выраженные дистрофические явления в клубочковом и канальцевом аппарате почек, наблюдаются выраженные альтеративные, некробиотические изменения в тканях почек в виде: отека и дистрофических изменений в клубочке (а), выраженной паренхиматозно-белковой дистрофии (б) и частичного некроза канальцев (в), увеличения пространства между капсулой Боумена-Шумлянского и сосудистым клубочком (г), очагового кровоизлияния в клубочковом аппарате (д).

При морфологическом исследовании почек в группе №2 (Фиг.- 2) отмечаются менее выраженные проявления токсического поражения почек: относительная сохранность клубочка (а), умеренная степень паренхиматозно-белковой дистрофии канальцев (б), наличие неизмененных канальцев (в).

Пример. Двум группам крыс-самцов линии Вистар массой 250-300 г вводили подкожно раствор сульфата кадмия в дозе 0,3 мг/кг каждый день в течение 30 дней. Группа №1 получала изолированное введение металла. Группе №2 вводили в желудок через атравматичный зонд 10% раствор хлорида кальция в дозе 1,5 мл/кг за 1 час до подкожной инъекции сульфата кадмия. По окончании эксперимента исследовали функциональное состояние почек в условиях 6-часового спонтанного диуреза, что включало в себя определение: объема диуреза, скорости клубочковой фильтрации по клиренсу эндогенного креатинина, канальцевой реабсорбции воды, экскреции с мочой ионов натрия, калия и кальция, экскреции белка с мочой, осмолярности мочи.

Содержание натрия, калия в плазме крови и моче определяли методом пламенной фотометрии, с помощью пламенного анализатора жидкостей ФПА-1, концентрацию кальция и креатинина определяли спектрофотометрически (PV1251C) с помощью наборов «Кальций-Арсеназо-Агат», «Креатинин-Агат», «ООО» «Агат-Мед» (г.Москва, Россия). Концентрацию белка определяли спектрофотометрически (PV1251C) по методу Лоури. Для определения осмотической концентрации мочи использовали метод криоскопии, измерения выполняли на миллиосмометре «OSMOMAT-2». Результаты всех серий опытов обработаны статистически с применением критерия «t» Стьюдента на ПЭВМ Pentium-4 с использованием программы Prizma 4.0.

Результаты исследования показали, что у крыс при хронической интоксикации кадмием (группа №1) происходило достоверное увеличение объема 6-часового спонтанного диуреза, относительно значений интактной группы животных, что было обусловлено значительным снижением канальцевой реабсорбции воды при уменьшении скорости клубочковой фильтрации. В группе с экспериментальной гиперкальциемией (№2) отмечались схожие изменения, однако выраженность их была меньшей, нежели при изолированном введении металла. У животных, получавших подкожно сульфата кадмия (группа №1), определялось достоверное повышение экскреции белка по сравнению с показателями интактной группы животных. Протеинурия отмечалась и в сочетанной модели, но степень ее проявления была достоверно меньшей (табл.1).

Экскреция натрия увеличивалась при парентеральном введении металла (группа №1), несмотря на снижение фильтрационного заряда электролита. Натрийурез был обусловлен уменьшением канальцевой реабсорбции катиона. Гиперкальциемия в сочетании с кадмиевой интоксикацией также увеличивала выведение электролита с мочой. Однако в этом случае экскреция натрия была достоверно ниже, чем в первой группе, за счет более высоких значений канальцевой реабсорбции катиона (табл.2).

Таблица 1 Влияние внутрижелудочного (в/ж) введения раствора хлорида кальция на основные процессы мочеобразования и экскрецию белка с мочой у крыс при подкожном (п/к) введении сульфата кадмия (М±м) Условия опыта Стат. показатель Процессы мочеобразования Белок экскреция, мг/час/100 г Диурез, мл/час/100 г F мл/час/100 г Фон М±m 0,06±0,002 19,44±0,75 99,70±0,011 1,21±0,019 Сульфат кадмия п/к М±m 0,19±0,009 16,03±0,45 98,89±0,089 2,12±0,045 р *) **) *) *) CaCl₂ в/ж + Сульфат кадмия п/к М±m 0,11±0,005 17,47±0,57 99,26±0,044 1,48±0,029 р *)#) - *)##) *)#) Примечание: (*) - достоверное (р≤0,001) изменение по сравнению с фоном; (**) - достоверное (р≤0,05) изменение по сравнению с фоном; (#) - достоверное (р≤0,001) изменение относительно изолированного введения сульфата кадмия; (##) - достоверное (р≤0,01) изменение относительно изолированного введения сульфата кадмия; F - скорость клубочковой фильтрации, R_H2O - канальцевая реабсорбция воды.

Таблица 2 Влияние внутрижелудочного (в/ж) введения раствора хлорида кальция на точечную обработку натрия у крыс при подкожном (п/к) введении сульфата садмия (М±м) Условия опыта Стат. показатель Процессы почечной обработки натрия E_Na F_Na R_Na мкмоль/час/100 г % I II III IV V Фон М±m 9,08±0,163 2680±64,96 99,66±0,011 Сульфат кадмия п/к М±m 13,09±0,140 2099±60,82 99,37±0,026 р *)   *) CaCl₂ в/ж + Сульфат кадмия п/к М±m 11,60±0,450 2486,38±73,375 99,49±0,023 р *)#) *) *)##) Примечание: (*) - достоверное (р≤0,001) изменение по сравнению с фоном; (#) - достоверное (р≤0,001) изменение относительно изолированного введения сульфата кадмия; (##) - достоверное (р≤0,01) изменение относительно изолированного введения сульфата кадмия; E_Na - экскреция Na, F_Na - фильтрационный заряд Na, R_Na - канальцевая реабсорбция Na.

Подкожное введение сульфата кадмия приводило к значительному кальциурезу, вызванному снижением канальцевой реабсорбции электролита. Фильтрационный заряд катиона при этом уменьшался. Сочетание хронической кадмиевой интоксикации с гиперкальциемией также характеризовалось усилением экскреции кальция, но менее выраженным. Это объяснялось более высокими цифрами канальцевой реабсорбции катиона (табл.3)

Таблица 3 Влияние внутрижелудочного (в/ж) введения раствора хлорида кальция на почечную обработку кальция у крыс при подкожном (п/к) введении сульфата кадмия (М±м) Условия опыта Стат. показатель Процессы почечной обработки кальция Е_Са F_Ca R_Ca ммоль/час/100 г % I II III IV V Фон M±m 0,145±0,004 27,61±0,57 99,46±0,018 Сульфат кадмия п/к M±m 0,325±0,013 19,12±0,28 98,30±0,045 р *) *) *) CaCl₂ в/ж + Сульфат кадмия п/к M±m 0,217±0,012 23,51±0,39 98,98±0,028 р *)#) *) ##) *)##) Примечание: (*) - достоверное (р≤0,001) изменение по сравнению с фоном; (#) - достоверное (р≤0,001) изменение относительно изолированного введения сульфата кадмия; (##) - достоверное (р≤0,05) изменение относительно изолированного введения сульфата кадмия. F_Ca - фильтрационный заряд кальция, E_Ca - экскреция кальция, R_Ca - канальцевая реабсорбция кальция.

Осмолярность мочи уменьшалась в моделях с хронической кадмиевой интоксикацией, но в группе №2 была достоверно выше, чем у животных с изолированным введением металла (табл.4).

Таблица 4 Влияние внутрижелудочного (в/ж) введения раствора хлорида осмолярности мочи при подкожном (п/к) введении сульфата кадмия (М±m) Условия опыта Стат. показатель Osm мосм/л I II III Фон М±m 2,120±0,065 Сульфат кадмия п/к М±m 1,201±0,015 р *) CaCl₂ в/ж + Сульфат кадмия п/к М±m 1,987±±0,037 р *)#) Примечание: (*) - достоверное (р≤0,001) изменение по сравнению с фоном; (#) - достоверное (р≤0,001) изменение относительно изолированного введения сульфата кадмия; O_sm - осмолярность мочи.

Таким образом, из вышеизложенного следует, что формирование хронической кадмиевой интоксикации на фоне экспериментальной гиперкальциемии, вызванной ежедневным внутрижелудочным введением 10% раствора хлорида кальция в течение 30 дней, характеризуется менее выраженной картиной нефропатии, т.е. гиперкальциемия способна уменьшать нефротоксичность сульфата кадмия.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, экологии, токсикологии и может быть использовано при изучении методов профилактики токсического действия кадмия на организм. Для этого в условиях эксперимента индуцируют хроническое отравление кадмием путем ежедневного подкожного введения раствора сульфата кадмия в дозе 0,3 мг/кг в пересчете на металл, где на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 0,3 мг кадмия. Для профилактики токсического действия животным вводят 10% раствор хлорида кальция 1 раз в сутки ежедневно через зонд в желудок в дозе 1,5 мл/ кг массы тела за 1 час перед введением раствора сульфата кадмия. Способ уменьшает нефротоксичность сульфата кадмия. 2 ил., 4 табл., 1 пр.

Способ профилактики токсического действия кадмия у экспериментальных животных при хроническом отравлении, отличающийся тем, что животным вводят 10%-ный раствор хлорида кальция 1 раз в сутки ежедневно через зонд в желудок в дозе 1,5 мл/ кг массы тела, предварительно, за 1 ч перед ежедневным подкожным введением раствора сульфата кадмия в дозе 0,3 мг/кг в пересчете на металл, где на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 0,3 мг кадмия.