СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВРЕМЕНИ САМОСБОРКИ ФИБРИН-МОНОМЕРА Российский патент 2009 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике, и может быть использовано для исследования крови при нарушениях в системе гемостаза.

Система свертывания крови характеризуется как каскад ферментативных реакций с превращением на конечном этапе коагуляции фибриногена под влиянием тромбина в фибрин. Конечный этап свертывания включает ряд ферментативных и неферментативных реакций. Вначале от α- и β-цепей фибриногена тромбин отщепляет два пептида А и два пептида В. Молекулярная масса каждого из этих пептидов составляет около 4 кДа. Оставшаяся основная молекула с мол. массой около 300 кДа (фибрин-мономер) при взаимодействии с аналогичными фибрин-мономерами образует димер фибрина, затем тетрамер, октамер и т.д., в результате чего образуется крупномолекулярный комплекс, обозначаемый как «растворимый фибрин» или «растворимые фибрин-мономерные комплексы». Достигнув определенной критической массы (около 12000-15000 кДа), они коагулируют, превращаясь в волокна и сгустки фибрина. Этот фибрин нестоек и легко растворяется в 5М мочевине или 1%-ной уксусной кислоте, но он немедленно дополнительно фиксируется фибринстабилизирующим фактором (фактором ХIIIа), который формирует дисульфидные связи между γ-цепями фибрин-мономеров.

Удлинение времени на конечном этапе свертывания, связанные с дефектами отделения фибринопептидов А и/или В от фибриногена и взаимодействием фибрин-мономеров между собой (самосборка фибрин-мономера), характерны для врожденных или приобретенных дисфибриногенемий, при которых часто наблюдается геморрагический синдром. С другой стороны, ускорение времени самосборки фибрин-мономера может быть одной из причин гиперкоагуляционного синдрома, ведущего к внутрисосудистому свертыванию крови.

Известен способ определения активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ), основанный на измерении времени свертывания плазмы крови человека при ее рекальцификации в условиях стандартизированной контактной и фосфолипидной активации свертывания (Баркаган З.С., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. Издание 2-е дополненное. - М.: «Ньюдиамед», 2001. - С.79-81).

Недостатком известного способа является влияние на АПТВ дефицита факторов коагуляции (XII, XI, X, IX, VIII, V, II), наличия их ингибиторов и присутствия в плазме крови антикоагулянтов прямого действия (гепарина и др.).

Кроме того, известный способ мало чувствителен к нарушениям самосборки фибрин-мономера и редко является показательным в этом отношении.

Известен способ определения продолжительности самосборки фибрина в плазме, включающий обработку фибриногена тромбином непосредственно в плазме в присутствии мочевины, добавление буфера с низкой ионной силой и последующее определение времени самосборки фибрина (авторское свидетельство SU 1210094, опубл. 07.02.1986 г., реферат и описание изобретения).

Определяют долю продолжительности самосборки фибрина в общей продолжительности фибринообразования.

Реактивы.

1. Мочевина, 40% на 0,02М ацетатном буфере с рН 5,2

2. Раствор тромбина 0,1%, 1% в 0,14М хлориде натрия

3. Боратный буфер 0.0075М, рН - 7,6

Материал для исследования. Цитратная плазма крови.

Ход определения. К 0,2 мл исследуемой плазмы добавляют 0,2 мл 40% раствора мочевины и 0,2 мл 0,1% раствора тромбина. Смешивают и оставляют на водяной бане при +37°С на 10 мин.

0,1 мл смеси после экспозиции переносят в пробирку, куда предварительно наливают 0,3 мл боратного буфера. В момент внесения включают секундомер, выключая его при появлении сгустка, регистрируя продолжительность самосборки фибрина. Показания секундомера, например 16,3 с.

В пробирку на водяной бане при +37°С вносят 0,3 мл боратного буфера, добавляют 0,033 мл 40% раствора мочевины и 0,033 мл исследуемой плазмы, все смешивают. К смеси добавляют 0,033 мл 1% раствора тромбина, немедленно включают секундомер и отмечают момент образования сгустка, регистрируя общую продолжительность фибринообразования. Показания секундомера, например 58,7 с.

Чтение результатов. Расчет доли самосборки в общей продолжительности фибринообразования в исследуемой плазме: (16,3:58,7)×100=27,7%.

К недостаткам способа определения продолжительности самосборки фибрина в плазме следует отнести:

1. Невозможность использования тромбина, стандартного по активности.

2. Невозможность проведения коагулометрического исследования.

3. Трудоемкость и длительность теста.

4. Низкая точность способа.

Заявляемый способ лишен этих недостатков: тест легко выполняется на коагулометрах различной конструкции с использованием стандартного по активности тромбина, имеет более высокую точность при оценке как замедления, так и укорочения времени самосборки в плазме больных с различными видами нарушений гемостаза.

Авторами разработан высокоэффективный и высокоточный способ определения времени самосборки фибрин-мономера, позволяющий определять как удлинение, так и укорочение времени самосборки фибрин-мономера.

Техническим результатом заявляемого способа является повышение точности определения времени самосборки фибрин-мономера.

Технический результат достигается тем, что в реагирующую смесь вводят мочевину в концентрации 150-250 г/л и используют тромбин активностью 40-60 NIH/мл или 4-6 с.

Способ осуществляют следующим образом.

Реактивы и оборудование:

1. Цитрат натрия, трехзамещенный, 3,8% раствор, получают растворением 3,8 г цитрата натрия в 100 мл дистиллированной воды.

2. Тромбин человека (лиофильно высушенный), 500 NIH, фирма «Технология-Стандарт», Россия.

3. Буфер трис-НСl концентрированный (20:1), 1,0 М, 5 мл, рН 7,3-7,4, фирма «Технология-Стандарт», Россия.

4. Мочевина, осч, фирма «Merck», Германия.

5. Физиологический (0,9%) раствор хлорида натрия.

6. Дистиллированная вода.

7. Центрифуга ОПН-8.

8. Коагулометр Минилаб-701 фирмы Юнимед, Россия.

9. Пробирки стеклянные объемом 20 мл.

10. Цилиндр стеклянный, мерный, на 100 мл.

Приготовление реактивов.

1. Разведение тромбина: во флакон с лиофильно высушенным тромбином добавляют 10,0 мл физиологического раствора хлорида натрия и при легком покачивании растворяют реагент в течение 5 мин.

2. Приготовление рабочего буферного раствора, содержащего мочевину: концентрированный буфер в объеме 2,0 мл и навеску мочевины (18 г) вносят в мерный цилиндр и общий объем доводят дистиллированной водой до 100 мл. В результате получают рабочий буферный раствор следующего состава - трис-HCl 0,01 М, рН 7,3-7,4, содержащий мочевину в концентрации 180 г/л.

Подготовка исследуемой плазмы больного и пула контрольной нормальной плазмы крови (взятой у здоровых людей).

Кровь получают из локтевой вены самотеком через иглу в пластиковую пробирку, содержащую 0.1М раствор цитрата натрия (соотношение крови и цитрата 9:1). Кровь центрифугируют 5 мин при скорости вращения 1000 об./мин (200g). Полученную богатую тромбоцитами плазму повторно центрифугируют в течение 20 минут при 4000 об./мин (1200g). Полученную бедную тромбоцитами плазму используют для проведения исследования.

Для приготовления пула контрольной нормальной плазмы в равной пропорции смешивают образцы бедной тромбоцитами плазмы от 8-10 здоровых людей.

Ход определения

В кювету коагулометра вносят 0,1 мл исследуемой плазмы и выдерживают в термостатируемой ячейке 1 мин при +37°С. Затем добавляют 0,05 мл рабочего буферного раствора, содержащего мочевину в концентрации 180 г/л, и инкубируют там же при +37°С в течение 1 мин. Переносят кювету в измерительный канал, затем добавляют 0,05 мл раствора тромбина, тотчас запускают измерительный канал и регистрируют время свертывания в конечном этапе.

Оценка полученных результатов. По результатам обследования здоровых людей (42 наблюдения) время свертывания в конечном этапе составляет 24,5-37,8 с (Х=30,7; σ=3,01; m=0,46).

Удлинение времени самосборки фибрин-мономера свыше указанного верхнего предела свидетельствует о врожденной или приобретенной дисфибриногенемии, либо тормозящем влиянии ингибиторов самосборки фибрин-мономера (продукты деградации фибрина - D-димер, парапротеины). Укорочение времени самосборки фибрин-мономера показывает на наличие тромбогенного сдвига на конечном этапе свертывания.

Апробация предлагаемого способа.

Апробация заявляемого способа проведена на 25 больных с удлинением времени свертывания на конечном этапе (I группа), в том числе с геморрагическими мезенхимальными дисплазиями (14), с болезнью Виллебранда (7), циррозами печени (4), а также на 27 больных (II группа) с укорочением времени самосборки фибрин-мономера при гиперкоагуляционных состояниях, а именно с гематогенными тромбофилиями (11), тяжелыми гестозами последнего триместра беременности (9), септическими состояниями (7). Результаты обследования больных с нарушениями конечного этапа свертывания по предлагаемому способу представлены в таблице 1. Из таблицы следует, что предлагаемый способ позволяет оценить как замедление, так и ускорение самосборки фибрин-мономера в соответствующих типовых клинических ситуациях.

Необходимо отметить, что заявленный способ имеет существенные отличия от известного SU 1210094, а именно использование стандартизированного по коагуляционной активности тромбина, значительное сокращение времени проведения анализа, возможность коагулометрического проведения исследования, повышение точности результатов.

В частности:

1. Повышение точности заявленного способа достигается использованием тромбина стандартной активности 4-6 с (или 40-60 NIH/мл).

Описываемая в способе-прототипе активность применяемого тромбина (0,1% или 0,1 г/100 мл) не может быть стандартизирована, поскольку тромбин представляет собой фермент, активность которого трудно сопоставить с его весом в разных партиях данного реагента различных производителей.

Для пояснения выбора диапазона активности используемого тромбина приводим таблицу 2, в которой показано влияние активности тромбина на результат в заявляемом способе. В ней приведены средние данные по результатам 10-кратного повтора оценки времени самосборки фибрин-мономера. Как видно из таблицы 2, оптимальной активностью тромбина в заявляемом способе является диапазон от 40 до 60 NIH/мл. Более низкая активность тромбина (менее 40 NIH/мл) дает неустойчивые результаты и удлиняет время исследования. Применение активности тромбина свыше 60 NIH/мл экономически нецелесообразно.

2. Кроме того, в заявляемом способе время, необходимое для выполнения анализа, составляет 2,5-3 мин, в то время как способ-прототип требует для своего выполнения 15-17 мин, т.е. в среднем в 5,8 раз меньше.

3. Принято проводить оценку свертывания крови или полученной из нее плазмы с использованием коагулометров. Оценка результатов в заявляемом способе может проводиться на коагулометре любой конструкции. В то же время определение времени свертывания в способе-прототипе выполняется лишь мануально и не улавливается коагулометрически из-за низкой концентрации фибриногена в оцениваемой смеси («крошковидное» свертывание). Последнее обусловлено высоким, в 12 раз, разведением плазмы в ходе выполнения анализа по способу-прототипу. В заявляемом способе плазма в ходе выполнения анализа разводится в 2 раза. Кратно приведенным разведениям снижается количество необходимого субстрата свертывания для тромбина - фибриногена.

4. При выполнении заявляемого способа определения времени самосборки фибрин-мономера повышается точность определений по сравнению со способом-прототипом. В таблице 3 показано, что коэффициент вариации результатов в заявляемом способе более, чем в 3 раза ниже аналогичного показателя в способе-прототипе, и составляет 4,4%. Расчет коэффициента вариации получаемых результатов представлен в предлагаемом способе коагулометрически и способе-прототипе мануально.

Обоснование необходимого диапазона концентрации мочевины для оценки конечного этапа свертывания в предложенном способе.

Для выбора необходимой концентрации мочевины при определении времени самосборки фибрин-мономера использовали образцы буферного раствора мочевины с концентрацией от 50 до 350 г/л (таблица 4). Установлено, что оптимальные ее концентрации лежат в диапазоне от 150,0 до 250,0 г/л. Снижение концентрации мочевины ниже 150,0 г/л приводит к тому, что время образования сгустка укорачивается до 17,1-19,0 с и менее и достоверно не отличается у больных разных групп. С другой стороны, использование концентрации мочевины свыше 250,0 г/л приводит к значительному удлинению времени свертывания и снижению воспроизводимости метода. Для определения оптимального диапазона концентрации мочевины в тест-системе при определении времени самосборки фибрин-мономера применили соотношение С=К/Б,

где С - соотношение;

К - время самосборки фибрин-мономера в контрольной нормальной пулированной плазме;

Б - время самосборки фибрин-мономера в плазме больного.

Из исследований, приведенных в таблице 3, можно наблюдать, что необходимый диапазон концентраций мочевины в тест-системе составляет 150-250 г/л, так как именно в этом диапазоне концентраций мочевины соотношения остаются неизменными и имеют диагностическое значение.

Для оценки воспроизводимости заявляемого способа использовали коэффициент вариации CV(%). Коэффициент вариации способа при исследовании в разные дни проведения исследований не превышает 8,5%.

Таким образом, заявляемый способ определения времени самосборки фибрин-мономера обладает высокой точностью и позволяет диагностировать врожденные или приобретенные дисфибриногенемии, при которых часто наблюдается геморрагический синдром, а также выявлять гиперкоагуляционный синдром, ведущий к внутрисосудистому свертыванию крови.

Способ определения времени самосборки фибрин-мономера
Таблица 1 I группа II группа Больной (ая) Время самосборки ФМ (разница от нормального показателя, %) Больной (ая) Время самосборки ФМ (разница от нормального показателя, %) 1. Н.М. 38,4(+25,1%) 1. У.М. 22,4(-27,0%) 2. З.В. 39,5(+28,7%) 2. З.А. 24,6(-19,9%) 3. Н.Г. 45,2(+47,2%) 3. К.Р. 20,6(-32,9%) 4. А.И. 39,6(+29,0%) 4. А.И. 17,1(-44,3%) 5. Т.И. 46,7(+52,1%) 5. В.О. 14,7(-52,1%) 6. И.Г. 41,4(+34,9%) 6. Л.Г. 25,3(-17,6%) 7. И.А. 44,6(+45,3%) 7. И.Д. 24,9(-18,9%) 8. Т.С. 39,8(+29,6%) 8. Х.С. 22,4(-27,0%) 9. Н.В. 38,9(+26,7%) 9. Р.Д. 20,3(-33,9%) 10. О.А. 43,0(+40,1%) 10. Р.А. 21,6(-29,6%) 11. Э.С. 47,0(+53,1%) 11. А.С. 22,3(-27,4%) 12. О.О. 56,7(+84,7%) 12. Л.Л. 21,8(-29,0%) 13. А.П. 49,4(+60,9%) 13. А.Т. 24,6(-19,0%) 14. Е.Р. 39,4(+28,3%) 14. И.Р. 17,7(-42,4%) 15. В.И. 44,5(+45,0%) 15. В.И. 19,6(-36,2%) 16. А.Н. 46,3(+50,8%) 16. О.Л. 15,9(-48,2%) 17. Г.К. 48,2(+57,0%) 17. Д.А. 24,6(-19,9%) 18. Е.А. 41,3(+34,5%) 18. Э.А. 22,6(-26,4%) 19. Т.А. 40,3(+31,3%) 19. С.А. 23,0(-25,1%) 20. В.В. 48,2(+57,0%) 20. В.Р. 19,1(-37,8%) 21. Ю.Н. 42,7(+39,1%) 21. Д.Н. 20,3(-33,9%) 22. А.К. 38,3(+24,8%) 22. Д.К. 20,3(-33,9%) 23. Т.Г. 39,4(+28,3%) 23. Б.Г. 21,4(-30,3%) 24. С.С. 42,4(+38,1%) 24. Б.С. 23,5(-23,5%) 25. А.Д. 49,4(+60,9%) 25. Р.Л. 16,5(-46,3%)     26. С.П. 18,7(-39,1%)     27. А.А. 24,3(-20,3%) I группа II группа Средний результат по I группе больных (X±m) 43,6±0,9 Средний результат по II группе больных (X±m) 21,1±0,6 Нормативные показатели по результатам обследования 42 здоровых доноров Средний контрольный результат (Х±m) 30,7±0,5 Средний контрольный результат (Х±m) 30,7±0,5

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВРЕМЕНИ САМОСБОРКИ ФИБРИН-МОНОМЕРА
Таблица 2 Концентрация тромбина, NIH/мл 20 30 40 50 60 70 80 Время в с в заявляемом способе 77,2±9,6 46,5±5,9 32,7±0,9 31,3±0,6 29,1±0,7 28,2±0,7 28,8±0,6 влияние активности тромбина на результат в заявляемом способе

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВРЕМЕНИ САМОСБОРКИ ФИБРИН-МОНОМЕРА
Таблица 3 Коэффициент вариации оценки времени самосборки фибрин-мономера По заявляемому способу, с по способу-прототипу, % 32,0 22 33,0 27 30,5 23 32,8 31 31,9 23 35,7 22 33,5 27 32,6 29 31,8 30 34,2 33 Коэффициент вариации - 4,39% Коэффициент вариации - 15,09% коэффициент вариации результатов в заявляемом способе и в способе-прототипе

Способ определения времени самосборки фибрин-мономера
Таблица 4 Концентрации мочевины в тест-системе, г/л 50 100 150 200 250 300 350 Контрольная нормальная пулированная плазма (К) Время самосборки фибрин-мономера, с 5,9 18,5 26,4 46,4 60,3 Более 120 Более 120 Плазма больного Н., с удлинением времени самосборки фибрин-мономера (Б₁) Время самосборки фибрин-мономера, с 6,3 19,0 34,5 59,2 79,5 Более 120 Более 120 Соотношение времени самосборки фибрин-мономера (K/Б₁), с 0,94 0,97 0,76 0,79 0,76 Не определяется Не определяется Плазма больного Б. с укорочением времени самосборки фибрин-мономера (Б₂) Время самосборки фибрин-мономера, с 5,8 17,1 20,0 35,4 46,0 Более 120 Более 120 Соотношение времени самосборки фибрин-мономера (К/Б₂), с 1,02 1,08 1,32 1,31 1,31 Не определяется Не определяется

Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике. Предложен способ определения времени самосборки фибрин-мономера. Способ может быть использован для исследования крови при нарушениях в системе гемостаза. Он включает определение времени свертывания при использовании тромбина, добавление мочевины в концентрации 180 г/л. В способе используют тромбин активностью 4-6 с. Предлагаемый способ позволяет оценить как замедление, так и ускорение самосборки фибрин-мономера в соответствующих типовых клинических ситуациях. Способ обеспечивает также повышение точности определения времени самосборки фибрин-мономера. 4 табл.

Способ определения времени самосборки фибрин-мономера, включающий определение времени свертывания при использовании тромбина и мочевины, отличающийся тем, что время свертывания оценивают на коагулометре при последовательном смешивании 0,1 мл исследуемой плазмы, 0,05 мл раствора мочевины в концентрации 180 г/л, инкубации при температуре 37°С в течение 1 мин и добавлении 0,05 мл раствора тромбина, активностью 4-6 с или 40-60 NIH/мл.