СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ СВИНЦА У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ОТРАВЛЕНИИ Российский патент 2009 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к экологии, медицине, токсикологии, экспериментальной биологии и может быть использовано при исследовании методов профилактики хронического токсического действия тяжелых металлов, в частности свинца, на функциональное состояние почек.

Одной из актуальных проблем современной медицины и нефрологии является изучение влияние тяжелых металлов на состояние органов мочеполовой системы у населения. В работах последних лет подчеркивается рост частоты почечной патологии у населения, проживающих в экологически неблагоприятных районах. (Ермаченко А.Б., Шовтутова В.И. 1985; Ansary R.A. et al., 1991). Являясь основным органом выведения многих металлов из организма, почки испытывают повышенную токсическую нагрузку, и поэтому служат мишенью токсического действия. Свинцу особо присуща способность поражать канальцевый эпителий почек, именно поэтому почки оказываются одним из критических органов развития интоксикации в целом (Киреева Е.П., 2007).

В связи с ухудшением экологической обстановки и прогрессирующим увеличением концентрации свинца в окружающей среде поиск эффективных средств профилактики его токсического действия на организм человека является одной из актуальных проблем медицины.

Известно множество детоксикантов, способных предотвращать или ослаблять токсическое действие тяжелых металлов на организм. К ним относятся тиоловые соединения - унитиол, тиосульфат натрия, сукцимер, различные комплексоны - пентацин, динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, дефероксамин и др. (Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2-х томах. Т.2. - Харьков «Торсинг», 1998. С.212-220). Но наряду с терапевтическим эффектом они могут вызывать различные побочные эффекты: расстройства ЖКТ, аллергические реакции, лейкопению, тромбоцитопению и др. Также они способны выводить из организма микроэлементы и такие жизненно важные ионы, как железо, кальций и др. и вызывать нарушение обменных процессов, что затрудняет их длительное и профилактическое применение.

В качестве детоксиканта предпочтение было отдано ацизолу. Ацизол представляет собой комплексное цинкорганическое соединение. Его химическая структура бис (1-винилимидазол) цинкдиацетат. Ацизол разрабатывался как противогипоксическое средство при отравлениях угарным газом и является единственным лекарственным средством для профилактики и спасения жизни при указанном поражении. Ацизол уникальный препарат по своим фармакологическим свойствам и широте использования, не оказывающий токсического действия на организм человека и животного, не имеющий побочных эффектов. Ацизол восполняет концентрацию цинка в ферментативных системах, способствует оптимизации тканевого дыхания, улучшает кислородсвязывающие свойства крови, благодаря антигипоксантному и антиоксидантному действию ацизол обладает мембранопротекторным свойством.

Ранее ацизол применялся в качестве гепатопротектора, средства для лечения псориаза, антидота при отравлениях монооксидом углерода, адаптогена, коронарно-активного антиишемического и антиаритмического средства.

Наиболее близким к заявляемому является способ профилактики токсического действия свинца с использованием селенита натрия, взятый за прототип (Галачиев С.М., Джиоев Ф.К. Новые технологии в снижении токсического действия свинца с помощью селенита натрия //Владикавказский медико-биологический вестник. - 2003. - Т4. - Вып.5-6. - С.64-67), заключающийся в том, что животные получали ацетат свинца ежедневно с кормом в разовой дозе 30 мг/кг массы животного. Одновременно с этим животные получали два раза в неделю с кормом селенит натрия в дозе 0,4 мг/кг массы животного. Продолжительность эксперимента 6 месяцев.

Недостатком прототипа является то, что ацетат свинца и селенит натрия используются как подкорм в рационе, что снижает точность контроля дозозависимого эффекта.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа профилактики токсического действия свинца у экспериментальных животных при хроническом отравлении.

Решение этой задачи обеспечивает значительное снижение токсического действия свинца при хроническом отравлении у экспериментальных животных путем оптимизации тканевого дыхания, улучшения кислородсвязывающих свойств крови. Одним из основных патофизиологических механизмов токсического действие свинца на организм в целом является присущая ему способность негативно влиять на процессы тканевого дыхания. Тканевое дыхание - это совокупность окислительно-восстановительных процессов в клетках, органах и тканях, протекающих с участием молекулярного кислорода. Тканевое дыхание является важнейшей частью обмена веществ и энергии в организме. Интенсивность тканевого дыхания наиболее высока в тканях почек, возможно именно поэтому почки являются высокочувствительными к токсическому влиянию тяжелого металла. Ацизол в свою очередь способствует оптимизации тканевого дыхания, улучшая кислородсвязывающие свойства крови, тем самым снижая нарушения процессов тканевого дыхания, способствуя стабилизации патологического процесса.

Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение, способ профилактики токсического действия свинца у экспериментальных животных при хроническом отравлении, включающий одновременное введение детоксиканта и ацетата свинца, в качестве детоксиканта применяют ацизол, вводимый животным ежедневно подкожно дозе 30 мг/кг, одновременно с ежедневным введением ацетата свинца через зонд в желудок в дозе 40 мг/кг.

Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что, во-первых, осуществляется дозированное введение ацетата свинца и ацизола, что облегчает точный контроль дозозависимого эффекта, а во-вторых, впервые применяется фармакологический препарат - ацизол с целью профилактики хронической токсической нефропатии.

Между признаками заявляемого способа и результатом существует следующая причинно-следственная связь, ацизол, способствуя стабилизации процессов тканевого дыхания, уменьшая токсическое воздействие свинца на организм, обладает профилактическим действием.

Профилактическое введение ацизола, подкожно в дозировке 30 мг/кг, каждый день, одновременно с внутрижелудочным введением раствора ацетата свинца в дозировке 40 мг/кг на протяжении 16 дней приводит к снижению проявлений токсической нефропатии, восстановлению функций почек. Заявляемый способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа профилактики токсического действия ацетата свинца у экспериментальных животных при хроническом отравлении, включающего подкожное введение ацизола каждый день, одновременно с ежедневным введением раствора ацетата свинца через атравматичный зонд в желудок в течение 16 дней, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе профилактики токсического действия свинца, путем уменьшения патологического воздействия тяжелого металла, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом.

Для получения токсического вещества ацетат свинца растворяют в стерильной дистиллированной воде таким образом, что на единицу раствора, равную 0,2 мл, приходится 8 мг свинца (в пересчете на металл). На каждые 100 г веса крысы вводят 0,1 мл токсического раствора, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного. Раствор ацизола приготавливают таким образом, что на каждую единицу раствора, равную 1 мл, приходится 30 мг ацизола. Раствор ацизола для каждой инъекции готовят ежедневно перед введением. Раствор ацетата свинца вводят через атравматичный зонд в желудок в дозировке 40 мг/кг, ежедневно 1 раз в сутки в течение 16 дней двум группам животных (№1 и №2). Одновременно, с первого дня введения ацетата свинца, группе №2 каждый день подкожно вводят ацизол в дозировке 30 мг/кг с помощью инсулинового шприца одноразового использования.

По истечении времени эксперимента (16 дней) исследовали функциональное состояние почек, что включало определение диуреза (мл/час/100 г), клубочковой фильтрации (мл/час/100 г), канальцевой реабсорбции воды (%), осмолярности мочи, экскреции натрия, калия, белка.

Крысы забивались с использованием тиопентала. Полученные результаты в группе №2 сравнивали с контролем (гр. №1) и фоновыми показателями интактной группы.

Для гистологических исследований образцы тканей (почки) фиксировали в 10% нейтральном формалине, после чего подвергали заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 7-8 микрон. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Изучение срезов проводилось в проходящем свете при помощи микроскопа Микмед-1 под увеличением 80·200·400.

Сущность способа подтверждается морфологически, где на Фиг.1 в опытной группе выявлены выраженные альтеративные, некробиотические и некротические изменения в тканях почек, отмечались: кровоизлияния в клубочек (а); расширение просвета канальцев (б), некроз отдельных групп канальцев (в), некробиоз всех канальцев (г) на фоне их сплошной гидропической дистрофии (д). В клубочках выявлены выраженный оттек, дистрофические изменения, имеются мелкоочаговые кровоизлияния в строму. На Фиг.2 при гистологическом исследовании почек в группе №2 выявлены менее выраженные дистрофические и некробиотические изменения в тканях почек: регенерация канальцев (а), умеренное расширение протоков канальцев (б), лимфогистиоцитарная инфильтрация стромы (в), которая является показателем регенераторного процесса.

Пример. Двум группам крыс-самцов линии Вистар массой 200-300 г вводили через атравматичный зонд в желудок раствор ацетата свинца в дозе 40 мг/кг каждый день в течение 16 дней. Одновременно, с первого дня введения ацетата свинца группе №2 каждый день подкожно вводился ацизол в дозировке 30 мг/кг. Через 16 дней исследовали функции почек в условиях 6-часового спонтанного диуреза, проводили определение: объема диуреза, скорости клубочковой фильтрации по эндогенному креатинину, канальцевой реабсорбции воды, экскреции с мочой ионов натрия, калия и кальция, экскреции белка с мочой, осмолярность мочи.

Содержание натрия, калия в плазме крови и моче определяли методом племенной фотометрии, с помощью племенного анализатора жидкостей ПАЖ-1, концентрацию кальция и креатинина определяли спектрофотометрически (СФ-26) с помощью наборов «Кальций-Арсеназо-Агат», «Креатинин-Агат», «ООО» «Агат-Мед» (г. Москва, Россия). Концентрацию белка определяли спектрофотометрически (СФ-26) по методу Лоури. Осмолярность мочи определялась с помощью Осмоммат-300. Результаты всех серий опытов обработаны статистически с применением критерия «t» Стьюдента на ПЭВМ Pentium-3 с использованием программы Prizma 2.2.

Результаты исследования показали (табл.1 и 2), что у крыс при хронической интоксикации ацетатом свинца (1 группа) происходило достоверное увеличение объема 6-часового спонтанного диуреза (р<0,05), несмотря на существенное снижение скорости клубочковой фильтрации (СКФ) (р<0,05). Полиурическая реакция была обусловлена снижением реабсорбции воды (р<0,05), одновременно с этим происходило увеличение экскреции Na (p<0,05), К (р<0,05), Са (р<0,05), и содержание белка в моче (р<0,05), происходило снижение осмолярности мочи (р<0,05), что свидетельствует о нарушении концентрирующей функции почек. На фоне одновременного введения ацизола в группе №2 происходило достоверное снижение 6-часового спонтанного диуреза (р<0,05) по сравнению с группой №1 с изолированным введением ацетата свинца, вследствие достоверного увеличения канальцевой реабсорбции воды (р<0,05) несмотря на повышение СКФ (р<0,05). По сравнению с группой №1 отмечались достоверно меньшие значения экскреции Na (р<0,05), К (р<0,05), Са (р<0,05). Одновременно с этим происходило повышение осмолярности мочи (р<0,05), следовательно применение ацизола способствует профилактике изменений концентрирующей функции почек. Применение ацизола способствовало снижению степени протеинурии (р<0,05) у крыс при хронической интоксикации ацетата свинца.

Токсическое воздействие ацетата свинца при внутрижелудочном введении вызывало изменения в электролитном составе плазмы крови (табл.3). Снижение уровня натрия (р<0,05) связано с высокими потерями натрия с мочой из-за более раннего поражения канальцевого аппарата почек и снижения канальцевой реабсорбции катиона (р<0,05), (табл.4). Применение ацизола на фоне интоксикации ацетата свинца достоверно снижало степень выраженности изменений электролитного состава крови (р<0,05).

Таблица 1.
Влияние ацизола на основные процессы мочеобразования и экскрецию белка с мочой у крыс в условиях 6-часового спонтанного диуреза, на фоне внутрижелудочного введения ацетата свинца 40 мг/кг (М±м). Условия опыта Стат. показат. Процессы мочеобразования Белок экскреция мг/час/100 г Диурез, мл/час/100 г СКФ, мл/час/ 100 г КРВ, % Фон M±m 0,0765±0,00106 17,84±0,1103 99,57±0,0048 1,213±0,024   p - - - - 16 дней ацетат свинца (40 мг/кг) + ацизол (30 мг/кг) M±m 0,11±50,0014 16,49±0,092 99,31±0,0072 1,906±0,028 p *) *) *) ⁺) 16 дней ацетат свинца (40 мг/кг) M±m 0,136±0,0025 14,72±0,11 99,07±0,02 2,795±0,042 p ⁺) *) ⁺) ⁺) Примечание: (*) - достоверное (р<0,05) изменение по сравнению с фоном.

Список используемых сокращений:

• СКФ - скорость клубочковой фильтрации;

• КРВ - канальцевая реабсорбция воды.

Таблица 2.
Влияние ацизола на экскрецию электролитов и осмолярность мочи у крыс в условиях 6-часового спонтанного диуреза на фоне внутрижелудочного введения ацетата свинца в дозе 40 мг/кг (М±м). Условия опыта Стат. показат. Экскреция электролитов мкмоль/час/100 г Осмолярность мочи (осм/л) ЕК ENa ЕСа Фон М±m 6,36±0,157 9,053±0,1303 0,173±0,0033 2,125±0,0695 16 дней Ацетат свинца (40 мг/кг) + ацизол(30 мг/кг) М±m 7,695±0,154 11,76±0,327 0,185±0,0042 1,416±0,0573 p *) *) ⁺) *) 16 дней Ацетат свинца (40 мг/кг) М±m 8,54±0,194 13,53±0,53 0,205±0,0081 0,9254±0,031 p *) *) ⁺) *) Примечание: (*) - достоверное (р<0,05) изменение по сравнению с фоном.

Таблица 3.
Влияние ацизола на концентрацию основных электролитов в плазме крови на фоне внутрижелудочного введения ацетата свинца в дозе 40 мг/кг веса (М±м). Условия опыта Стат. показат. Концентрация электролитов в плазме крови (ммоль/л). Са Na К I II III IV V Фон М±m 2,139±0,022 143,48±0,28 4,259±0,045 16 дней ацетат свинца (40 мг/кг) + ацизол (30 мг/кг) М±m 2,240±0,0209 140,6±0,503 5,017±0,056 Р *) *) *) 16 дней ацетат свинца (40 мг/кг) М±m 2,054±0,0221 138,0±0,478 5,59±0,114 Р *) ^*) *) Примечание: (*) -достоверное (р<0,05) изменение по сравнению с фоном.

Таблица 4.
Влияние ацизола на реабсорбцию кальция, натрия в условиях 6-часового спонтанного диуреза на фоне внутрижелудочного введения ацетата свинца в дозе 40 мг/кг (М±м) Условия опыта Стат. показат. Реабсорбция (%) Са Na I II VI VII Фон М±m 99,30±0,0153 99,63±0,0052 16 дней ацетат свинца (40 мг/кг) + ацизол (30 мг/кг) М±m 99,23±0,0194 99,47±0,0148 p *) *) 16 дней ацетат свинца (40 мг/кг) М±m 98,96±0,0407 99,30±0,0273 p *) ^٭) Примечание: (*) - достоверное (р<0,05) изменение по сравнению с фоном.

Из вышеизложенного следует, что применение ацизола является эффективным способом профилактики токсического действия свинца при хроническом отравлении.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, в частности к экспериментальной токсикологии, и может быть использовано при профилактике токсического действия свинца у экспериментальных животных. Для этого с одновременным введением подкожно ацизола в дозе 30 мг/кг ежедневно вводят ацетат свинца через зонд в желудок в дозе 40 мг/кг. Данный способ обеспечивает эффективную профилактику токсического действия свинца при хроническом отравлении за счет точности контроля дозозависимого эффекта. 4 табл., 2 ил.

Способ профилактики токсического действия свинца у экспериментальных животных при хроническом отравлении, включающий одновременное введение детоксиканта и ацетата свинца, отличающийся тем, что в качестве детоксиканта применяют ацизол, вводимый животным ежедневно подкожно в дозе 30 мг/кг, одновременно с ежедневным введением ацетата свинца через зонд в желудок в дозе 40 мг/кг.