СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПРИРОДНЫХ И РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ И ДРУГИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ Российский патент 2009 года по МПК C12P21/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу выделения рекомбинантных белков из бактериальных штаммов-продуцентов, белков из природных объектов и других соединений биологического происхождения, и может быть использовано в биохимии, протеомике, фармакологии.

Известен способ выделения рекомбинантных белков с помощью гидрозоля наноалмазов детонационного синтеза [Бондарь B.C., Поздняков И.О., Пузырь А.П. Применение наноалмазов для разделения и очистки белков. // Физики твердого тела, 2004, т.46, вып.4, с.737-739].

Недостатки этого способа заключаются в том, что наноалмазы применялись только в виде гидрозоля и только для выделения рекомбинантных белков.

Известен способ выделения белка из белоксодержащей массы, включающий перевод белков в растворенное состояние, с последующим разделением. Разделение выполняют путем смешивания растворенных белков с алмазными частицами с последующим отделением частиц алмаза, связавших белок, от несвязанных с частицами растворенных белков, после чего связанный с частицами белок отделяют от алмаза смыванием буферной системой с реагентом, разрывающим связь белок - алмазная частица. Алмазные частицы имеют размеры меньше 20 нм. Частицы со связанным белком отделяют от остальных белков центрифугированием [РФ, п.з. №2001122054/13, МПК C12S 3/14, опубл. 2004.06.10 (прототип)].

Недостатки этого способа заключаются в том, что он применяется только для выделения рекомбинантного белка, количество частиц наноалмазов с размером кластеров до 20 нм, образующихся в процессе взрывного синтеза, мало, их выделение из смеси наноалмазов трудоемко, что приводит к удорожанию сорбента и снижает экономический эффект его практического использования.

Техническим результатом изобретения является разработка простого, экспрессного и эффективного способа очистки природных и рекомбинантных белков и других биологических соединений.

Технический результат достигается тем, что в способе выделения природных и рекомбинантных белков и других биологических соединений, заключающемся в добавлении наноалмазного сорбента непосредственно в исходный экстракт, содержащий целевое вещество, получаемый из исходного сырья, содержащего выделяемое вещество, перемешивании, отделении частиц сорбента, промывании, десорбции выделяемых веществ при условиях, обеспечивающих десорбцию только выделяемого вещества, новым является то, что в качестве сорбента используют порошок или гидрозоль наноалмазов детонационного синтеза с размером частиц от 20 до 1400 нм.

Заявляемое техническое решение отличается от прототипа тем, что позволяет проводить выделение рекомбинантных и природных белков и других биологических соединений. В качестве сорбента используют порошок или гидрозоль наноалмазов детонационного синтеза с размером частиц от 20 до 1400 нм. Промывают и десорбируют белки и другие биологические соединения при рН 4,5-9,0. Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «новизна». Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, не выявлены в других технических решениях при изучении данной и смежной областей техники и, следовательно, обеспечивают заявляемому решению соответствие критерию «изобретательский уровень».

На фиг.1 представлена электрофореграмма образцов рекомбинантной люциферазы на этапах ее выделения из исходного экстракта клеток Е. coli с помощью наноалмазов: слева - исходный экстракт, справа - финальные препараты фермента (α и β субъединицы люциферазы), полученные в разных экспериментах после десорбции белка с поверхности наночастиц элюирующим буфером. На фиг.2 дана электрофореграмма образцов глутатионредуктазы на этапах выделения фермента из экстракта печени быка с помощью наноалмазов: 1 - исходный экстракт, 2 - конечный препарат, 3 - маркерные белки, стрелкой показано положение глутатионредуктазы. На фиг.3 дана электрофореграмма образцов лизоцима при его очистке из смеси белков куриного яйца с применением наноалмазов: 1 - исходный препарат, 2 - препарат после обработки наноалмазами, 3, 4 - десорбция балластных примесей последовательной отмывкой осадка частиц буфером со щелочным значением рН, 5-7 - элюция лизоцима последовательными отмывками осадка слабокислым буфером. На фиг.4 приведены данные спектрального анализа препаратов гуминоподобных соединений из мумие при их выделении с помощью наноалмазов: (исходный) - исходный экстракт, (после НА) - супернатант после обработки экстракта частицами наноалмаза, (элюат 1 и 2) - гуминоподобные компоненты, последовательно десорбированные с поверхности наночастиц элюирующим буфером, (элюат 3) - гуминоподобные компоненты, элюированные раствором хелатора. На фиг.5 показаны результаты электрофореза, согласно которьм возможно разделение кольцевой и линейной формы плазмидной ДНК pUC19: 1 - контрольный раствор pUC19 (кольцевая форма), 2, 3 - кольцевая форма pUC19 после инкубации частицами наноалмазов, 4 - ДНК-маркер 1 Kb, 5 - контрольный раствор pUC19 (линейная форма), 6, 7 - линейная форма pUC19 после инкубации с частицами наноалмазов. Элекрофореграмма, приведенная на фиг.6, иллюстрирует выделение с помощью наноалмазов низкомолекулярной фракции из исходного препарата гистонов (тип II-A), поставляемого фирмой Sigma: 1 - исходный препарат, содержащий высокомолекулярную и низкомолекулярную фракцию гистонов, 2 - конечный препарат низкомолекулярных гистонов.

Выделение природных и рекомбинантных белков или иных биологических соединений проводят из исходного экстракта, который получают разрушением клеточной биомассы любым из известных способов (обработка ультразвуком, применение пресса Френча, замораживание-оттаивание и т.д.) или кислотно-щелочной экстракцией из исходного природного сырья. Последующее удаление клеточных обломков (клеточный дебрис) или нерастворимых остатков природного сырья проводят любым известным способом (центрифугирование, фильтрование и т.д.). В качестве исходного экстракта может быть использован коммерческий препарат.

Адсорбент - наноалмазы детонационного синтеза используют либо в виде сухого порошка, либо в виде гидрозоля с концентрацией частиц 1-10 мас.%.

В исходный экстракт добавляется порошок или гидрозоль наноалмазов, смесь перемешивают, затем отделяют частицы сорбента центрифугированием или декантацией, промывают и проводят десорбцию выделяемого вещества (белки или иные биологические соединения).

Пример 1

К водному белковому экстракту, полученному из биомассы бактериальных клеток Е. coli и содержащему рекомбинантную люциферазу, добавляют порошок наноалмазов (размерный диапазон наночастиц 20-1400 нм) и после тщательного перемешивания частицы собирают центрифугированием. Осадок частиц с адсорбированными белками дважды промывают водой для удаления не адсорбированных на наночастицы балластных белковых примесей. Искомый белок десорбируют 20 мМ ТрисНСl буфером (рН 7,0), ресуспендируя в нем частицы и удаляя их центрифугированием. Процедура выделения фермента занимает не более 40 минут. По данным SDS-электрофореза полученный белок имеет высокую степень чистоты (фиг.1), выход целевого продукта, оцениваемый по люминесцентной активности, составляет не менее 45-60%.

Пример 2

Клетки печени разрушают в 20 мМ ТрисНСl буфере (рН 7,0) ультразвуковой обработкой суспензии и удаляют клеточный дебрис центрифугированием. В полученный супернатант (исходный экстракт) добавляют порошок наноалмазов (размерный диапазон наночастиц 20-1400 нм) и после перемешивания собирают частицы центрифугированием. Осадок дважды промывают исходным буфером для удаления балластных микропримесей, содержащихся в сыром осадке. Фермент десорбируют с поверхности частиц 100 мМ элюирующим буфером, содержащим 2,5-5 мМ окисленного глутатиона. Время выделения искомого белка составляет 40-50 минут. По данным SDS-электрофореза (фиг.2) полученный препарат фермента имеет высокую степень чистоты, выход целевого продукта, оцениваемый по ферментативной активности, составлял 35-40%.

Пример 3

В исходный водный раствор смеси белков из куриного яйца добавляют 1,0 мас.% гидрозоля наноалмазов (размерный диапазон наночастиц 20-500 нм) и после перемешивания частицы собирают центрифугированием. Осадок дважды промывают 50 мМ Трис-НСl буфером со щелочными значениями рН (8,8-9,0) для удаления балластных белковых примесей. Элюцию искомого фермента проводят последовательными отмывками осадка 50 мМ натрий-ацетатным буфером, имеющим кислые и слабокислые значения рН (4,5-5,6). Процедура выделения фермента занимает не более 40-50 минут. По данным SDS-электрофореза (фиг.3) препараты лизоцима получены в практически гомогенном виде.

Пример 4

В исходный экстракт, содержащий гуминоподобные компоненты и полученный из Мумие алтайского очищенного таб. 0,2 №20, поставляемого фирмой ЗАО «Эвалар» (г.Барнаул), добавляют 10,0 мас.% гидрозоля наноалмазов (размерный диапазон наночастиц 20-250 нм) и после перемешивания частицы собирают центрифугированием. Осадок промывают водой для удаления не связавшихся с частицами гуминоподобных компонентов. Элюцию компонентов и их разделение проводят последовательными отмывками осадка 110 мМ фосфатным буфером (рН 7,0) и водным раствором 55 мМ ЭДТА. Из данных спектрального анализа образцов (фиг.4) видно, что гуминоподобные компоненты из исходного экстракта адсорбируются частицами наноалмаза практически полностью, а последовательная промывка осадка разными элюентами позволяет провести их десорбцию и разделение. Вся процедура занимает не более 50 минут.

Пример 5

Нативную кольцевую плазмидную ДНК pUC19, являющуюся исходным экстрактом, выделяют из бактериальных клеток стандартным методом. Линейную форму с тупыми концами получают рестрикцией Smal нативной ДНК pUC19. К 2 мкл ТЕ-буферного раствора, содержащего молекулы ДНК (~1000 нг), добавляют 20 мкл гидрозоля наноалмазов с концентрацией 0,5 мас.%. Инкубирование и последующее центрифугирование 5 минут при 16000 g проводят при комнатной температуре. Супернатант наносят на агарозный гель и проводят электрофорез. По данным электрофореза (фиг.5) линейная форма ДНК адсорбируется на частицах наноалмаза, что позволяет отделить от нее кольцевую плазмидную ДНК pUC19, которая не адсорбируется на наночастицах и остается в растворе. Вся процедура занимает 15-20 мин.

Пример 6

Коммерческий препарат гистонов (тип II-A) из тимуса теленка (фирма Sigma) выполняет роль исходного экстракта. Раствор гистонов с концентрацией 1 мг/мл готовят в дистиллированной воде и в соотношении 10:1 смешивают с водной суспензией наноалмазов (10 мас.%). Частицы отделяют от раствора центрифугированием и однократно промывают водой. Десорбцию фракции низкомолекулярных гистонов проводят 0,15 М фосфатным буфером (рН 7.0), который содержит 6 М мочевины. Вся процедура занимает 25-30 мин и позволяет получить фракцию низкомолекулярных гистонов, имеющих массу около 10 кДа (фиг.6), которая не содержит высокомолекулярные гистоны.

Заявляемый способ имеет следующие преимущества:

- высокую экспрессность - вся процедура выделения белков и других биологических соединений с помощью наноалмазов занимает не более 40-50 минут;

- простоту в исполнении - позволяет исключить из схемы очистки специализированное хроматографическое оборудование и значительно сократить временные затраты;

- эффективность - выход искомых целевых продуктов высокого качества, например белков, составляет от 35% до 60%.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в биохимии, протеомике и фармакологии при очистке рекомбинантных белков из бактериальных штаммов-продуцентов, белков из природных объектов и других соединений биологического происхождения. При осуществлении способа сорбент добавляют непосредственно в исходный экстракт, перемешивают, отделяют частицы сорбента, промывают и десорбируют выделяемые вещества. Экстракт содержит целевое вещество. В качестве сорбента используют порошок или гидрозоль наноалмазов детонационного синтеза с размером частиц от 20 до 1400 нм. Изобретение обеспечивает простоту осуществления, быструю и эффективную очистку природных и рекомбинантных белков и других биологических соединений. 6 ил.

Способ выделения природных и рекомбинантных белков и других биологических соединений, заключающийся в добавлении наноалмазного сорбента непосредственно в исходный экстракт, содержащий целевое вещество, получаемый из исходного сырья, содержащего выделяемое вещество, перемешивании, отделении частиц сорбента, промывании, десорбции выделяемых веществ при условиях, обеспечивающих десорбцию только выделяемого вещества, отличающийся тем, что в качестве сорбента используют порошок или гидрозоль наноалмазов детонационного синтеза с размером частиц от 20 до 1400 нм.